Summary
Для реального времени обнаружения врожденной иммунной реакции на кожный ранения и инфекции стафилококк мышей описан подход. Путем сравнения LysM-EGFP мышей (которые обладают флуоресцентные нейтрофилов) с LysM-EGFP гибридных иммунодефицитных мыши штамм, мы заранее нашего понимания инфекции и разработки подходов к борьбе с инфекцией.
Abstract
Золотистый стафилококк Инфекции (S. aureus), в том числе метициллин резистентный пятна, являются огромным бременем на систему здравоохранения. С показатели заболеваемости S. aureus инфекции восхождение ежегодно есть спрос на дополнительные исследования в его патогенности. Животные модели инфекционных заболеваний углублению нашего понимания ответа хост возбудителя и привести к развитию эффективной терапии. Нейтрофилы играть главную роль в врожденный иммунный ответ, который управляет инфекции S. aureus , формируя абсцесс стены от инфекции и содействия бактериальных разминирования; количество нейтрофилов, которые проникнуть инфекция кожи S. aureus часто коррелирует с исход заболевания. LysM-EGFP мышей, которые обладают расширенной Зеленый флуоресцентный белок (EGFP) вставлен в регионе промоутер лизоцима М (LysM) (выражается главным образом нейтрофилами), когда используется в сочетании с целом животных в естественных условиях флуоресценции изображений (FLI) обеспечивают средства количественного нейтрофилов эмиграция неинвазивно и продольно в раненых кожи. При сочетании с биолюминесцентных S. aureus штамм и последовательным в естественных условиях весь животных биолюминесцентных изображений (BLI), это возможность продольно контролировать как динамика нейтрофилов найма, так и в естественных условиях бактериальной нагрузки на сайте инфекции в наркотизированных мышей от начала инфекции резолюции или смерти. Мышей более устойчивы к воздействию ряда факторов вирулентности производимые S. aureus , способствующих эффективному колонизации и инфекции в организме человека. Иммунодефицитных мышей предоставляют более чувствительных животных модель для изучения стойких S. aureus инфекций и терапии способность повысить innate иммунных реакций. Здесь мы характеризуют ответы в LysM-EGFP мышей, которые были выведены в MyD88-недостаточным мышей (LysM-EGFP × MyD88- / - мышей) наряду с одичал тип LysM-EGFP мышей расследовать S. aureus кожа раневой инфекции. Многоспектральный одновременного обнаружения включено исследование динамики нейтрофилов набора с помощью в естественных условиях FLI, бактериальной нагрузки с помощью BLI в естественных условиях и ранозаживляющие продольно и неинвазивно со временем.
Introduction
Золотистый стафилококк (S. aureus) приходится большинство инфекции кожи и мягких тканей (ИКМТ) в Соединенных Штатах1. Распространенность метициллин резистентный S. aureus (MRSA) за последние два десятилетия2, мотивации изучения механизмов сохранения и открытия новых стратегий лечения инфекций неуклонно растет. Стандарт медицинской помощи для MRSA инфекций является системной антибактериальной терапии, но MRSA становится все более устойчивыми к антибиотикам за время3 и эти препараты могут уменьшить пользу микрофлора хозяина, вызывая негативных последствий для здоровья, особенно в 4детей. Доклинические исследования изучили альтернативные стратегии для лечения MRSA инфекции5, но перевод этих подходов к клинике оказался сложным из-за появления факторов вирулентности, которые сорвать хост иммунных ответов6. Анализировать динамику хост возбудитель диска S. aureus ИКМТ, мы сочетаем неинвазивной и продольных индикация числа нейтрофилов набранных на раны кровать с кинетической мер бактериальной изобилия и ранение области.
