Summary
Diese Studie beschreibt einen hohen Durchsatz, Imaging-basierte Mikro-Neutralisation Assay der Titer von neutralisierende Antikörper spezifisch für respiratory syncytial Virus (RSV) zu bestimmen. Dieser Assay-Format wurde auf verschiedenen Probenarten getestet.
Abstract
Respiratory syncytial Virus-spezifischen neutralisierenden Antikörper (RSV NAbs) sind ein wichtiger Marker der Schutz gegen RSV. Eine Reihe von verschiedenen Assay-Formate sind derzeit weltweit im Einsatz so gibt es eine Notwendigkeit für eine präzise und Hochdurchsatz-Methode zur Messung der RSV NAbs. Wir beschreiben hier einen Imaging-basierte Mikro-Neutralisation-Assay, der auf RSV Untergruppe A getestet wurde und kann auch für RSV Untergruppe B und verschiedenen Probentypen angepasst werden. Diese Methode ist sehr reproduzierbar, mit Inter-Assay-Variationen für den Referenz-Antiserum wird weniger als 10 %. Wir glauben, dass dieser Test leicht in vielen Laboren weltweit relativ kostengünstig hergestellt werden kann. Entwicklung einer verbesserten, Hochdurchsatz-Assays, die RSV NAbs misst ist ein bedeutender Schritt nach vorn für die Standardisierung von dieser Methode international als entscheidend für die Bewertung der neuartigen RSV Impfstoffkandidaten in der Zukunft.
Introduction
Respiratory syncytial Virus (RSV) ist die führende Ursache von Infektionen der unteren Atemwege in der pädiatrischen Population weltweit1. Trotz seiner hohen Belastung gibt es noch keine Impfung oder Behandlung zur Verfügung. Seit 2013 hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) RSV Impfstoffentwicklung vorrangig Großforschungseinrichtungen, mit jährlichen WHO Beratung treffen2,3erklärt. Die WHO hat vereinbart mit RSV neutralisierenden Antikörpern (NAb) Messung Impfstoff Immunogenität, zu überwachen, wie dies als großen serologische Marker für Schutz4erkannt wird. Jonas wurden zum Schutz vor schweren RSV-Infektion in einer Reihe von Studien, sowie klinischen Studien mit Anti-RSV monoklonalen Antikörper Palivizumab, derzeit nur prophylaktische Strategie zur Verfügung4gezeigt.
Es gibt mehrere NAb Assay Formate von Laboratorien weltweit, einschließlich der Zelle und molekulare-basierte Assays, die Standardisierungsbemühungen5,6,7,8herausfordernde gemacht haben. Die Plaque-Reduzierung der konventionellen Neutralisation (PRN) Assay, der die Anzahl der reduzierten Plaque bilden Einheiten (PFU) durch die Anwesenheit von einer RSV-spezifischen Antikörper misst bleibt jedoch noch der Goldstandard-9. Hier berichten wir über ein verbessertes, vereinfachte und Hochdurchsatz-PRN-Protokoll, das auf zahlreichen Zelllinien für RSV-Sorten und mit erhöhten Assay Durchsatz verwendet werden kann. Dieses Protokoll wurde mit klinischen Proben aus verschiedenen Einstellungen sowie an Proben aus Tiermodell Experimenten getestet.
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Protocol
Hinweis: Alle Schritte müssen in einer BSL2 Haube durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Virale Titration ist erforderlich im Vorfeld einer PRN-Test zur Bestimmung der optimalen RSV-Konzentration in der PRN-Assay verwendet. Es empfiehlt sich, aliquoten die Virus-Bestände in einem kleinen Volumen, die einmal aufgetaut und für jede NAb-Assay verwendet werden. Mit der gleichen virale bestand für alle NAb-Assays für alle Proben aus einer Studie durchgeführt wird auch empfohlen. Stellen Sie sicher, Kultur, Medien und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist bei 37 ° C erwärmt, bevor Sie Zellplatten hinzufügen.
