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एक बेहतर और उच्च प्रवाह श्वसन Syncytial वायरस (RSV) माइक्रो बेअसर परख

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59025
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2,4, 1,2
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

Summary

इस अध्ययन के एक उच्च प्रवाह का वर्णन, इमेजिंग आधारित माइक्रो बेअसर परख श्वसन syncytial वायरस (RSV) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी को बेअसर करने के titer निर्धारित करने के लिए. इस परख प्रारूप अलग नमूना प्रकार पर परीक्षण किया गया है ।

Abstract

श्वसन syncytial वायरस विशेष बेअसर एंटीबॉडी (RSV नबस) RSV के खिलाफ सुरक्षा का एक महत्वपूर्ण मार्कर हैं । विभिंन परख प्रारूपों के एक नंबर वर्तमान में दुनिया भर में उपयोग कर रहे है तो वहां एक सटीक और उच्च RSV नबस मापने के लिए प्रवाह विधि के लिए एक की जरूरत है । हम यहां का वर्णन एक इमेजिंग आधारित माइक्रो बेअसर परख कि RSV उपसमूह ए पर परीक्षण किया गया है और भी RSV उपसमूह बी और विभिंन प्रकार के नमूने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस विधि उच्च reproducible है, अंतर के साथ-परख आनटिसम संदर्भ के लिए रूपांतरों से कम 10% जा रहा है । हमारा मानना है कि इस परख आसानी से कई प्रयोगशालाओं में अपेक्षाकृत कम लागत पर स्थापित किया जा सकता है । एक सुधार, उच्च प्रवाह परख कि उपायों RSV नबस के विकास के लिए अंतरराष्ट्रीय स्तर पर इस पद्धति के मानकीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भविष्य में उपंयास RSV वैक्सीन उंमीदवारों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण जा रहा है ।

Introduction

श्वसन syncytial वायरस (RSV) बाल चिकित्सा आबादी में कम श्वसन तंत्र के संक्रमण का प्रमुख कारण दुनिया भर में1है । इसके ऊंचे बोझ के बावजूद अभी भी कोई वैक्सीन या उपचार उपलब्ध नहीं है । २०१३ के बाद से, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) एक प्रमुख अनुसंधान प्राथमिकता के रूप में RSV वैक्सीन विकास की घोषणा की है, वार्षिक जो बैठक2,3परामर्श के साथ । जो RSV बेअसर एंटीबॉडी (नब) माप वैक्सीन immunogenicity की निगरानी के प्रयोग पर सहमत हो गया है, के रूप में यह4संरक्षण के प्रमुख सीरम वैज्ञानिक मार्कर के रूप में मांयता प्राप्त है । नबस को अध्ययन की एक संख्या में गंभीर RSV संक्रमण के खिलाफ की रक्षा के साथ ही विरोधी के नैदानिक परीक्षण RSV मोनोक्लोनल एंटीबॉडी palivizumab, वर्तमान में केवल नियत्रंण रणनीति उपलब्ध4दिखाया गया है ।

वहां एकाधिक नब परख दुनिया भर में प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया प्रारूपों, सेल सहित आधारित है और आणविक आधारित परख, जो मानकीकरण प्रयास5,6,7,8चुनौतीपूर्ण बना दिया है । हालांकि, पारंपरिक पट्टिका कमी बेअसर (PRN) परख है कि एक RSV-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति के द्वारा कम पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU) की संख्या उपायों अभी भी सोने के मानक9रहता है । यहां, हम रिपोर्ट एक सुधार, सरलीकृत, और उच्च प्रवाह PRN प्रोटोकॉल है कि कई सेल लाइनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है, अलग RSV उपभेदों के लिए और वृद्धि की परख प्रवाह के साथ । इस प्रोटोकॉल विभिन्न सेटिंग्स से नैदानिक नमूनों का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से पशु मॉडल प्रयोगों से नमूनों पर परीक्षण किया गया है.

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Protocol

नोट: सभी कदम के लिए एक BSL2 हूड में प्रदर्शन किया जब तक अलग से कहा है । वायरल अनुमापन एक PRN परख के अग्रिम में आवश्यक है इष्टतम RSV PRN परख में इस्तेमाल एकाग्रता का निर्धारण । यह एक छोटी सी मात्रा है कि एक बार गल जाएगा और प्रत्येक पकड़ने परख के लिए इस्तेमाल में वायरस शेयरों aliquot की सिफारिश की है । सभी को पकड़ने परख एक अध्ययन से सभी नमूनों के लिए प्रदर्शन के लिए एक ही वायरल स्टॉक का प्रयोग भी सिफारिश की है । सुनिश्चित करें कि संस्कृति मीडिया और फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) सेल प्लेटों को जोड़ने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म है ।

1. RSV वायरल अनुमापन

नोट: वायरस शेयरों की संख्या और डुप्लिकेट की संख्या के आधार पर, परख थाली चित्र 1के अनुसार स्थापित किया जा सकता है । प्रत्येक वायरस स्टॉक तपसिल में परख प्लेट नीचे titrated होना चाहिए, सबसे अधिक वायरल एकाग्रता (यानी, 1:10) से शुरू । धारावाहिक titrations आम तौर पर 1:10 हो सकता है । A549 सेल संस्कृति और रखरखाव के साथ ही RSV संस्कृति प्रक्रिया मानक प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाता है और इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं ।