Нейтрофилы являются наиболее распространенными циркулирующих лейкоцитов в организме человека и первый responders бактериальной инфекции7. Нейтрофилы являются необходимым компонентом для эффективного пребывания ответ против инфекции S. aureus вследствие их бактерицидные механизмов, включая производство реактивнооксигенных видов, протеаз, антимикробных пептидов и функциональных реакций включая фагоцитоза и нейтрофилов внеклеточного ловушку производства8,9. Человека пациентов с генетическими дефектами в нейтрофильные функции, такие как хроническая гранулематозная болезнь и Синдром Чедиака-Хигаси, показывают, повышенной восприимчивости к инфекции S. aureus . Кроме того, пациенты с генетическими (например врожденные нейтропении) и приобретенные (например, нейтропения, видели в химиотерапии больных) дефекты в нейтрофильные чисел также очень восприимчивы к инфекции S. aureus 10. Учитывая важность нейтрофилов в очистке инфекции S. aureus , укрепления их иммунной или настройки их число в пределах S. aureus поражения может оказаться эффективной стратегии в решении инфекции.
За последнее десятилетие трансгенных мышей с флуоресцентным нейтрофилов журналистами были разработаны для изучения их людьми11,12. Сочетая нейтрофилов репортер мышей с целом животных методы визуализации позволяет пространственно-временных анализ нейтрофилов в органах и тканях. При сочетании с биолюминесцентных штаммов S. aureus, это позволяет отслеживать накопление нейтрофилов в ответ на S. aureus изобилия и упорство в контексте бактериальной вирулентности факторов, которые прямо и косвенно возмущают нейтрофилов чисел в пораженной ткани13,14,,1516.
Мышей менее подвержены механизмов уклонения вирулентности и иммунной S. aureus , чем люди. Таким образом, мышах одичал типа не может быть идеальной моделью животных для изучения эффективности с учетом терапевтического лечения хронических S. aureus инфекции. MyD88-недостаточным мышей (т.е., MyD88- / - мышей), ослабленным мыши штамм, который не хватает функциональной интерлейкина-1 рецепторов (IL-1R) и Толл подобный рецептор (TLR) сигнализации, шоу подверженности заражению S. aureus , по сравнению с мышах одичал тип17 и ухудшение оборота нейтрофилов к сайту S. aureus инфекции кожи18. Разработка мыши штамм, который обладает репортером флуоресцентный нейтрофилов в MyD88- / - мышей предоставляет альтернативную модель для исследования эффективности терапии для лечения инфекции S. aureus , по сравнению с текущей нейтрофилов Репортер мышей.
В этом протоколе мы характеризуют инфекции Стафилококк золотистый в ослабленным мышей- / - × MyD88 LysM-EGFP и сравнить время курс и резолюции инфекции с LysM-EGFP мышей. LysM-EGFP × MyD88 мышей- / - развитие хронической инфекции, которые не удалось решить, и 75% поддаваться инфекции после 8 дней. Значительный дефект в первоначальном наборе нейтрофилов происходит более 72 ч воспалительной стадии инфекции, и 50% меньшее количество нейтрофилов набирать на последней стадии инфекции. Повышенная восприимчивость × LysM-EGFP, MyD88- / - мышей делает это особое напряжение строгий доклинических модель для оценки эффективности новых терапевтических методов таргетинга инфекции S. aureus , по сравнению с текущей модели Используйте мышь одичал типа, особенно техники, стремясь повысить врожденный иммунный ответ против инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши исследования были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом на UC Дэвис и были выполнены в соответствии с руководящими принципами закона расширение исследований здоровья и Закон о благосостоянии животных. Убедитесь в том использовать стерильные перчатки при работе с животными.
1. мышь источник и жилищного строительства
- Производные LysM-eGFP мышей на фоне генетических C57BL/6J как описано ранее12. Производные LysM-EGFP × MyD88- / - мышей путем скрещивания LysM-EGFP мышей с MyD88- / - мышей на фоне C57BL/6J.
- Дом мышей в виварий. Для этих исследований животные были размещены в университете Калифорнии, Дэвис в группах до одного размещены следующие хирургии и хирургии. Используйте мышь в возрасте 10-16 недель.
2. бактериальные подготовка и количественная оценка
- Удаление биолюминесцентных штамма S. aureus интереса от-80 ° C для хранения таять на льду. Полоска на плите говядины крови агар 5%. Инкубируйте прожилками пластины в увлажненные инкубатора при 37 ° C ночь (16 ч).