1. RSV virale Titration
Hinweis: Je nach Virus-Bestände und die Anzahl der Duplikate kann die Assay-Platte gemäß Abbildung 1eingerichtet werden. Jeder Virus-Aktie sollte in dreifacher Ausfertigung der Assay-Platte, beginnend bei der höchsten virale Konzentration (d.h., 01:10) titriert. Serielle Titrationen können in der Regel werden 01:10. A549 Zellkultur sowie Wartung und RSV Kultur Verfahren erfolgt mit standard-Verfahren und sind in diesem Protokoll nicht enthalten.
- Aussaat von Platten (Tag1)
- Aufschwemmen Sie A549 Zellen in Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM) + 10 % fetalen Kälberserum (FCS) + 1000 IU Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) auf 4 x 105/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well, 4 x 104 A459 Zellen enthält.
- Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 inkubieren (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum).
Hinweis: Verwenden Sie neue A549 Zellen Fläschchen nach 23 Passagen. Es wird nicht gestartet die Experimente empfohlen, wenn eine neue Zelle Ampulle noch in den ersten drei Passagen.
- Virus-Infektion (Tag2)
- Vorbereitung des Virus serielle Verdünnung
- Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis. Bereiten Sie 3 Wiederholungen für jede RSV Virus Lager geprüft werden, verwenden eine anfängliche Virus Lager Verdünnung von 01:10 mit 100 μL der verdünnten Virus/gut und reservieren Sie mindestens eine Spalte für die negativ-Kontrolle.
Hinweis: Abbildung 1 zeigt negative Kontrolle in Triplicates. - Fügen Sie 100 μL jeder verdünnte Virus am 01:10 in dreifacher Ausfertigung der Reihe A von einer 96-Well U-Boden steril Teller. Reihen B, H. 90 μL/Well DMEM + 1000 IU Pen/Strep ohne FCS hinzufügen
- Führen Sie serielle 01:10 Verdünnungen unten die Platte durch die Übertragung von 10 μL von Reihe A r. B. Mix Lösung durch Pipettieren Inhalt nach oben und unten 5 Mal und die zehnfache Verdünnungen bis Reihe H. verwerfen die letzten 10 μL fortsetzen, so dass das Endvolumen in jedem gut 90 μL.
Hinweis: Es ist wichtig, neue Tipps für jede Verdünnung verwenden.
- Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis. Bereiten Sie 3 Wiederholungen für jede RSV Virus Lager geprüft werden, verwenden eine anfängliche Virus Lager Verdünnung von 01:10 mit 100 μL der verdünnten Virus/gut und reservieren Sie mindestens eine Spalte für die negativ-Kontrolle.
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Virus Impfung A549 Zellen
- Abrufen von A549 Cell plate(s) am Vortag vorbereitet. Sicherstellen Sie, dass A549 Zellen Monoschichten in 96-Well-Platten ~ 80 % Zusammenfluss. Verwerfen Sie Medien durch die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf sterile saugfähigen Papiertuch abtupfen.
- Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μl PBS zweimal, entsorgen Sie überschüssiges PBS durch Platte vorsichtig umdrehen und leicht beflecken auf sterile saugfähigen Papiertuch nach jedem Waschen. Lassen Sie Platten zum Trocknen nicht zu.
- Übertragen Sie die Virus-Verdünnungen von der viralen Titration Platte (Abbildung 1) in entsprechenden Vertiefungen auf A549 Zellplatte. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2. Dekantieren Sie nach 1 h Inkubation Überstände mit einer Pipette (zur Vermeidung von Kreuzkontamination). Nehmen Sie 90 μL/gut.
- Hinzufügen von 100 μl 1 X Medium 199 (M199, siehe Tabelle der Materialien) + 1,5 % Natriumsalz Carboxymethylcellulose (CMC) geringe Viskosität + 2 % FCS mit Pen/Strep in jede Vertiefung.
Hinweis: 2 x M199 + 4 % FCS + 2 % Pen/Strep und 3 % CMC Lösungen müssen im Voraus vorbereitet und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung bei 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie zu Platten hinzufügen.- Bereiten Sie 2 x M199 Lösung: 1 Beutel/500 mL destilliertes Wasser + 20 mL FCS + 10 mL Pen/Strep (zu 2 x MI99). Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 μm-Filter-Einheit.