  1. सीडिंग प्लेट्स (Day 1)
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल्स माध्यम (DMEM) में A549 कोशिकाओं resuspend + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) + १००० IU पेनिसिलिन/streptomycin (कलम/strep) पर 4 x 105/mL. बीज ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे बाँझ प्लेट १०० μL के साथ/अच्छी तरह से युक्त 4 x 104 A459 कोशिकाओं ।
    2. ३७ ° c, 5% सह2 पर रात भर प्लेटें (कोशिकाओं को लॉग-चरण के विकास में होगा) ।
      नोट: 23 मार्ग के बाद नई A549 सेल शीशी का प्रयोग करें । यह प्रयोग शुरू नहीं जब एक नया सेल शीशी पहले तीन मार्ग पर अभी भी है की सिफारिश की है ।
  2. विषाणु संक्रमण (Day 2)
    1. वायरस सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी
      1. तेजी से गल एक ३७ ° c पानी स्नान में RSV की एक जमी हुई शीशी लगभग पूरी तरह से गल और बर्फ पर तुरंत जगह । तैयार 3 प्रत्येक RSV वायरस स्टॉक के लिए दोहराने के लिए परख सकता है, 1:10 के एक प्रारंभिक वायरस शेयर कमजोर पड़ने का उपयोग १०० μL के साथ पतला वायरस के/
        नोट: चित्रा 1 triplicates में नकारात्मक नियंत्रण दिखाता है ।
      2. जोड़ें १०० प्रत्येक पतला वायरस के 1:10 में एक पंक्ति के तपसिल में एक ९६ अच्छी तरह से U-नीचे बाँझ प्लेट की μL । Add ९० μL/DMEM + १००० IU पेन/strep की FCS बिना पंक्तियों B से ज तक ।
      3. एक पंक्ति से पंक्ति B. Mix समाधान से 10 μL स्थानांतरित करके प्लेट नीचे धारावाहिक 1:10 कमजोर पड़ने को pipetting सामग्री ऊपर और नीचे 5 बार और जारी रखें दस गुना कमजोर पड़ने जब तक पंक्ति H. अंतिम 10 μL त्यागें ताकि प्रत्येक कुआं में अंतिम मात्रा ९० μL है ।
        नोट: यह एक कमजोर पड़ने के लिए नए सुझावों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. A549 कोशिकाओं को वायरस टीका
      1. पिछले दिन पर तैयार A549 सेल प्लेट (ओं) को पुनः प्राप्त करें । सुनिश्चित करें कि ९६ में A549 सेल monolayers-अच्छी तरह से प्लेटें ~ ८०% धाराप्रवाह हैं । धीरे प्लेट उल्टे और बाँझ शोषक कागज तौलिया पर हल्के से सोख्ता द्वारा मीडिया को त्यागें ।
      2. दो बार पंजाब के १०० μL के साथ सभी कुओं धोने, धीरे प्लेट उल्टे और प्रत्येक धोने के बाद बाँझ शोषक कागज तौलिया पर हल्के से सोख्ता द्वारा अतिरिक्त पंजाबियों त्यागना । प्लेटें सूखने की अनुमति न दें ।
      3. वायरस कमजोर पड़ने वालों को वायरल अनुमापन प्लेट (फिगर 1) से A549 सेल प्लेट पर इसी कुंए में ट्रांसफर करें । ३७ ° c, 5% CO2पर 1 h के लिए थाली मशीन । 1 ज की मशीन के बाद, खिचड़ी भाषा का उपयोग कर supernatants एक पिपेट (पार संक्रमण से बचने के लिए) । बाहर ले ९० μL/
      4. 1x मध्यम १९९ के १०० μL जोड़ें (M199, सामग्री की तालिका देखें) + १.५% carboxymethylcellulose सोडियम नमक (सीएमसी) कम चिपचिपापन + 2% FCS पेन युक्त strep/
        नोट: 2x M199 + 4% FCS + 2% कलम/strep और 3% सीएमसी समाधान के लिए अग्रिम में तैयार है और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करने की जरूरत है । सुनिश्चित करें कि समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म है प्लेटों को जोड़ने से पहले ।
        1. 2x M199 समाधान तैयार: 1 पाउच/500 मिलीलीटर आसुत जल + 20 मिलीलीटर FCS + 10 मिलीलीटर कलम/strep (2x MI99 बनाने के लिए) । ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर इकाई का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें ।
        2. 3% सीएमसी की तैयारी के लिए, सीएमसी के 15 ग्राम आसुत पानी की ५०० मिलीलीटर में धीरे जोड़ें । ५० डिग्री सेल्सियस पर धातु सरगर्मी हीटर का उपयोग करके पानी में सीएमसी भंग, जो तैयारी के बारे में 1 ज लेता है । 3% सीएमसी बनाने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण और समाधान आटोक्लेव ।
          नोट: सीएमसी ठोस पानी के लिए जोड़ा जाना चाहिए ताकि भंग किया जा करने के लिए; सूखी ठोस करने के लिए पानी जोड़ने का एक "का झुरमुट" ठोस है कि बहुत मुश्किल है भंग पैदा करता है ।
        3. 1x M199 + १.५% सीएमसी कम चिपचिपापन + 2% FCS पेन युक्त कलम/strep मिश्रण से 1:1 2x M199 और 3% सीएमसी चरण 1.2.2.4.2 में तैयार ।