Примечание: В настоящем Протоколе, был использован штамм ALC2906 SH1000. Этот штамм содержит плазмиду pSK236 Трансфер с промоутером пенициллин связывая протеин 2, сливается с кассеты репортер luxABCDE от Photohabdus luminescens18. - Подготовка tryptic соевый бульон (TSB) путем смешивания 0,03 г порошка TSB мл чистой воды и автоклав TSB стерилизовать. Когда остынет, добавьте любые необходимые антибиотики, используя стерильную методику. В этом протоколе добавьте 10 мкг/мл хлорамфеникол18 TSB выбрать для выражения плазмида pSK236 трансфер, который содержит кассеты luxABCDE биолюминесценции.
- Выберите 3-4 отдельными колониями от S. aureus пластины в БСЭ с 10 мкг/мл хлорамфеникол начать ночь культуры. Инкубируйте бактерий на инкубирования шейкер при 37 ° C ночь (16 ч).
- Начало новой бактериальной культуры от ночи культуры путем разбавления образца 1:50 в БСЭ с хлорамфеникола 10 мкг/мл. Культура в инкубирования шейкер на 200 об/мин и 37 ° C.
- Два часа после разделения S. aureus, контроля оптической плотности на 600 Нм (OD600) на спектрофотометре. Наблюдать за ОД600 против время найти середине логарифмической фазы роста. Для ALC2906 SH1000 штамма ОД600 0.5 середине логарифмических и соответствует концентрации 1 x 108 кое/мл (рис. 1).
- Когда ОД600 0,5, промойте бактерий 1:1 с ледяной DPBS. Центрифуга для бактерий для 10 мин на 3000 x g и 4 ° C. Тщательно сцеживаться супернатант и добавить дополнительные охлажденной DPBS и вихревой тщательно. Центрифуга еще раз за 10 мин на 3000 x g и 4 ° C.
- Осторожно декантируют супернатант. Ресуспензируйте бактериальных Пелле в нужной концентрации. Для этих исследований сбор 3 мл ALC2906 SH1000 и Ресуспензируйте в 1,5 мл PBS, соотнося к концентрации бактерий около 2 x 108 кое/мл. Держите бактерии на льду до использования.
- Чтобы проверить концентрация бактерий, разбавляют 100 мкл мэм бактериальных образца и картирование в PBS. Тарелка 20 мкл аликвоты на плите агар. Инкубировать при 37 ° C в увлажненные инкубатор для 16 h. количество CFUs валовой экзамен и рассчитать бактериальных концентратов следующий день.
3. эксцизионная кожи Wounding и прививка с S. aureus
- Управлять 100 мкл бупренорфина гидрохлорида 0,03 мг/мл (~0.2 мг/кг) для каждой мыши через внутрибрюшинной инъекции.
- Двадцать минут после инъекции, место 2-4 мышей в камере с 2-3 л кислорода с 2-4% изофлюрановая. Как только мышей полностью наркоз, передача мышей, один момент для носовой конус подключены к 2-3 л кислорода с 2-4% изофлюрановая. Убедитесь, что мышь полностью под наркозом, твердо щипать каждый задние лапы между большим и указательным пальцами. Если животное не реагирует на крайнем случае перейдите к следующему шагу.
- Бритье 1 дюйм секцией 2 дюйма на задней части мыши с Электрические ножницы и очистить область меха вырезки с помощью чистых протрите или марлей. Избегайте использования депиляционный крем, потому что это может вызвать избыточное воспаление.
- Очистите от задней части мыши сначала с 10% повидон йод смоченную марлю и затем с 70% этанол смоченной марлей. Чистота области в спирали, перемещение наружу от центра области хирургического. Подождите примерно 1 мин для хирургического области высохнуть до операции.
-
Держите бритая сзади мыши свободно между двумя пальцами и твердо нажмите биопсии удар стерильным 6 мм в центре области подготовленных хирургического. Не тяните кожу подтянутой.