- Für die Zubereitung von 3 % CMC, 15 g CMC langsam in 500 mL destilliertem Wasser hinzugeben. Auflösen der CMC im Wasser mithilfe von metallischen Rührer Heizung bei 50 ° C, ca. 1 h Vorbereitung führt. Mischung gut zu 3 % CMC und Autoklaven die Lösung.
Hinweis: Die CMC solide muss zu dem Wasser hinzugefügt werden, um aufgelöst werden; Zugabe von Wasser zu den trockenen Volumenkörper erzeugt ein "Büschel" Festkörper, der sehr schwer zu lösen ist. - Bereiten Sie 1 x M199 + 1,5 % CMC niedrige Viskosität + 2 % FCS Pen/Strep durch das Mischen von 1:1 mit 2 x M199 und 3 % CMC im Schritt 1.2.2.4.2 vorbereitet.
- 3 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Platte.
- Vorbereitung des Virus serielle Verdünnung
- Entwicklung von Assays Platte und Analyse (Tag 5)
- Fixierung und entwickelnden Assay-Platte
- M199 + CMC + 2 % FCS mit Pen/Strep durch vorsichtig umdrehen der Plattenrandes zu verwerfen. Fügen Sie langsam (zur Vermeidung von stören die Zellschicht) 200 μL der Fixierung Puffer (80 % Aceton, 20 % PBS, bei-20 ° C gelagert), Zellen zu beheben. Bei-20 ° C für 20 min inkubieren.
- Verwerfen des Fixierung-Puffers und Tupfen auf saugfähigem Papierhandtuch. Plattenfläche zu verlassen bis zu 10 min trocknen lassen.
Hinweis: Von diesem Schritt ab kann Assay außerhalb der BSL2 Haube durchgeführt werden. - Bereiten Sie 5 % Milch Verdünnungsmittel blockierende Lösung in gefilterten PBS mit 0,05 % Polysorbat 20 (PBS-Polysorbat, siehe Tabelle der Materialien). Für eine Platte, berechnen Sie das Volumen für Sperrung auf 200/gut und 110 Brunnen basiert benötigt: 200/Well X 110 Brunnen 22 mL = (1,1 mL konzentrierte Milch in 20,9 mL diluent gefiltert PBS-Polysorbat). In diesem Stadium auch ausreichend blockierende Lösung für primäre und sekundäre Antikörper bilden. Für eine Platte, berechnen Sie das Volumen für jeden Antikörperlösung auf Basis von 50/gut und 110 Brunnen benötigt: 50/gut X 110 Brunnen = 5,5 mL. Daher ist das Gesamtvolumen der Milch Verdünnungsmittel blockiert Lösung für eine einzelne Platte Assay erforderliche 33 mL.
- Fügen Sie 200 /well von blockierenden Lösung. Inkubieren Sie Platte bei Raumtemperatur (RT) 30 min. verwerfen die Lösung durch die Platte vorsichtig umdrehen und auf saugfähiges Küchenpapier Tupfen.
- Bereiten Sie 1: 500 X RSV Ziege Antikörper (mAb-Primärantikörper) verdünnt in blocking-Lösung vor. Fügen Sie 50 /well der mAb-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h waschen Platte 3 Mal mit gefilterten PBS-Polysorbat.
- Bereiten Sie 1:5,000 Alexa Fluor Esel Anti-Ziege IgG (Sekundärantikörper) verdünnt in blocking-Lösung vor. Fügen Sie 50 /well der Sekundärantikörper Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h waschen Platte 5 Mal mit gefilterten PBS-Polysorbat.
- Lesen Sie Platte auf einem automatisierten Flecken Reader mit dem Fluorescein erfolgt (FITC) Channel zu und zählen Sie Einstellungen wie in Abbildung 2dargestellt. Platte in Folie wickeln und bei 4 ° c lagern Kalibrieren Sie das Gerät mit einer nicht verwendeten 96-Well-Kultur-Platte und Eingabe Anzahl Einstellungen vor dem Test.
Hinweis: Innerhalb von wenigen Tagen zu scannen ist möglich, wenn erforderlich. Die Kalibrierung und Graf Einstellung können gespeichert und verwendet für die zukünftigen Scans, wenn der Test die gleiche Art von Platte, die für die Kalibrierung verwendet verwendet werden. - Überprüfen Sie die Bilder der Brunnen für Artefakt Plaques oder gestörte Zelle Monoschichten (Abbildung 3). Brunnen mit gestörten Zelle Monolagen auszuschließen.