      5. ३७ ° c, 5% CO2पर 3 दिनों के लिए थाली मशीन ।
  3. परख प्लेट और विश्लेषण (5 दिवस के विकास)
    1. निर्धारण और परख प्लेट के विकास
      1. M199 + सीएमसी + 2% FCS प्लेट को धीरे से उलटा करके पेन/strep को त्यागें । धीरे जोड़ें (कोशिका परत परेशान से बचने के लिए) २०० μL निर्धारण बफर की (८०% एसीटोन, 20% पंजाबियों, पर संग्रहीत-20 ° c) कोशिकाओं को ठीक करने के लिए. 20 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      2. निर्धारण बफर त्यागें और शोषक कागज तौलिया पर धीरे दाग । छोड़ प्लेट चेहरा नीचे 10 मिनट के लिए सूखी ।
        नोट: इस कदम के बाद से, परख BSL2 हूड के बाहर प्रदर्शन किया जा सकता है ।
      3. तैयार 5% दूध मंदक फ़िल्टर्ड में समाधान अवरुद्ध ०.०५% polysorbate 20 (पंजाब-polysorbate, सामग्री की तालिकादेखें) युक्त एक थाली के लिए, २००/well और ११० कुओं के आधार पर ब्लॉक करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना: 200/well x ११० वेल्स = 22 मिलीलीटर (१.१ मिलीलीटर केंद्रित दूध मंदक में २०.९ मिलीलीटर फ़िल्टर्ड पंजाब-polysorbate) । इस स्तर पर, यह भी प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए पर्याप्त अवरुद्ध समाधान बनाते हैं । एक प्लेट के लिए, ५०/well और ११० कुओं पर आधारित प्रत्येक एंटीबॉडी समाधान के लिए आवश्यक मात्रा की गणना: ५०/well x ११० वेल्स = ५.५ मिलीलीटर । इसलिए, एक एकल प्लेट परख के लिए आवश्यक दूध मंदक अवरुद्ध समाधान की कुल मात्रा ३३ मिलीलीटर है ।
      4. ब्लॉकिंग समाधान के २००/well जोड़ें । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में थाली मशीन धीरे प्लेट और शोषक कागज तौलिया पर दाग औंधा द्वारा समाधान त्यागें ।
      5. तैयार 1:500 बकरी एक्स RSV एंटीबॉडी (मॉब – प्राथमिक एंटीबॉडी) समाधान अवरुद्ध में पतला । मॉब समाधान के ५०/well जोड़ें और 1 h. धो थाली के लिए ३७ ° c पर मशीन फ़िल्टर्ड पंजाबियों के साथ 3 बार-polysorbate ।
      6. तैयार 1:5000 Alexa-Fluor गधा विरोधी बकरी आईजीजी (माध्यमिक एंटीबॉडी) समाधान अवरुद्ध में पतला । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के ५०/well जोड़ें और 1 h. धो थाली के लिए ३७ ° c पर मशीन फ़िल्टर्ड पंजाबियों के साथ 5 बार-polysorbate ।
      7. fluorescein isothiocyanate (FITC) चैनल का उपयोग कर एक स्वचालित स्पॉट रीडर पर प्लेट पढ़ें और चित्र 2में दिखाया गया के रूप में गिनती सेटिंग्स. पंनी में प्लेट लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान । परख से पहले एक अप्रयुक्त ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट और लाना गिनती सेटिंग्स का उपयोग कर साधन जांचना ।
        नोट: यदि आवश्यक हो तो कुछ दिनों के भीतर पुनः स्कैनिंग संभव है । अंशांकन और गिनती सेटिंग बचाया और भविष्य स्कैनिंग अगर परख अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया प्लेट की एक ही प्रकार का उपयोग करता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      8. मूर्ति पट्टिका या बाधित सेल monolayers (चित्रा 3) के लिए कुओं की छवियों की जांच करें । बाधित सेल monolayers के साथ कुओं को बाहर निकालें ।
        नोट: मूर्ति पट्टिका के आकार के आधार पर, मैनुअल मायने रखता है उन कुओं या उन कुओं के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता हो सकती है डेटा विश्लेषण से खारिज कर सकता है । एक वैध परिणाम के लिए मानदंड शामिल नहीं बाधित सेल monolayer या मूर्ति पट्टिकाओं में एक से अधिक की नकल एक अच्छी तरह से दोहराने और कोई PFU में पता चला नकारात्मक कुओं (जोड़े गए वायरस के बिना कुओं) ।
    2. वायरल सांद्रता निर्धारित
      1. पिछली दो कमजोरियां चुनें जहां स्पॉट को स्पष्ट रूप से गिना जा सकता है । एक ही कमजोर पड़ने पर कुओं को दोहराने से स्थानों की औसत संख्या की गणना । नीचे दिए गए फार्मूले का इस्तेमाल करते हुए स्टॉक सैंपल की वायरल titer (PFU प्रति एमएल) की गणना करें:
        PFU/एमएल = पट्टिकाओं की औसत संख्या/(कमजोर कारक × पतला वायरस की मात्रा को अच्छी तरह से जोड़ा)
        नोट: वायरस एकाग्रता प्रत्येक RSV स्टॉक के लिए निर्धारित अब PRN परख (चरण 2) में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. RSV बेअसर परख