- Твист удар биопсии для создания круговой контур на коже, полностью проходит через кожу в по крайней мере один раздел набросков. Будьте осторожны, чтобы не нарезать базовой фасции или ткани.
- Используйте стерильные ножницы, щипцы для прорезать эпидермиса и дермы круговой схеме, запечатленный удар биопсии.
4. S. стафилококк прививка
- Заполните 28 G инсулина шприц с желаемой биолюминесцентных бактериальных отливках. В этом исследовании, применять в концентрации 1 x 108 кое/мл (50 мкл). Не управлять более чем 100 мкл тома.
-
Придать 50 мкл отливках между фасции и ткани в центре раны на задней части мыши. Убедитесь, что модификатор образует пузырь в центре раны с минимальной утечки или рассеяния.
- Вытяните дермы в сторону, возьмите шприц почти параллельно в ткани и медленно толкать шприц в ткани, пока не почувствовал резкое снижение сопротивления, который указывает пирсинг фасции. Тщательно вести шприц в центре раны и обойтись отливках медленно. Медленно снимите шприц из животного.
- Придать такой же объем стерильных PBS в раны неинфицированных животных, как описано выше.
- Вернуть животное к своей клетке. Поместить клетку под тепла лампы или поверх грелку и контролировать животное до выздоровления от анестезии.
5. в Vivo BLI и FLI
- Инициализируйте весь животных томографа через инструмент программного обеспечения. Анестезировать мышей в камере получать 2-3 л кислорода с 2-4% изофлюрановая. Доставить анестезии nosecones внутри томографа.
-
Поместите мышь раненых и инфицированных в томографа. Поместите указатель мыши таким образом, что раны как плоский как можно скорее. Используйте следующие настройки последовательности изображений мышей.
- Выберите режим визуализации люминесценции и сфотографировать . Выдержка — 1 мин на небольших биннинга и F/stop 1 (люминесценции) и F/стоп 8 (фотография). Фильтр выбросов является открытым. Нажмите кнопку получить для записи образа.
- Выберите режим визуализации флуоресценции и сфотографировать . Время экспозиции-1 s на небольших биннинга и F/stop 1 (флуоресценции) и F/стоп 8 (фотография) Длина волны возбуждения 465/30 Нм и длиной волны 520/20 Нм выбросов с Лампа высокая интенсивность. Нажмите кнопку получить для записи образа.
- Вернуть животное его клетке и монитор до выздоровления от анестезии.
- Изображения мышей ежедневно, как описано выше.
6. анализ
- Открытые изображения поддаются количественной оценке.
- Место большой круговой области интереса (ROI) над районом всю рану, включая окружающие кожи для каждой мыши на изображении. Нейтрофилов в естественных условиях FLI EGFP сигналов и сигналов в естественных условиях BLI S. aureus выходят за пределы края раны после нескольких дней и были включены в эти исследования (рис. 2A и 2B). Нажмите кнопку Мера ROI и записи значения для средней потока для каждой мыши. Участок средний поток времени против каждого сигнала (p/s).
-
Если абсолютное число нейтрофилов или Стафилококк золотистый в рану, выполните следующие эксперименты.
- Соотнести нейтрофилов чисел в естественных условиях сигналы FLI EGFP, ранение мышей C57BL/6J как описано выше и передавать широкий спектр костного мозга, полученных нейтрофилов (5 x 105 до 1 x 10-7) LysM-EGFP или LysM-EGFPxMyD88- / - доноров непосредственно на вершине различные раны. Изображение как описано выше и соотносятся в естественных условиях EGFP FLI сигналов на известное количество нейтрофилов.
- Чтобы сопоставить S. aureus кое в естественных условиях BLI сигналы, раны и заразить мышей, как описано выше. На 1 день после инфекции записи в естественных условиях BLI сигналы от мышей и немедленно усыпить и холод туши. Акцизный рану, гомогенизировать ткани и тарелка бактериальных разведений на агар для ночи инкубации. На следующий день, количество колоний для определения кое на рану.