Hinweis: Abhängig von der Größe der Artefakt Plaques manuelle Zählungen können für diese Brunnen durchgeführt werden müssen oder die Brunnen müssen aus der Datenanalyse verworfen werden. Kriterien für ein gültiges Ergebnis sind keine gestörten Zelle Monolage oder Artefakt Plaques in mehr als eine Wiederholung gut erkannt und keine PFU in negativen Brunnen (Brunnen ohne zusätzlichen Virus) nachgewiesen.
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Virale Konzentrationen zu bestimmen
- Wählen Sie die letzten beiden Verdünnungen, wo die Flecken deutlich gezählt werden kann. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Spots von replizieren Wells in der gleichen Verdünnung. Berechnen Sie die virale Titer (PFU pro mL) der Lager Probe mit Hilfe der folgenden Formel:
PFU/mL = durchschnittliche Anzahl von Plaketten / (Verdünnung Faktor × Volumen des verdünnten Virus hinzugefügt, um den Brunnen)
Hinweis: Der Viruskonzentration bestimmt für jede Aktie RSV kann jetzt in der PRN-Assay (Schritt 2) verwendet werden.
- Wählen Sie die letzten beiden Verdünnungen, wo die Flecken deutlich gezählt werden kann. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Spots von replizieren Wells in der gleichen Verdünnung. Berechnen Sie die virale Titer (PFU pro mL) der Lager Probe mit Hilfe der folgenden Formel:
- Fixierung und entwickelnden Assay-Platte
2. RSV Neutralisation Assay
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Aussaat von Platten (Tag1)
- Aufschwemmen Sie A549 Zellen in DMEM + 10 % FCS + 1000 IU Pen/Strep auf 4 x 105/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well mit 4 x 104 A459 Zellen und inkubieren Sie Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum).
Hinweis: Verwenden Sie neue A549 Zellen Fläschchen nach 23 Passagen. Es wird nicht empfohlen, A549 Zellen vor Durchgangsnummer 3 zu verwenden.
- Aufschwemmen Sie A549 Zellen in DMEM + 10 % FCS + 1000 IU Pen/Strep auf 4 x 105/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well mit 4 x 104 A459 Zellen und inkubieren Sie Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum).
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Virus und Serum-Vorbereitung (Tag2)
Hinweis: Je nach Probentyp sind die erforderlichen Schritte für die Vorverarbeitung Proben vor der NAb-Assay. Es wird empfohlen, die RSV internationale standard Sera zu verwenden, die jetzt auf Anfrage vom nationalen Institut für biologischen Standards und Kontrollen (NIBSC) erhältlich sind.-
Vorbereitung der Serum-Verdünnung
- Auftauen der menschlichen RSV Referenz Antiserum (Referenz Serum, REF) und Serum Proben bei RT Hitze inaktivieren Serumproben und Antiserum in einem Wasserbad bei 56 ° C für 30 min vor dem Gebrauch zu verweisen. Bereiten Sie Verdünnungen gemäß der Platte Vorlage (Abbildung 4).
- Vorbereitung 1: 100 Verdünnung von der Ref-Vorbereitung mindestens 110 μL der REF verdünnt in DMEM + Pen/Strep ohne FCS pro Assay Platte (z.B., 1,5 μL der REF in einem Gesamtvolumen von 150 μL). Fügen Sie 110 μL von 1: 100 verdünnt REF in gut A12 von einer 96-Well U-Boden steril Teller.
- Vertiefungen B12 H12 in Spalte 12 55 μL DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen. Durchführen Sie serielle Verdünnungen von 1:2 nach unten die Platte durch Übertragung von 55 μL von Reihe A, Reihe B, mixing-Lösung durch Pipettieren Inhalt nach oben und unten 5 Mal und weiter bis Reihe H. verwerfen die endgültige 55 μL der Medien so, dass das Endvolumen in jedem gut 55 μL. Verwenden Sie neue Tipps für jede Verdünnung.
- 1: 100 Verdünnung des Serums Testproben vorbereiten. Wie alle Serumproben in dreifacher Ausfertigung untersucht sind, bereiten Sie ein Mindestvolumen von 110 μl/Well x 3 = 330 μl pro Test Serumprobe.
