Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59025
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2,4, 1,2
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

Summary

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Abstract

Solunum sinsisyal virüs özgü nötralize antikorlar (RSV yakalar) RSV karşı koruma önemli bir işaret vardır. Bu nedenle farklı tahlil biçimleri bir dizi şu anda dünya çapında bir ihtiyaç RSV yakalar ölçmek için doğru ve yüksek işlem hacmi bir yöntem için kullanılmaktadır. Biz burada RSV alt grubu A test edilmiş ve aynı zamanda RSV alt grubu B ve farklı örnek türleri için adapte edilebilir bir görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil açıklayın. Bu yöntem son derece az % 10 varlık başvuru anti-serum arası tahlil varyasyon ile tekrarlanabilir. Bizce bu tahlil nispeten düşük maliyetle dünya çapında birçok laboratuarlarında kolayca kurulabilir. Gelişme RSV yakalar ölçer bir geliştirilmiş, yüksek üretilen iş testin yanı sıra roman RSV aşısı adayların değerlendirilmesi için gelecekte kritik bu yöntem Uluslararası Standardizasyon için önemli bir adım gösterir.

Introduction

Respiratuvar sinsisyal virüs (RSV) alt solunum yolu enfeksiyonları Pediatrik popülasyon dünya çapında1önde gelen nedenidir. Onun yüksek yük rağmen hala hiçbir aşı veya tedavi kullanılabilen bulunmamaktadır. 2013 yılından bu yana, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) RSV aşısı geliştirme yıllık WHO istişare toplantıları2,3ile bir büyük araştırma öncelik olarak ilan etti. WHO Bu koruma4büyük serolojik marker olarak tanınan olarak aşı immünojenisite, izlemek için antikor (NAb) ölçüm nötralize RSV kullanarak kabul etti. NAbs ağır RSV enfeksiyonu yanı sıra anti-RSV monoklonal antikor palivizumab, şu anda sadece profilaktik strateji kullanılabilir4klinik çalışmalar bir dizi karşı korumak için göstermiştir.

Birden çok NAb tahlil laboratuvarları tarafından Dünya çapında,5,6,7,8zorlu standartlaştırma çabaları yapmış hücre ve moleküler tabanlı deneyleri de dahil olmak üzere kullanılan biçimi vardır. Ancak, bir RSV özgü antikor varlığı ile sınırlı plak oluşturan birimler (PFU) sayısını ölçer geleneksel plak-azaltma nötralizasyon (PRN) tahlil hala altın standart9kalır. Burada, çok sayıda hücre satırlarında ile artan tahlil geçerek ve farklı RSV suşları için kullanılabilir bir geliştirilmiş, Basitleştirilmiş ve yüksek işlem hacmi PRN Protokolü raporu. Bu iletişim kuralı klinik numuneleri farklı ayarlar yanı sıra hayvan modeli deneyler örnekleri Tarih kullanılarak test edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Tüm adımları BSL2 mahallede başka türlü belirtilmediği sürece yapılması gerekiyor. Viral titrasyon öncesinde bir PRN tahlil PRN assay olarak kullanılan en uygun RSV konsantrasyonu belirlemek için gereklidir. Bu virüs stokları bir kez çözdürülen ve her NAb tahlil için kullanılan küçük bir hacim içinde aliquot için tavsiye edilir. Bir çalışmada tüm örnekleri için gerçekleştirilen tüm NAb deneyleri için aynı viral stok kullanılması da önerilir. Kültür Medya ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ısındı 37 ° C'de hücre plakaları için eklemeden önce emin olun.

1. RSV Viral titrasyon

Not: Virüs hisse senedi sayısı ve yineleme sayısı bağlı olarak tahlil plaka Şekil 1göre ayarlanabilir. Her virüs hissenin nüsha en viral yoğun (yani, 1:10) başlayan tahlil plaka aşağı titre. Seri titrations-ebilmek var olmak genellikle 1:10. A549 hücre kültürü ve bakım gibi RSV kültür yordamı yapılır standart prosedürler kullanarak ve bu protokol için dahil değildir.