  1. सीडिंग प्लेट्स (Day 1)
    1. DMEM में A549 कोशिकाओं resuspend + 10% FCS + १००० IU पेन/strep पर 4 x 105/mL. बीज ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे बाँझ प्लेट १०० μL के साथ/अच्छी तरह से युक्त 4 x 104 A459 कोशिकाओं और रात भर में मशीन प्लेटें ३७ ° c, 5% सह2 (कोशिकाओं को लॉग-चरण विकास में होगा) ।
      नोट: 23 मार्ग के बाद नई A549 सेल शीशी का प्रयोग करें । यह संख्या 3 बीतने से पहले A549 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है ।
  2. वायरस और सीरम तैयारी (Day 2)
    नोट: नमूना प्रकार पर निर्भर करता है, वहां पूर्व प्रसंस्करण नमूनों के लिए आवश्यक कदम को पकड़ने के पहले परख रहे हैं । यह RSV अंतर्राष्ट्रीय मानक सीरा कि अब जैविक मानकों और नियंत्रण (NIBSC) के लिए राष्ट्रीय संस्थान से अनुरोध पर उपलब्ध है का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।
    1. सीरम कमजोर पड़ने की तैयारी
      1. गल. हीट पर मानव RSV संदर्भ आनटिसम (संदर्भ सीरम, रेफरी) और सीरम परीक्षण नमूनों को निष्क्रिय सीरम नमूने और संदर्भ आनटिसम में एक पानी स्नान में ५६ ° c पर 30 मिनट के लिए उपयोग करने से पहले । प्लेट टेम्पलेट (चित्रा 4) के अनुसार कमजोरियां तैयार करें ।
      2. रेफरी के 1:100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें । FCS प्रति परख प्लेट (जैसे, रेफरी के १.५ μL १५० μL की कुल मात्रा में) के बिना DMEM + कलम/strep में पतला रेफरी के ११० μL की एक ंयूनतम तैयार । एक ९६ अच्छी तरह से U-नीचे बाँझ प्लेट की अच्छी तरह से A12 में 1:100 पतला रेफरी के ११० μL जोड़ें ।
      3. जोड़ें ५५ μL के DMEM + कलम/strep के लिए FCS बिना वेल्स बी 12 में H12 के लिए । एक पंक्ति B से ५५ μL स्थानांतरित कर रहा है, pipetting सामग्री द्वारा समाधान मिश्रण और नीचे 5 बार और लगातार जब तक पंक्ति H. media के अंतिम ५५ μL छोड़ें ताकि प्रत्येक कुआं में अंतिम मात्रा ५५ μL है क्रम 1:2 कमजोर पड़ने से प्लेट नीचे प्रदर्शन करते हैं । प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए नए सुझावों का प्रयोग करें ।
      4. सीरम परीक्षण नमूनों की 1:100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें. के रूप में सभी सीरम नमूने तपसिल में परख रहे हैं, ११० μL/well x 3 = ३३० μL सीरम परीक्षण नमूना प्रति की एक ंयूनतम मात्रा तैयार करें ।
      5. प्रत्येक पतला सीरम परीक्षण नमूना के ११० μL जोड़ें (1:100; s = सीरम 1, S2 = सीरम 2, आदि) इसी वेल्स A1 करने के लिए A9 और भी E1 ९६ के E9 करने के लिए-अच्छी तरह से बाँझ प्लेट चित्रा 4के अनुसार.
      6. Add ५५ μL of DMEM + पेन/strep बिना FCS के सभी कुओं बला X. (नमूने 1, 2, और 3 के लिए) पंक्ति डी तक कदम 2.2.1.3 के अनुसार धारावाहिक 1:2 कमजोर पड़ने प्रदर्शन । मीडिया के अंतिम ५५ μL को छोड़ें ताकि प्रत्येक कुआं में अंतिम मात्रा ५५ μL हो । इसी प्रकार, सीरियल 1:2 कमजोर पड़ने के लिए नमूने 4, 5, और 6 पंक्तियों के लिए ई एच के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
        नोट: यह एक कमजोर पड़ने के लिए नए सुझावों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      7. DMEM + पेन/strep के ५५ μL जोड़ें FCS बिना कुओं के कॉलम 10 और 11 में ।