- Fügen Sie 110 μL jeder verdünnte Serum Test Probe (1: 100; S1 = Serum 1, S2 = Serum 2, etc..) in entsprechenden Vertiefungen A1 bis A9 und auch E1 bis E9 der sterilen 96-Well Platte gemäß Abbildung 4.
- Fügen Sie 55 μL der DMEM + Pen/Strep ohne FCS in alle Vertiefungen gekennzeichnet X. Perform serielle Verdünnungen von 1:2 nach Schritt 2.2.1.3 bis Reihe D (für Proben 1, 2 und 3). Die letzten 55 μL der Medien zu verwerfen, so dass das Endvolumen in jede Vertiefung 55 μL. Ebenso führen der serielle Verdünnungen von 1:2 für Proben, 4, 5 und 6 Zeilen E bis H.
Hinweis: Es ist wichtig, neue Tipps für jede Verdünnung verwenden. - Brunnen in den Spalten 10 und 11 55 μL DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen.
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Vorbereitung des virus
- Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis.
- Verdünnen Sie Virus in DMEM + Pen/Strep ohne FCS anhand der Konzentration der RSV aliquoten bestimmt im Schritt 1.3.2. Anwenden einer Verdünnung, die etwa 200 PFU/Brunnen gibt. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 5,5 mL (für 100 Brunnen).
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Vorbereitung der Virus-Serum-Mischung
- 55 des verdünnten Virus hinzu kommen alle Brunnen der Spalten 1 bis 9 und Brunnen von Stützenreihen E-H 10 und 11 (Positivkontrolle) entsprechend der Platte Vorlage (Abbildung 4).
- Alle Brunnen der Zeilen A-D Spalten 10 und 11 (Negativkontrolle) 55 DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2.
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Virus Impfung A549 Zellen
- Rufen Sie vor der Fertigstellung der Inkubationszeit A549 Cell plate(s) in Schritt 2.1.1 vorbereitet ab. Sicherstellen Sie, dass A549 Zellen Monoschichten in 96-Well-Platten ~ 80 % Zusammenfluss.
- Verwerfen Sie Medien durch die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf sterile saugfähigen Papiertuch abtupfen. Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μl PBS zweimal, entsorgen Sie überschüssiges PBS durch Platte vorsichtig umdrehen und leicht beflecken auf sterile saugfähigen Papiertuch nach jedem Waschen. Lassen Sie Platten zum Trocknen nicht zu.
- Übertragen Sie 100 /well die Virus-Serum-Mischung in die entsprechenden Vertiefungen auf A549 Zellplatte nach der Platte Vorlage Inkubation der Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2.
- Nach 1 h, mit einer Pipette, 90/gut herausnehmen und fügen Sie vorgewärmt 100 1 x M199 + 1,5 % CMC + 2 % FCS + Pen/Strep. 3 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Platte.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Lösung bei 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie zu Platten hinzufügen.
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Vorbereitung der Serum-Verdünnung
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Entwicklung von Assays Platte und Analyse (Tag 5)
- Fixierung und Assay Platte folgende Schritte 1.3.1.1 zu 1.3.1.8 zu entwickeln.
- Die 50 %-Neutralisation-Titer zu bestimmen
- Bestimmen Sie die 50 %-Neutralisation-Titer durch die Berechnung der proportionalen Abstand zwischen die gegenseitige Serum Verdünnungen oben und unter 50 % des Steuerelements "kein Serum" (positive Virus Control - Spalte 10, Zeilen E-H) Brunnen.
- Die Anzahl der PFU (d.h. Plaketten) aus einzelnen Virusinfektionen in Serum Brunnen und kein Serum-Kontroll-Vertiefungen. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von PFU die kein Serum-Kontroll-Vertiefungen und bestimmen Sie den Wert von 50 %.
- Serum-Verdünnungen mit zählt die unmittelbar oberhalb und unterhalb der 50 % des Wertes des die kein Serum-Kontroll-Vertiefungen sind zu identifizieren. Mit einem semi-log Graph oder Arbeitsblattvorlage, zeichnen Sie die Anzahl der PFU auf der x-Achse (lineare Skala) und die gegenseitige Serum Verdünnung auf der y-Achse (Log10 Skala). Zeichnen Sie eine Linie zwischen den beiden Punkten und lesen Sie 50 % Neutralisation Titer des Tests Serumproben aus dieser Linie zu.
