CH
DEImmunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Мыши модель для оценки врожденный иммунный ответ инфекции стафилококк
Summary February 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Для реального времени обнаружения врожденной иммунной реакции на кожный ранения и инфекции стафилококк мышей описан подход. Путем сравнения LysM-EGFP мышей (которые обладают флуоресцентные нейтрофилов) с LysM-EGFP гибридных иммунодефицитных мыши штамм, мы заранее нашего понимания инфекции и разработки подходов к борьбе с инфекцией.
Transcript
Методы, которые контролируют бремя бактерий и нейтрофил реагировать одновременно может обеспечить понимание механизмов стойкости золотистого стафилококка и эффективность стратегий лечения. Основным преимуществом этого метода является то, что несколько параметров могут быть измерены продольно в живом хозяине на протяжении всей инфекции. Очень важно показать, где разместить рану на мышеловку, как подакцизировать кожу, и как привить рану золотом стафилококка.
Начните с оттаивания биолюминесценции золотистого стафилококка штамм интереса от отрицательных 80 градусов по Цельсию хранения на льду. Перед полосами культуры на 5%бычьей крови агар пластины. Для ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию.
На следующее утро перенесите три-четыре отдельные колонии из тарелки золотистого стафилококка в триптический соевый бульон, или TSB. Дополняется 10 микрограммами на миллилитр хлорамфеникол для ночного встряхивания инкубации при 37 градусах по Цельсию. На следующее утро разбавляют 120 микролитров образца культуры в шести миллилитров TSB.
С 10 микрограммами на миллилитр хлорамфеникол, в течение двух часов инкубации при 37 градусах по Цельсию и 200 вращений в минуту. Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигает 0,5, перенесите три миллилитров бактериальной суспензии в 10 миллилитров ледяного DPBS. После тщательного декантирования супернатанта, добавить дополнительные охлажденные DPBS к грануле, и вихрь повторно приостановленных бактерий тщательно.
После второй центрифугации, повторно приостановить бактериальные гранулы в 1,5 миллилитров PBS на льду. Для проверки концентрации бактерий, последовательно разбавляют 100 микролитров бактериальной суспензии в 1 х 10 до 4, и 1 х 10 до 5, в свежем PBS. И пластины 20 микролитров каждого разбавления на отдельных агарных пластинах.
После ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию подсчитайте количество колонийообразующих единиц путем валового обследования для расчета бактериальной концентрации по отношению к предыдущему дню. Для excisional кожи ранив животных-реципиентов, подтвердить отсутствие реакции на щепотку ноша, прежде чем бритье один на два дюйма раздел на задней части мыши. Аккуратно протрите, чтобы удалить любые бродячие волосы.
И дезинфицировать открытые кожи, с последовательными 10%povidone йода, и 70% этанола пропитанной марли приложений. Перемещение наружу из центра хирургической области, по спиральной схеме. После того, как кожа высохнет в течение одной минуты, твердо нажмите стерильные шесть миллиметров пунш биопсии в центре подготовленной хирургической области.
Твист пунш биопсии, чтобы создать круговой контур на коже, что полностью прорезает ткани кожи, и по крайней мере один раздел контура. Забота, чтобы не нарезать в основной фасции или ткани. Затем используйте стерильные ножницы и типсы, чтобы прорезать эпидермис и дерму, следуя круговой схеме, запечатленной биопсией пунша.
Для прививки золотистого стафилококка заполните 28-м калибровочным инсулиновым шприцем с 50 микролитров подготовленного биолюминесцентного бактериального инокуланта. И используйте палец, чтобы вытащить дерму раненого животного в сторону. Удерживая шприц почти параллельно ткани, медленно вставьте шприц в ткань до тех пор, пока не будет ощущаться внезапное снижение резистентности.
Указывает на пирсинг фасции. С иглой, помещенной в центр раны, медленно доставить весь объем инокулента. Подтвердите, что инокулент образует пузырь в центре раны, с минимальной утечкой или дисперсией.
И медленно снимите шприц с животного. Затем верните животное в клетку с теплом и мониторингом до полного выздоровления. После раны и инфекции, и ежедневно во время эксперимента, поместите анестезировализованную мышь в биолюминесцентных и флоресца изображения, с раной как можно более плоским.
В программном обеспечении изображения выберите люминесценцию и фотографию в качестве режимов визуализации. Время экспозиции должно быть задано до одной минуты при небольшом биннинге, F/Stop 1 для люминесценции, F/Stop 8 для фотографии и открыто для фильтра выбросов. Затем нажмите приобрести, чтобы записать изображение.
Для визуализации флуоресценции in vivo выберите флуоресценцию и фотографию в качестве режимов визуализации. Время экспозиции должно быть задано до одной секунды при небольшом биннинге, F/Stop 1 для флуоресценции, F/Stop 8 для фотографии, и Возбуждение и Выброс длин волн 465 более 30 нанометров, и 520 более 20 нанометров, с высокой интенсивностью лампы, соответственно. Затем нажмите приобрести, чтобы записать изображение.
После получения обоих наборов изображений, вернуть животное в клетку, с мониторингом, до полного выздоровления. Для анализа изображений откройте изображение для количественной оценки в соответствующей программе анализа изображений и поместите круговую область интереса по умолчанию по всей области раны, включая окружающую кожу. Нажмите измерить область интереса, и записывать значения для среднего потока для раны, чтобы средний поток каждого сигнала, которые будут построены по сравнению со временем.
Для измерения заживления раны, подходят круговой области интереса над краем раны, и измерить площадь раны в сантиметрах в квадрате, чтобы заговор дробных изменения от базового по сравнению со временем. В этом репрезентативном эксперименте, условное выражение EGFP миелоидной дифференциации первичного ответа 88, или MyD88 нокаут мышей, продемонстрировали большую восприимчивость к прививке золотистого стафилококка, чем сделал неусловный EGFP выражения животных. При 80%летальности наблюдается в течение первых восьми дней инфекции.
Оба штамма мышей потеряли около 5% веса тела сразу после заражения. Тем не менее, условный EGFP выражая мышей восстановили свои первоначальные веса на второй день. В то время как myD88 мышей нет.
Закрытие раны в присутствии инфекции золотистого стафилококка не отличалось между двумя штаммами. Тем не менее, стерильно ранены MyD88 нокаутом мышей, был значительный дефект в заживлении ран, по сравнению с условными EGFP выражения животных. Целая визуализация животных выявила более высокую бактериальную нагрузку, о чем свидетельствует повышенный биолюминесцентный сигнал в ранах нокаутирующих животных MyD88, по сравнению с условным EGFP, выражают животных.
40%снижение первоначального оборота нейтрофилов для неинфицированных ран MyD88 нокаут животных, также наблюдается по сравнению с условным EGFP выражения животных. Когда 1 х 10 до 7-й колонии формирования единиц стафилококка золотия были введены сразу после ранения, нейтрофил торговли был значительно затуманен в нокаут животных по сравнению с условным EGFP выражения животных. Прежде чем обойтись без бактерий, убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха, и что расположение иглы правильно расположено в центре раны.
Ткани животных могут быть собраны в конечной точке для измерения экспрессии белков, представляющих интерес и бактериального распространения из раны. Золота стафилококка заразна для человека. Таким образом, средства индивидуальной защиты следует носить при обращении с бактериями, и осторожность должна проявляться, при обработке шприца, содержащего патоген.
Этот метод помог изучить использование биологических методов лечения стафилококковых инфекций золотистого происхождения, которые повышают хозяев врожденный иммунный ответ против инфекции.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