    2. वायरस की तैयारी
      1. तेजी से गल एक ३७ ° c पानी स्नान में RSV की एक जमी हुई शीशी लगभग पूरी तरह से गल और बर्फ पर तुरंत जगह ।
      2. चरण aliquot में निर्धारित RSV 1.3.2 की एकाग्रता के आधार पर FCS के बिना DMEM + पेन/strep में वायरस को पतला करना । लागू एक कमजोर पड़ने है कि लगभग २०० PFU/ ५.५ मिलीलीटर (१०० कुओं के लिए) की कुल मात्रा तैयार करें ।
    3. वायरस-सीरम मिश्रण की तैयारी
      1. पतला वायरस के ५५ कॉलम के सभी कुओं के लिए जोड़ें 1-9 और पंक्तियों के कुओं ई कॉलम के एच 10 और 11 (सकारात्मक नियंत्रण) के अनुसार प्लेट टेंपलेट (चित्रा 4) ।
      2. Add ५५ of DMEM + पेन/strep पंक्तियों के सभी कुओं के लिए FCS बिना कॉलम 10 और 11 के डी (नकारात्मक नियंत्रण) । ३७ ° c, 5% CO2पर 1 h के लिए थाली मशीन ।
    4. A549 कोशिकाओं को वायरस टीका
      1. गर्मी की अवधि के पूरा होने से पहले, A549 सेल प्लेट (एस) प्राप्त करने के लिए 2.1.1 चरण में तैयार । सुनिश्चित करें कि ९६ में A549 सेल monolayers-अच्छी तरह से प्लेटें ~ ८०% धाराप्रवाह हैं ।
      2. धीरे प्लेट उल्टे और बाँझ शोषक कागज तौलिया पर हल्के से सोख्ता द्वारा मीडिया को त्यागें । दो बार पंजाब के १०० μL के साथ सभी कुओं धोने, धीरे प्लेट उल्टे और प्रत्येक धोने के बाद बाँझ शोषक कागज तौलिया पर हल्के से सोख्ता द्वारा अतिरिक्त पंजाबियों त्यागना । प्लेटें सूखने की अनुमति न दें ।
      3. हस्तांतरण १०० वायरस के/well-सीरम मिश्रण A549 सेल प्लेट पर इसी कुओं के लिए प्लेट टेम्पलेट निम्नलिखित ३७ ° c, 5% CO2पर 1 h के लिए थाली मशीन ।
      4. 1 ज के बाद, एक पिपेट का उपयोग कर, बाहर ले ९०/well और गरम 1x M199 के १०० जोड़ें + १.५% सीएमसी + 2% FCS + पेन/strep. ३७ ° c, 5% CO2पर 3 दिनों के लिए थाली मशीन ।
        नोट: सुनिश्चित करें कि समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म है प्लेटों को जोड़ने से पहले ।
  3. परख प्लेट और विश्लेषण (5 दिवस के विकास)
    1. निर्धारण और परख प्लेट विकसित करने के लिए कदम 1.3.1.1 1.3.1.8 के बाद ।
    2. निर्धारित ५०% बेअसर titer
      1. निर्धारित ५०% बेअसर titer पारस्परिक सीरम कमजोर पड़ने के बीच आनुपातिक दूरी की गणना से ऊपर और नीचे ५०% ' कोई सीरम ' नियंत्रण वेल्स (सकारात्मक वायरस नियंत्रण-कॉलम 10, पंक्तियों ई-एच) ।
      2. सीरम कुओं और कोई सीरम नियंत्रण कुओं में व्यक्तिगत वायरल संक्रमण से उत्पन्न होने वाली PFU (यानी, सजीले टुकड़े) की संख्या की गणना । कोई सीरम नियंत्रण कुओं के PFU की निकृष्ट संख्या की गणना और ५०% मूल्य निर्धारित करते हैं ।
      3. सीरम कमजोरियां के साथ गिना जाता है जो तुरंत ऊपर है और कोई सीरम नियंत्रण कुओं के ५०% मूल्य से नीचे की पहचान करें । अर्द्ध-लॉग ग्राफ़ या स्प्रेडशीट टेम्पलेट का उपयोग करके, x-अक्ष पर PFU की संख्या (रेखीय स्केल) और y-अक्ष पर पारस्परिक सीरम कमजोर पड़ने (लॉग10 स्केल) प्लॉट करें. दो बिंदुओं के बीच एक लाइन ड्रा और ५०% इस लाइन से परीक्षण सीरम नमूनों की बेअसर titers पढ़ें ।
        नोट: RSV PRN परख वर्कशीट (अनुपूरक वर्कशीट) ५०% बेअसर titer निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