  1. Tabak (gün 1) tohum
    1. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) + % 10 fetal buzağı serum (FCS) + 1000 IU penisilin/streptomisin (kalem/strep), 4 x 105/mL A549 hücrelerde resuspend. Tohum 96-şey düz-alt 100 μL/iyi 4 x 104 A459 hücreleri içeren steril pilakalar.
    2. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2 tabak kuluçkaya (hücreleri log fazı büyüme olacak).
      Not: Yeni A549 hücre şişe sonra 23 geçişleri kullanın. Yeni bir hücre şişe hala ilk üç pasajlar olduğunda bu deneyler değil başlatmak için tavsiye edilir.
  2. Virüs enfeksiyonu (2 gün)
    1. Virüs seri seyreltme hazırlanması
      1. Hızla RSV tek bir donmuş şişe kadar neredeyse tamamen çözdürülen ve hemen buza koyun bir 37 ° C su banyosu içinde çözülme. 3 çoğaltır her RSV için virüs hisse senedi denetlesinler, bir ilk virüs hisse senedi seyreltme 1:10 seyreltilmiş virüs/iyi 100 μL ile kullanmak ve negatif kontrol için en az bir sütun ayırmak için hazır olun.
        Not: Şekil 1 negatif kontrol triplicates içinde gösterir.
      2. 1:10 satır bir 96-şey U-Alt A nüsha olarak seyreltilmiş her virüs 100 μL eklemek steril plaka. 90 μL/iyi DMEM + 1000 IU kalem/strep FCS olmadan H. B satırlarına ekleyin
      3. Seri 1:10 gerçekleştirmek dilutions aşağı satır B. Mix çözüm yukarı ve aşağı 5 kez pipetting içeriğe göre satır ve her son hacim de 90 μL böylece satır H. atma son 10 μL kadar panolarında dilutions devam etmek için A'den 10 μL aktarma tarafından plaka.
        Not: Her seyreltme için yeni ipuçları kullanmak önemlidir.
    2. Virüs aşısı A549 hücrelere
      1. A549 cell plate(s) önceki güne hazır almak. A549 hücre monolayers 96-şey tabak içinde ~ %80 birleşmesi olduğundan emin olun. Yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havluda Blot tarafından medya atmak.
      2. Bütün wells PBS 100 μL ile iki kez yıkayın, yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havlu üzerinde sonra her yıkama kurutma tarafından aşırı PBS atın. Tabak kuru izin vermez.
      3. Virüs dilutions viral titrasyon plaka (Şekil 1) karşılık gelen wells için A549 hücre tabağa aktarın. 1 h 37 ° c, % 5 CO2plaka kuluçkaya. 1 h kuluçka sonra dikkatle boşaltmak bir pipet (çapraz bulaşma için) kullanarak supernatants. 90 μL/iyi al.
      4. 1 x orta 199 100 μL ekleyin (M199, tablo malzemeleri görmek) + % 1.5 Ġnsan sodyum tuzu (CMC) düşük viskozite + % 2 FCS kalem/strep her de içeren.
        Not: 2 x M199 + % 4 FCS + % 2 kalem/strep ve % 3 CMC çözümleri önceden hazırlanmış ve ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolanan gerekir. Çözüm 37 ° C'de plakaları için eklemeden önce ısındı emin olun.
        1. 2 x M199 çözüm hazırlamak: 1 poşet/500 mL distile su + 20 mL FCS + 10 mL kalem/strep (2 yukarı yapmak için x MI99). 0,22 mikron filtre birimini kullanarak çözüm filtre.
        2. 3 hazırlanması için % CMC, CMC 15 bin 500 mL distile su içine yavaş yavaş ekleyin. CMC suda 50 ° C, 1 h hazırlık alır metalik karıştırıcı ısıtıcı kullanarak geçiyoruz. Mix 3 yapmak için % CMC ve otoklav çözüm.
          Not: CMC katı su çözünmüş eklenmelidir; Kuru katı su ekleyerek çözülmeye zordur katı bir "yığın" üretir.
        3. 1 x M199 + % 1.5 CMC düşük viskozite hazırlamak + % 2 FCS kalem/karıştırma tarafından strep 1:1 içeren 2 x M199 ve % 3 CMC adım 1.2.2.4.2 hazır.
      5. Plaka 37 ° c, % 5 CO23 gün kuluçkaya.
  3. Gelişmekte olan tahlil plaka ve analiz (5 gün)
    1. Fiksasyon ve gelişmekte olan tahlil plaka