- Для измерения раны исцеления подходят круговой ROI над краем раны и мера области раны (2см) и сюжет дробных переход от базовых против времени (рис. 2 c).
7. Статистика
Примечание: Все данные представлены как средние ±SEM. считались статистически значимыми p < 0,05
- Определить различия между двумя группами на один день с использованием метода Holm-Sidak, альфа = 0,05 и анализировать каждый момент индивидуально, не предполагая последовательно SD.
- Сравните различия между несколькими группами в тот же день, односторонний дисперсионный анализ с нескольких сравнений posttest Тьюки. Выживание между экспериментальной группами была проанализирована методом Mantel-Кокс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LysM-EGFP × MyD88- / - мышей более восприимчивы к инфекции S. aureus , чем LysM-EGFP мышей
Штамма S. aureus , используемые в данном исследовании, ALC290618, был построен с плазмида, содержащий люкс конструкцию, которая производит биолюминесцентных сигналы от живой и активно метаболизма бактерий. Когда прививку в мышей, в естественных условиях биолюминесценции (BLI) методы визуализации может использоваться для продольно измерения бремени бактерий внутри инфицированная рана. LysM-EGFP × MyD88- / - мышей и LysM-EGFP мышей были ранены и инфицированных 1 x 107 кое S. aureus в рану, чтобы сравнить их восприимчивость к инфекции S. aureus . LysM-EGFP × MyD88- / - мышей показало большую восприимчивость к инфекции, чем LysM-EGFP мышей продемонстрировано 80% летальность LysM-EGFP × MyD88- / - мышей за первые 8 дней по сравнению с 0% летальность LysM-EGFP мышей в течение инфекции всего 15-дневная продолжительность эксперимента (рис. 3A). Обе штаммов мышей потерял ~ 5% массы тела после инфицирования, но LysM-EGFP мышей восстановленные оригинальные вес 2 день, в то время как LysM-EGFP × MyD88- / - мышей не восстановить потеряли вес (рис. 3B). Закрытие раны при наличии инфекции S. aureus не отличается между двумя штаммами; Однако среду раненых LysM-EGFP × MyD88- / - имел значительный дефект в заживлении ран, по сравнению с LysM-EGFP мышей (рис. 3 c), как сообщалось ранее,19. Всего изображений животных был использован для измерения бактериальных бремя ежедневно, и уже в день 1, LysM-EGFP × MyD88- / - раны были выше бактериальных бремя, чем LysM-EGFP раны. LysM-EGFP мышей управляемые инфекции и уменьшилось в естественных условиях BLI сигналов в рану, а LysM-EGFP × MyD88- / - мышей выставлены увеличение бактериальных бремя, что перестала расти на 4 день до смерти животного (Рисунок 3D,E). Вместе эти данные свидетельствуют о повышенной восприимчивости LysM-EGFP × MyD88- / - мышей заражению S. aureus , по сравнению с LysM-EGFP мышей.
Нейтрофильные людьми с нарушениями зрения в S. aureus инфицированных мышей- / - LysM-EGFP × MyD88, по сравнению с LysM-EGFP мышей
LysM-EGFP мыши производит Зеленый флуоресцентный нейтрофилов благодаря EGFP белков закодированы течению лизоцима М промоутер12. Эта мышь была использована для изучения продольной в естественных условиях нейтрофилов торговли в ответ на кожный S. aureus инфекции13,14,20,21,22. Для сравнения нейтрофилов кинетика раны, производится на LysM-EGFP × MyD88- / - мышей и LysM-EGFP, раны кожи полная толщина 6 мм осуществляется на спинке, и мышей были образы ежедневно. 40% снижение оборота нейтрофилов раны наблюдалась в LysM-EGFP × MyD88- / - по сравнению с LysM-EGFP мышей (рис. 4A, C). Когда сразу после ранения был введен 1 x 107 кое S. aureus , нейтрофильные людьми было ослаблять в обоих штаммов мышей, но LysM-EGFP × MyD88- / - мышей были более чувствительны к инфекции S. aureus с что касается нейтрофилов набора. Инфекции, вызванной 50% уменьшение первоначальной нейтрофилов, людьми LysM-EGFP × MyD88- / - раны по сравнению с 15%, отмеченное в LysM-EGFP раны (Рисунок 4B). LysM-EGFP мышей также набраны значительно больше нейтрофилов в рану на более поздних стадиях инфекции (рис. 4A,C), по сравнению с LysM-EGFP × MyD88- / - мышей, которые не смогли увеличить число нейтрофилов даже в наличие постоянной бактериальной нагрузки. Вместе эти данные показывают, что LysM-EGFP × MyD88- / - мышей имеют дефект в нейтрофильные набора, который согласуется с их повышенной восприимчивости к инфекции S. aureus .