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Representative Results

एक वायरस के शेयर की अनुमापन 1:10 से 1:108 कमजोर पड़ने के लिए वायरस स्टॉक एकाग्रता निर्धारित करने से पहले PRN परख (प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5में दिखाया गया) से प्रदर्शन किया गया । चित्रा 5से, PFU 1:104 और 1:105के कमजोर पड़ने पर मज़बूती से गिना जा सकता है । इसी कमजोर पड़ने पर तपसिल कुओं से PFU की औसत संख्या की गणना की गई. 1:105 कमजोर पड़ने पर धब्बों की औसत संख्या के बाद से 14 था, इस वायरल शेयर के वायरल titer इस प्रकार निर्धारित किया गया था:

14 (धब्बों की औसत संख्या)/[10-5 (कमजोर पड़ने) x ०.१ मिलीलीटर (इनोक्युलम की मात्रा)] = १.४ x 107 PFU/एमएल

उपर्युक्त विधि का उपयोग करते हुए, हमने मानव नमूनों में RSV-A और B दोनों के लिए नबस मापा है. चित्रा 6 RSV के खिलाफ अलग नब titers के साथ तीन प्रतिनिधि सीरम नमूनों की अच्छी तरह से छवियों की व्याख्या प्रदर्शित करता है-A. चित्रा 6A एक प्रतिनिधि सीरम (वास्तविक परख प्लेट तीन तकनीकी प्रतिकृति थी) के लिए अच्छी तरह से नमूना अनुमापन प्रतिकृति के छवियों से पता चलता है । सीरम कमजोरियां संकेत के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए अलग हैं । वायरस नियंत्रण कुओं केवल वायरस युक्त और कोई सीरम उनके औसत PFU की गणना की थी और ५०% बेअसर कटौती, जो इस उदाहरण में ५२ था निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया । चित्रा घमण्ड यह दिखाता है कि इस कट-ऑफ के प्रयोग से तीन सीरा का अनुमापन कैसे निर्धारित किया गया था । लॉग2 सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक x-अक्ष पर और PFU की संख्या पर नियंत्रण के एक प्रतिशत के रूप में y-अक्ष पर प्लॉट किए गए है । प्रतीक और त्रुटि पट्टियां triplicates ± मानक विचलन के माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । वायरस-नियंत्रण कुओं में औसत स्थानों का ५० प्रतिशत (क्षैतिज डैश्ड रेखा द्वारा इंगित) एक कट-ऑफ के रूप में इस्तेमाल किया गया था ५०% एक सीरम नमूने के एंटीबॉडी titer बेअसर निर्धारित करने के लिए । बेअसर एंटीबॉडी titer कमजोर पड़ने का पारस्परिक है कि वायरस गतिविधि के ५०% निषेध में परिणाम होगा के रूप में परिभाषित किया गया है ।

प्रत्येक प्रयोग के रूप में RSV संदर्भ आनटिसम और सकारात्मक वायरस नियंत्रण कुओं शामिल हैं, अंतर परख परिवर्तनशीलता की निगरानी प्रयोगों के बीच गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करता है । चित्रा 7 RSV के परिणामों से पता चलता है-गांबिया पलटन (n = 21)10 और मेलबोर्न में स्वस्थ स्वयंसेवकों से दो अलग वयस्क साथियों में एक PRN परख (n = ३६) । Titers RSV नब प्रत्येक जनसंख्या के भीतर चर रहे थे, Gambian वयस्कों के साथ एक कम मतलब है titer मेलबोर्न वयस्कों की तुलना में । RSV संदर्भ आनटिसम भी दिखाया गया है (N = ५२ प्रतिकृति), ६.८२% की भिन्नता (CV) के गुणांक के साथ बहुत कम परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन.

Figure 1
चित्रा 1: RSV स्टॉक के quantitation के लिए वायरल अनुमापन प्लेट लेआउट । v = RSV वायरस का स्टॉक (v1, वायरल बैच के शेयर 1; v2, वायरल बैच के शेयर 2; v3, वायरल बैच के शेयर 3), N = नकारात्मक नियंत्रण ठीक है, एक्स = मीडिया जोड़ा । रंग कोडिंग केवल प्लेट लेआउट के दृश्य सहायता करने के लिए है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: स्पॉट रीडर के लिए उपयोग किया गया उदाहरण गणना सेटिंग. आम तौर पर वायरस पट्टिका गिनती के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों के स्क्रीनशॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मूर्ति और बाधित सेल monolayers के उदाहरण । (क) कलाकृतियों । (ख) बाधित कक्ष monolayers. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: RSV PRN परख के लिए प्लेट टेम्पलेट । वी = वायरल सकारात्मक नियंत्रण कुओं, N = नकारात्मक नियंत्रण कुओं, एक्स = मीडिया जोड़ा, एस = संदर्भ आनटिसम सभी कमजोर पड़ने के साथ (1:100 से 1:12800) कॉलम में 12 । रंग कोडिंग केवल प्लेट लेआउट के दृश्य सहायता करने के लिए है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक RSV वायरल अनुमापन परिणाम का एक उदाहरण । एक तपसिल में प्रदर्शन किया परख से प्रतिनिधि कुओं दिखाया जाता है । एक अच्छी तरह से संख्या में स्पॉट रीडर का उपयोग गिने सजीले टुकड़े के नंबर को देखें । टीएमसी = बहुत गिनती के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक प्रतिनिधि RSV PRN परख से परिणाम । (क) विभिन्न कमजोर पड़ने पर्वतमाला के अनुसार तीन व्यक्ति सीरम नमूनों के लिए गिना PFU की संख्या. एक अच्छी तरह से छवि में संख्या गिनती सजीले टुकड़े की संख्या को देखें । (ख) तीन प्रतिनिधि मानव सीरम नमूनों के लिए एक पैनल में अच्छी तरह से छवियों से titer व्याख्या नब । डेटा वायरस नियंत्रण कुओं से ५०% कट-ऑफ के आधार पर गणना की है । क्षैतिज सलाखों मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: RSV (एन = 21) और Gambian (n = ३६) मेलबोर्न में एंटीबॉडी titers बेअसर वयस्कों । मानव RSV संदर्भ सीरम भी तुलना के लिए दिखाया गया है (N = ५२ प्रतिकृति). प्रतीक व्यक्तिगत titers का प्रतिनिधित्व करते है और क्षैतिज सलाखों के ज्यामितीय मतलब titer ± ९५% CI प्रतिनिधित्व करते हैं । N = ५२ परिणाम एक दो महीने की अवधि में तीन तकनीशियनों पर आधारित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure S1
अनुपूरक चित्रा 1: RSV के लिए नब titers की तुलना-A. (बाएँ) नब titers परिकलित रेखीय और गैर-रेखीय प्रतीपगमन मॉडल (N = १५२ परख) का उपयोग कर । (दाएं) RSV-एक नब दोनों रैखिक और गैर रेखीय प्रतिगमन मॉडल का उपयोग titers के बीच सहसंबंध । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