Hinweis: RSV PRN-Assay-Arbeitsblatt (Ergänzende Arbeitsblatt) wird verwendet, um die 50 %-Neutralisation-Titer zu bestimmen.
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Representative Results
Die Titration einer Virus-Aktie wurde durchgeführt von 01:10, 01:108 Verdünnung der Viruskonzentration Lager vor der PRN-Assay (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5dargestellten) zu bestimmen. Aus Abbildung 5, PFU gezählt werden kann zuverlässig bei Verdünnungen von 01:104 und 01:105. Die durchschnittliche Anzahl der PFU aus dreifacher Brunnen bei der gleichen Verdünnung wurde berechnet. Da die durchschnittliche Anzahl der Plätze am 01:105 Verdünnung 14 war, war die virale Titer von diesem Virus bestand wie folgt ermittelt:
14 (durchschnittliche Anzahl der Spots) / [10-5 (Verdünnung) x 0,1 mL (Volumen des Inokulums)] = 1,4 x 107 PFU/mL
Mit der oben beschriebenen Methode, wir haben für beide RSV NAbs gemessen-A und B in humanen Proben. Abbildung 6 zeigt die Interpretation der gut Bilder von drei repräsentativen Serumproben mit unterschiedlichen NAb-Titer gegen RSV-A. Abbildung 6A zeigt auch Bilder der Titration der Probe repliziert für jedes repräsentative Serum (die eigentliche Test-Platte hatte drei technische Wiederholungen). Serum-Verdünnungen wie angegeben sind unterschiedlich für jede Probe. Virus-Kontroll-Vertiefungen mit nur Virus und kein Serum hatte ihre durchschnittliche PFU berechnet und zur Ermittlung der Neutralisierung der 50 %-Cut-off, die in diesem Beispiel wurde 52. Abbildung 6 zeigt, wie die Titration der drei Sera war über Grenzwertes ermittelt. Der Log2 Kehrwert der Serum-Verdünnung ist auf der x-Achse und die Anzahl der PFU als Prozentsatz des Steuerelements auf der y-Achse aufgetragen. Symbol und Fehler Balken stellen den Mittelwert der Triplicates ± Standardabweichung. Fünfzig Prozent der durchschnittlichen Spots in die Virus-Kontroll-Vertiefungen (angegeben durch die horizontale gestrichelte Linie) diente als ein Cut-off um die 50 % neutralisierende Antikörpertiter von einer Serumprobe zu bestimmen. Die neutralisierende Antikörpertiter ist definiert als der Kehrwert der Verdünnung, die 50 % Hemmung der Viren-Aktivität zur Folge hätte.
Wie jedes Experiment die RSV Referenz Antiserum und positiven Virus Kontroll-Vertiefungen enthält, bietet die Inter-Assay-Variabilität Überwachung Qualitätskontrolle zwischen Experimente. Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse des RSV-A PRN Assays in zwei verschiedenen Erwachsenen Kohorten der Gambia-Kohorte (N = 21)10 und gesunden Probanden in Melbourne (N = 36). Titer von RSV NAb waren variabel in jeder Bevölkerung, mit der gambischen Erwachsene haben einen geringeren mittlere NAb Titer im Vergleich zu Melbourne Erwachsenen. Der RSV-Referenz-Antiserum wird ebenfalls angezeigt (N = 52 Wiederholungen), demonstriert sehr geringe Variabilität mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 6,82 %.