Рисунок 1: Корреляция между ОД600 и КФУ подсчитывает для ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 колонии были выбрали из агар пластины и переведены в БСЭ с 10 мкг/мл хлорамфеникол ночь культуры. На следующий день, подвеска была разделить 1:50 на TSB с 10 мкг/мл хлорамфеникола и культивировали. Оптическая плотность при 600 Нм (600OD) был измерен в регулярные промежутки времени после 2 часов, используя спектрофотометр. При каждом измерении бактерий был разбавленным картирование в ледяной PBS и aliquoted на агаре пластину для ночи инкубации. CFUs были подсчитаны следующий день для расчета начальной концентрации и коррелирует с ОД600. N = 3 с 4 различных измерений600 ОД в эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель область интересов (ROI) для анализа данных. Для анализа в естественных условиях BLI и в естественных условиях FLI сигналов, большие, эквивалентного размера трансформирования были сосредоточены на рану и измерялась всего потока (фотоны в секунду). Чтобы измерить закрытия РАН, ROI был подходят для края раны и была измерена площадь (2см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: LysM-EGFP × MyD88 мышей- / - более восприимчивы к инфекции S. aureus , по сравнению с LysM-EGFP мышей. LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей были ведении 6 мм намотанной на спинке и инфицированы 1 x 107 кое биолюминесцентных S. aureus или стерильного физиологического раствора. Животные были контролироваться ежедневно и выживания (A) и (B) вес были записаны. Животные были образы ежедневно на размер раны мера (C) и (D) бактериальной люминесценции. (E) представитель биолюминесцентных образы изображены от зараженных LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей. Шкалы бар = 3 мм. данные представляют собой 7-16 мышей на группу для A, C, и D и 3 мышей за группы B и выражаются как среднее ±SEM. * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 между инфицированных (A, B, < / C18 > и D) или (C) групп неинфицированных. Статистическая значимость определялась с помощью теста Mantel-Кокс (A) и метод Holm-Sidak (B-D), альфа = 0,05 и каждый раз точка была проанализирована индивидуально, не предполагая последовательно SD. пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть больше версия этой фигуры.
Рисунок 4: LysM-EGFP × MyD88- / - мышей имеют дефектного нейтрофилов набора для инфицированных ран.
LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей были ведении 6 мм намотанной на спинке и инфицированы 1 x 107 кое биолюминесцентных S. aureus или стерильного физиологического раствора. Животные были образы ежедневно измерять содержание нейтрофилов (A, B). (C) представитель флуоресцентного изображения изображены от инфицированных и неинфицированных LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей. Шкалы бар = 5 мм. данные представляют собой 8-16 мыши на группу и выражаются как среднее ±SEM. * p < 0,05, ** p < 0.01, и *** p < 0,001 между инфицированных группы и # p < 0.01 между неинфицированных групп (A) или как изображенные на графике (B). Статистическая значимость был определен с помощью метода Holm-Sidak (A), альфа = 0,05 и каждый раз точка была проанализирована индивидуально, не предполагая последовательно SD и односторонний дисперсионный анализ (B), с несколькими Тьюки-сравнения После тестирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. aureus инфекции модели, которые используют биолюминесцентных S. aureus инфекции в флуоресцентные нейтрофилов репортер мыши в сочетании с передовыми методами всего животных в естественных условиях оптических изображений выдвинули наши знания о врожденной иммунного ответа на инфекцию. Предыдущие исследования, с помощью мыши LysM-EGFP показали, что до до 1 x 107 нейтрофилов рекрута до S. aureus инфицированная рана в течение первых 24 ч инфекции14и Рана набраны нейтрофилов расширить их полураспада от 1,5 дней до 5 дней в ответ на S. aureus-инфицированные раны22. Тактика выживания адаптированы мышей для борьбы с инфекцией является торговля гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) для инфицированная рана из костного мозга, где они расширить в бактерицидной EGFP+ нейтрофилов в TLR2/MyD88/PGE2 21зависимым образом. Кроме того интрамедуллярный granulopoiesis обеспечивает важным источником нейтрофилов спасти S. aureus инфицированных MyD88- / - мышей от смертоносного сепсиса13. Приемных передачи HSPC от LysM-EGFP мышей в мышей дикого типа делает возможным рассмотреть процесс производства местных нейтрофилов и его важность в борьбе с S. aureus в рану13,21. Это также возможно для калибровки именно количество нейтрофилов в рану; число нейтрофилов в раны коррелирует линейно с EGFP сигнал от 1 x 10-6 больше, чем 1 x 10-7 нейтрофилов, и предел обнаружения составляет около 1 х 106 нейтрофилы в рану 6 мм14.
В наш представитель результаты мы сравниваем продольной нейтрофилов и S. aureus кинетики в раны LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / -. Насколько нам известно это это первое исследование, сравнивающее бактериальной нагрузки и нейтрофилов, торговля между дикого типа и ослабленным мышей продольно через резолюции инфекции. Особый интерес представляет степень затухания нейтрофилов набора, вызванных инфекции Стафилококк золотистый в MyD88- / - штамм, который вызвал 15% сокращение оборота нейтрофилов мышей дикого типа по сравнению с 50% снижение в MyD88-/ -. S. aureus возможность уклониться от хозяина иммунный ответ, производя ряд факторов вирулентности, знаны, что косвенно препятствуют нейтрофилов людьми (т.е., α-токсин, Пантон-Валентина лейкоцидин и хемотаксис ингибирующее белка23 , 24), и наши результаты показывают, что MyD88 сигнализации, вероятно через TLR2, TLR4 и IL-1R, имеет решающее значение для преодоления стратегий S. aureus уклониться от принимающей иммунных реакций. Вирулентность фактор нокаут S. aureus штаммов может использоваться в этой модели характеризовать их влияние на миелоидных клеток людьми13. Кроме того когда учился в сочетании с LysM-EGFP × MyD88- / - мыши, эта модель подчеркивается роль MyD88 сигнализации в борьбе против патогенного воздействия факторов вирулентности.
Есть несколько важных шагов в настоящем Протоколе, если выполняется неправильно может привнести исследований изменчивости. Ранения и инфекции процедуры просты по сравнению с другими моделями болезни мыши, но это не без его сложностях. Биопсия кожи удар очень острые и могут легко нарезать spinotrapezius мышц под кожей. Ущерб этой мышцы и его фасции изменяет нейтрофилов вербовки и увеличивает изменчивость между мышами и результаты в более инвазивных инфекции S. aureus , которая не располагается в рану. Мышей с значительный ущерб spinotrapezius мышцы должны быть исключены из исследования.