हम और विकसित किया है एक सरल और कुशल RSV सूक्ष्म बेअसर परख है कि आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं में अनुकूलित किया जा सकता है अनुकूलित । यह परख वायरल संक्रमण की क्षमता को मापने के साथ ही सेलुलर स्तर पर पकड़ने के द्वारा वायरल संक्रमण के निषेध को मापने में सक्षम है कंप्यूटरीकृत छवि स्कैनिंग का उपयोग कर । एक इमेजिंग आधारित मंच और विशिष्ट एंटीबॉडी आधारित प्रणालियों के उपयोग की विशिष्टता और स्थान का पता लगाने की संवेदनशीलता पारंपरिक पट्टिका का पता लगाने के तरीकों की तुलना में वृद्धि हुई है6,7। यह कम infectivity के साथ RSV उपभेदों के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है और भी PRN परख में उपयोग करने से पहले RSV एकाग्रता का एक सटीक ठहराव प्रदान करता है ।

यह अनुशंसित है कि वायरल स्टॉक के एक ही बैच के प्रत्येक अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है क्रम में किसी भी बैच को कम करने के लिए RSV शेयरों के बीच बैच रूपांतरों । अंय परख के महत्वपूर्ण पहलुओं वायरस इनपुट एकाग्रता की निरंतरता, A549 सेल monolayer की अखंडता, और एक ही गिनती सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए परख निरंतरता और सटीकता सुनिश्चित शामिल हैं । प्लेट में जोड़े गए वायरस की मात्रा को एक अलग पट्टिका वायरल अनुमापन में फिर से सत्यापित किया जा सकता है । हालांकि, PRN परख के सकारात्मक नियंत्रण कुओं की निगरानी भी वास्तविक वायरल titer का एक संकेत प्रदान करता है और भी परख भर की निगरानी सार्थक है । इसके अलावा, हर थाली में संदर्भ सीरम सहित एक और गुणवत्ता नियंत्रण उपाय यह सुनिश्चित करना है कि परख reproducible हैं । हमारे प्रयोगों ने NIBSC से हाल ही में मान्य RSV इंटरनेशनल स्टैंडर्ड आनटिसम का उपयोग नहीं किया, क्योंकि यह हमारे अध्ययन के समय११उपलब्ध नहीं था. इस RSV अंतरराष्ट्रीय मानक आनटिसम का उपयोग RSV नब मापने भविष्य के अध्ययनों के लिए सिफारिश की जानी चाहिए ताकि प्रयोगशालाओं में परिणाम विश्वास के साथ तुलना की जा सकती है ।

एक अपेक्षाकृत सरल, उच्च प्रवाह परख के विकास के रूप में और अधिक प्रयोगशालाओं दुनिया भर में इस विधि का उपयोग करने में सक्षम होगा RSV नबस के उपयोग के लिए वैश्विक मानकीकरण प्रयासों की सुविधा होगी । यह विशेष रूप से विकास में RSV वैक्सीन उंमीदवारों की संख्या दी महत्वपूर्ण है, कुछ वर्तमान चरण में 3 परीक्षणों के साथ । यह महत्वपूर्ण है कि RSV टीके के भविष्य के नैदानिक अध्ययन के परिणाम तुलनीय हो, और इसलिए एक मानकीकृत परख इस लक्ष्य के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करता है । जबकि कम और मध्यम आय वाले देशों की संख्या के लिए सीधे जरूरत उपकरणों के अधिग्रहण का समर्थन नहीं कर सकते हैं, अंतरराष्ट्रीय सहयोग और/या क्षमता निर्माण कार्यक्रमों के माध्यम से संपर्क के माध्यम से लंबी अवधि के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा ।