Abbildung 1: virale Titration Platte Layout für die Quantifizierung der RSV Bestände. V = Bestand des RSV-Virus (v1, Lager von viralen Batch 1 v2, Lager von viralen Batch 2; v3, virale Charge 3 Lager), N = Negativkontrolle, X = Medien hinzugefügt. Farbcodierung ist nur zur Visualisierung der Platte Layout zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiel zählen Einstellungen für den Flecken Leser. Screenshot der Parameter in der Regel verwendet für die Zählung von Virus-Plaketten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Beispiele für Artefakt und gestörte Zelle Monolagen. (A) Artefakte. (B) Disrupted cell Monolayer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Platte Vorlage für RSV PRN Assay. V = virale Positivkontrolle Brunnen, N = Negativkontrolle Brunnen, X = Medien hinzugefügt, S = Referenz Antiserum mit allen Verdünnungen (von 1: 100, 01:12, 800) in Spalte 12. Farbcodierung ist nur zur Visualisierung der Platte Layout zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: ein Beispiel für eine RSV virale Titration Ergebnis. Vertreter Brunnen aus einem Assay in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden angezeigt. Die Zahlen in jede Vertiefung beziehen sich auf die Zahl der Plaketten gezählt, mit dem Flecken-Reader. TMC = zu viele zu zählen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: ergibt sich aus einem Vertreter RSV PRN-Assay. (A) die Anzahl der PFU gezählt für drei individuelle Serumproben nach verschiedenen Verdünnung reicht. Die Zahlen in jedem gut Bild beziehen sich auf die Zahl der Plaketten gezählt. (B) NAb Titer Auslegung aus den gut Bildern in zentrale A für die drei repräsentativen humanem Serum-Proben. Die Daten werden auf der Grundlage der 50 %-Cut-off von Virus-Kontroll-Vertiefungen berechnet. Horizontale Balken stehen für Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: RSV neutralisierende Antikörpertiter in Melbourne (N = 21) und Gambia (N = 36) Erwachsene. Der RSV Referenz Humanserum zeigt sich auch für den Vergleich (N = 52 Wiederholungen). Symbole stehen für individuelle Titer und horizontale Balken darstellen geometrischer Mittelwert Titer ± 95 % CI. N = 52 Ergebnisse basieren auf drei Techniker über einen Zeitraum von zwei Monaten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: Vergleich der NAb-Titer für RSV-A. (Links) NAb Titer mit linearen und nicht linearen Regressionsmodelle berechnet (N = 152 Assays). (Rechts) Korrelation zwischen RSV-A NAb-Titer mit beiden linearen und nicht linearen Regressionsmodelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Wir haben entwickelt und optimiert, einen einfachen und effizienten RSV Mikro-Neutralisation-Assay, der leicht in den meisten Labors angepasst werden kann. Dieser Assay ist in der Lage, Virusinfektion Fähigkeit sowie die Messung der Hemmung der viralen Infektion durch NAb auf zellulärer Ebene mit computerisierten Bild scannen zu messen. Die Verwendung von einer Imaging-basierten Plattform und spezifische Antikörper-basierten Systeme ist die Spezifität und Sensitivität der Spoterkennung im Vergleich zu herkömmlichen Plaque Erkennung Methoden6,7gestiegen. Dies ermöglicht Charakterisierung der RSV Stämme mit geringer Infektiosität und bietet auch eine genaue Quantifizierung der RSV Konzentration vor dem Gebrauch in der PRN-Assay.
Es wird empfohlen, dass die gleiche Charge von viralen Lager für jede Studie verwendet wird, um jede Charge zu Charge unterschiedlich RSV Bestände zu minimieren. Andere wichtige Aspekte des Assays sind die Konsistenz der Eingabe Viruskonzentration, die Integrität der A549 Zellen Monolage und mit gleichen Anzahl Einstellungen, um Assay Konsistenz und Genauigkeit zu gewährleisten. Die Menge an Viren hinzugefügt, um die Platte kann wieder in eine separate Plakette virale Titrierung überprüft werden. Jedoch Überwachung der Positivkontrolle Brunnen den PRN-Assay auch einen Hinweis auf aktuelle virale Titer und lohnt sich auch, über Tests zu überwachen. Einschließlich der Referenz-Serum in jede Platte ist übrigens eine weitere Qualitätskontrolle Maßnahme um sicherzustellen, dass die Assays reproduzierbar sind. Unsere Experimente habe nicht vor kurzem validierte RSV internationale standard Antiserum aus der NIBSC benutzt, da es zum Zeitpunkt unserer Studie11nicht verfügbar war. Mit diesem internationalen standard RSV-Antiserum sollte empfohlen werden, für zukünftige Studien RSV NAb zu messen, damit Ergebnisse in Laboratorien mit Zuversicht verglichen werden können.