Еще одним источником ошибки в этой модели приходит от изменений в биолюминесцентных штамма S. aureus с течением времени, которое можно изменить в естественных условиях BLI сигналов и Кинетика роста. Штамм ALC2906 содержит плазмиду трансфер, содержащий измененный люкс Оперон от Photorhabdus luminescens конструкцию, которая требуется для получения биолюминесцентных сигналов, которые могут быть отвергнуты бактерии S. aureus более25раз. В культуре бульон без отбора 97% SH1000 колоний производства биолюминесцентных сигналы на 3 день. Эта частота упала до 53% в день 5 и 21% на 10 день26. Таким образом, в позднее время точках в ходе инфекционных, в естественных условиях сигналы BLI скорее всего начнет слегка (< 1 журнала разница) недооценивать бактериальных бремя фактических в естественных условиях . Это важно для замораживания вниз свежие глицерин запасы S. aureus с антибиотиком выбора для поддержания плазмида по прибытии и часто замена рабочих запасов бактерий (т.е., каждые три месяца) может помочь предотвратить потери биолюминесцентных конструкции во время культуры обслуживания. Новые штаммы биолюминесцентных S. aureus содержат стабильно интегрированной биолюминесцентных конструкции27,28 и скорее всего улучшение над ALC2906 штамма, используется в этой модели.
Хотя эта модель полезна для изучения локализованных дермального S. aureus инфекции, она имеет ограничения. В естественных условиях BLI сигналы бактериальной нагрузки ограничивается раневой и прилегающая к нему кожица. Модель не обеспечивает надежный индикация для глубоких инвазивных инфекций, таких как сепсис, и животные должны быть euthanized измерить распространение бактерий в крови или почки13. Были созданы новые и яркие инженерии биолюминесцентных штаммов, может разрешить обнаружение в естественных условиях BLI сигналов от внутренних органов27,28. Кроме того, в других не может измеряться продольной обнаружения и контроля оборота нейтрофилов часто инфекций S. aureus , включая респираторные и кровь инфекции. Пониженную чувствительность благодаря ткани аутофлюоресценция также является ограничение этой модели. Недавно разработанные Catchup мышь использует ППП TdTomato под Ly6G промоутер и может выше соотношение сигнал-шум чем LysM-EGFP мыши из-за сократили ткани auto флуоресценции в ППП канал11.
Потенциальных помех между в естественных условиях BLI и FLI выбросов сигналов в этой модели достоин обсуждения, но незначительно. Если мы проводим эксперименты без света возбуждения и собирать только в естественных условиях FLI EGFP сигналы, с помощью фильтра 520/20, мы не наблюдаем каких-либо заметных сигналы от зараженных мышей, продемонстрировать, что собранные сигналы от в естественных условиях FLI EGFP сигналов, а не от перекрытие сигналов в естественных условиях BLI бактерий (данные не показаны). Это главным образом обусловлено коллекции времени сигнала, который является только в 1 секунду в естественных условиях FLI и 1 минуту для в-vivo BLI и конкретных возбуждения волны фильтр 465/30 Нм и выбросов фильтра 520/20 Нм. Эти параметры позволяют для оптимального обнаружения в естественных условиях FLI EGFP сигналов без вклада в естественных условиях BLI сигналов. Лучше всего это проявляется при сравнении порядок оси y между 3D рисунок и Рисунок 4A. Сигналы от в естественных условиях BLI около 100 раз меньше, чем в естественных условиях сигналы FLI EGFP, указав, что в естественных условиях BLI сигналы являются незначительными и вносить менее чем 1% сигналов из FLI в естественных условиях.
Мы ожидаем, что будущие приложения этой модели поможет исследователи обнаружить и характеризуют Факторы вирулентности S. aureus и служить образцом доклинические животных для тестирования Роман терапии, которые направлены, чтобы очистить инфекции S. aureus , повышая Врожденный иммунный ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ллойд S. Миллер получил грантовую поддержку от визуальной, Pfizer, Regeneron, Чан Сун-Шионг Nanthealth фонд и консалтинговые услуги от применения инновационных технологий биотерапевтических Noveome и Чан Сун-Шионг Nanthealth фонд, которые не имеют отношения к работе в этой статье. Другие авторы имеют ничего не разглашать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальными институтами из здравоохранения грантов R01 AI129302 (чтобы S.I.S.) и программу обучения в области фармакологии: от скамьи в постели на UC Дэвис (низ T32 GM099608 до L.S.A). Молекулярная и геномных Imaging (CMGI) на университета Калифорнии Дэвис условии превосходно технологическую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