इस पकड़ने परख प्रोटोकॉल में लचीला है करने के लिए अलग सेल लाइनों (A549, Hep2, और वीरो) के लिए अनुकूलित किया जा रहा है और अलग RSV उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम भी RSV-B सफलतापूर्वक के लिए इस विधि को अनुकूलित किया है । परख मंच के रूप में एक ९६ के लिए विकसित किया गया है अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप, यह प्रदान करता है एक लागत प्रभावी और उच्च सटीकता के साथ वैकल्पिक प्रवाह विकल्प है क्योंकि यह अधिक प्रतिकृति और संदर्भ सीरम नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण के शामिल किए जाने की अनुमति देता है हर प्लेट. एक ही संदर्भ सीरम नियंत्रण का उपयोग भी इस गुणवत्ता नियंत्रण और गुणवत्ता आश्वासन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में सिफारिश की है. हमारे हाथ में, हम संदर्भ सीरम जो बहुत 30-40%5की सीमा में अंय जैविक परख के लिए सीवी की सूचना से कम है के लिए ६.८२% की बहुत कम सीवी मनाया ।

इसके अलावा, छवि डेटा और गणना डेटा (रॉ डेटा) इस प्रोटोकॉल से उत्पंन भविष्य के संदर्भ के लिए अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और/ कच्चे डेटा के रिकॉर्ड को बनाए रखने नैदानिक परीक्षणों के लिए एक आवश्यक आवश्यकता है, विशेष रूप से भविष्य RSV टीके शामिल उन । इस प्रोटोकॉल में सुझाए गए हमारे कार्यपत्रक ( अनुपूरक कार्यपत्रकदेखें) गुणवत्ता नियंत्रण और आश्वासन नियंत्रण के उद्देश्य के लिए प्रयोग के सभी पहलुओं को रिकॉर्ड करने में मदद कर सकते हैं । वर्कशीट ५०% एक सरल रैखिक मॉडल का उपयोग कर के रूप में यह किसी भी विशेष सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं का लाभ है titer बेअसर की गणना प्रदान करता है । हालांकि, हमारे पकड़ने परख से कच्चे डेटा गैर रेखीय प्रतिगमन मॉडल है कि भी ५०% की गणना titers को बेअसर करने के लिए टीके अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है, हालांकि इस अंय सॉफ्टवेयर12संकुल की आवश्यकता है,13 . हमारे प्रयोगात्मक डेटा का उपयोग करना, इन दो तरीकों का उपयोग कर प्राप्त परिणाम समान थे, titer मूल्यों को विश्वास देने सरलीकृत रैखिक मॉडल का उपयोग कर प्राप्त ( अनुपूरक चित्रा 1देखें) । इस परख की स्थापना के लिए लागत शायद सबसे महंगी आइटम स्पॉट रीडर जा रहा है के साथ कई प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती है (लगभग USD $50K) । हालांकि, स्पॉट रीडर इस तरह के एंजाइम के लिए अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने में सक्षम होने का लाभ है-immunospot लिंक (ELISpot) cytokine के लिए और/या एंटीबॉडी-स्रावित सेल माप, जो यह वैक्सीन परीक्षण मूल्यांकन में एक मूल्यवान घटक बनाता है.

अंत में, यह सुधार, उच्च प्रवाह RSV PRN परख आसानी से कई प्रयोगशालाओं में कार्यांवित किया जा सकता है और जो RSV पकड़ने के लिए परख के अंतरराष्ट्रीय सामंजस्य प्रयास का समर्थन करेंगे । यह भविष्य में उपंयास RSV वैक्सीन उंमीदवारों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने इसमें शामिल सभी प्रतिभागियों का धन्यवाद किया । हम विक्टोरियन सरकार के संचालन के बुनियादी ढांचे के समर्थन कार्यक्रम स्वीकार करते हैं । PVL एक NHMRC कैरियर विकास फैलोशिप प्राप्तकर्ता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line
A549 ATCC CCL-185 provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2 ATCC VR-1540 lot number 60430286
Reagents
Acetone Merck 1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) Life Technologies A11055
CMC sodium salt powder Sigma-Aldrich C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) Interpath SFBS-F
Goat X RSV antibody Merck AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) BEI Resources NR-4022 Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder Life Technologies 31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) Australian Biosearch 50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) Life Technologies 15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser Merck In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate Sigma-Aldrich 9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL) Invitro Technologies FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL) Thermo Fisher NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) Australia PL AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) Interpath 655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid) Interpath 650180
5 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4487-200EA
10 mL serological pipette Interpath 607180
25 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 Fisher Biotec TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 Fisher Biotec TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0 AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

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References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

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चिकित्सा अंक १४३ श्वसन syncytial वायरस एंटीबॉडी एंटीबॉडी पट्टिका में कमी संक्रामक रोग मानकीकरण बेअसर
एक बेहतर और उच्च प्रवाह श्वसन Syncytial वायरस (RSV) माइक्रो बेअसर परख
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Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz,… More

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz, J., Anderson, J., Ong, D. S., Chappell, K., Mulholland, K., Licciardi, P. V. An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (143), e59025, doi:10.3791/59025 (2019).

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