Entwicklung eines relativ einfachen, Hochdurchsatz-Assays würde globale Standardisierung für die Nutzung des RSV NAbs erleichtern, wie weitere Labors weltweit in der Lage wäre, diese Methode zu verwenden. Dies ist besonders wichtig, angesichts der Zahl der RSV Impfstoffkandidaten in Entwicklung, mit einigen derzeit in Phase 3-Studien. Es ist wichtig, dass die Ergebnisse der zukünftigen klinischen Studien von RSV-Impfstoffen vergleichbar sein, und eine standardisiertere Test daher einen wichtigen Aspekt zur Erreichung dieses Ziels stellt. Während eine Reihe von Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen möglicherweise nicht in der Lage, direkte Unterstützung für Erwerb des Gerätes erforderlich, Verbindungen durch internationale Kooperationen und/oder Capacity-building-Programme werden auf mittlere bis lange Sicht entscheidend sein.
Diese NAb-Assay-Protokoll ist flexibel in der Lage, für verschiedene Zelllinien (A549 Hep2 und Vero) angepasst werden und eignet sich für verschiedene Stämme der RSV. Wir haben diese Methode auch für RSV-B erfolgreich angepasst. Wie die Test-Plattform für eine 96-Well-Platte-Format entwickelt wurde, bietet dies eine kostengünstige und Hochdurchsatz-Alternative mit hoher Genauigkeit weil dadurch mehr Wiederholungen und die Einbeziehung der Referenzkontrolle Serum und Negativkontrolle auf jeden Platte. Mit der gleichen Referenz Serum Kontrolle wird auch empfohlen, da dies entscheidend für die Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung zu gewährleisten. In unseren Händen beobachteten wir sehr niedrige CVs von 6,82 % für das Referenz-Serum ist viel niedriger als gemeldete CVs für andere biologische Assays im Bereich von 30-40 %5.
Darüber hinaus können die Bilddaten und die Zähldaten (Rohdaten) generiert aus diesem Protokoll für zukünftige Referenz und/oder Analyse auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Führung des Registers der raw-Daten ist eine wesentliche Voraussetzung für klinische Studien, insbesondere solche, die zukünftige RSV-Impfstoffe. Unser Arbeitsblatt (siehe Ergänzende Arbeitsblatt) vorgeschlagen, in dieses Protokoll kann dazu beitragen, alle Aspekte des Experiments zum Zweck der Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung Kontrolle aufzeichnen. Das Arbeitsblatt bietet die Berechnung von 50 % Titer ein einfaches lineares Modell verwenden, da dies den Vorteil hat, dass Spezialsoftware zu neutralisieren. Jedoch können die Rohdaten aus unseren NAb-Assay mit analysiert werden die nicht-lineare Regressionsmodell, das auch in der Impfstoff-Forschung verwendet wurden für die Berechnung von 50 % neutralisierende Titer, obwohl dies andere Software Pakete12,13 erfordert . Unsere experimentelle Daten zu nutzen, die erzielten Ergebnisse mit beiden Methoden waren ähnlich, Vertrauen, Titer-Werte, die mit dem vereinfachten lineare Modell (siehe ergänzende Abbildung1). Die Kosten für die Einrichtung dieser Assay ist erschwinglich für viele Labore mit vielleicht das teuerste Element wird die Flecken-Leser (ungefähr USD $50K). Der Flecken-Leser hat jedoch den Vorteil des Seins in der Lage, für andere Anwendungen wie z. B. die Enzym-linked Immunospot (ELISpot) für Cytokine und/oder Antikörper-sezernierenden Zelle Messung, wodurch es eine wertvolle Komponente im Impfstoff Testversion Auswertung genutzt werden.
Zusammenfassend, dieser verbesserten, Hochdurchsatz-RSV PRN-Assay in vielen Laboratorien leicht umsetzbar und wird unterstützen die internationale Harmonisierung, die für RSV NAb Assays. Dies wird für die Bewertung von neuartigen RSV Impfstoffkandidaten in Zukunft entscheidend sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Beteiligten. Wir anerkennen die Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support-Programm. PVL ist ein NHMRC Karriere Entwicklung-Stipendiat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