      1. M199 + CMC + % 2 FCS içeren kalem/strep yavaşça plaka ters çevirme tarafından atmak. Yavaş yavaş ekleyin (önlemek için hücre katmanı rahatsız) 200 μL fiksasyon arabelleği (% 80 aseton, % 20 PBS,-20 ° C'de depolanan) hücreleri düzeltmek için. -20 ° c 20 dk için kuluçkaya.
      2. Fiksasyon arabellek atmak ve yavaşça emici kağıt havlu üzerinde leke. Plaka yüz bırakın 10 dakika kuru aşağı.
        Not: Bu adıma itibaren tahlil dışında BSL2 hood gerçekleştirilebilir.
      3. Polysorbate %20 5 süt % 0.05 içeren filtre uygulanmış PBS Dilüent engelleme çözüm hazırlamak (PBS-polysorbate, Tablo malzemelerigörmek). Bir tabak için engelleme 200/iyi ve 110 wells tabanlı için gerekli hacim hesaplamak: 200/iyi x 110 kuyu 22 mL = (1.1 mL konsantre süt 20.9 mL Dilüent filtre PBS-polysorbate). Bu aşamada, aynı zamanda birincil ve ikincil antikorları için yeterli engelleme çözüm oluşturur. Bir tabak için 50/iyi ve 110 wells dayalı her antikor çözüm için gerekli hacim hesaplamak: 50/iyi x 110 wells 5.5 mL =. Bu nedenle, bir tek plaka tayini için gerekli çözüm engelleme süt seyreltici hacmi 33 ml'dir.
      4. 200 /well engelleme çözüm ekleyin. Plaka (RT) Oda sıcaklığında 30 dk. atma için çözüm yavaşça plaka ters çevirme tarafından kuluçkaya ve emici kağıt havlu üzerinde leke.
      5. 1:500 keçi X RSV antikor (mAb-birincil antikor) çözüm engelleme seyreltilmiş hazırlayın. 50 /well mAb çözüm ekleyin ve 1 h. 3 kez ile filtre uygulanmış PBS-polysorbate yıkama plaka için 37 ° C'de kuluçkaya.
      6. 1:5,000 Alexa Fluor eşek Anti-keçi IgG (ikincil antikor) çözüm engelleme seyreltilmiş hazırlayın. 50 /well ikincil antikor çözüm ekleyin ve 1 h. 5 kere ile filtre uygulanmış PBS-polysorbate yıkama plaka için 37 ° C'de kuluçkaya.
      7. Plaka üzerinde floresein isothiocyanate (FITC) kanal kullanarak bir otomatik noktalar okuyucu okumak ve Şekil 2' de gösterildiği gibi ayarları say. Plaka folyo sarın ve 4 ° C'de depolayın Bir kullanılmayan 96-şey kültür plaka kullanarak ve tahlil önce sayısı ayarları giren cihazda kalibre.
        Not: Bir kaç gün içinde yeniden tarama gerekirse mümkündür. Kalibrasyon ve sayısı ayar kaydedilir ve plaka kalibrasyon için kullanılan aynı tür tahlil kullanıyorsa, gelecekteki taranmasında kullanılır.
      8. Kuyular için yapay doku plaklar veya kesintiye hücre monolayers (Şekil 3) görüntülerini kontrol edin. Wells ile kesintiye hücre monolayers hariç.
        Not: Yapay doku plaklar büyüklüğüne, el ile sayıları bu kuyular için yapılması gerekebilir ya bu wells veri analizi atılmak üzere gerekebilir. Geçerli bir sonuç için ölçüt içinde birden fazla çoğaltma de tespit kesintiye hücre monolayer veya yapay doku plak yok ve hiçbir PFU negatif Wells (kuyu eklenen virüs olmadan) tespit içerir.
    2. Viral konsantrasyonu belirlemek
      1. Nerede noktalar açıkça sayılabilir son iki dilutions seçin. Noktalar aynı seyreltme, Çoğalt kuyulardan ortalama sayısını hesaplayın. Aşağıdaki formül kullanarak hisse senedi örnek viral titresi (PFU mL başına) Hesapla:
        PFU/mL = plaklar ortalama sayısı / (seyreltme faktörü × seyreltilmiş virüs hacmi kuyuya ekledi)
        Not: her RSV hisse senedi için belirlenen virüs konsantrasyon şimdi PRN tahlil (adım 2) kullanılabilir.

2. RSV nötralizasyon tahlil

  1. Tabak (gün 1) tohum
    1. A549 hücre DMEM + % 10 FCS + 1000 IU kalem/strep 4 x 105/mL de resuspend. Tohum 96-şey düz-alt steril pilakalar ve 100 μL/iyi 4 x 104 A459 içeren hücreleri ve gecede, 37 ° C, % 5 CO2 tabak kuluçkaya (hücreleri log fazı büyüme olacak).
      Not: Yeni A549 hücre şişe sonra 23 geçişleri kullanın. Bu geçiş sayısı 3 önce A549 hücreleri kullanmak için tavsiye edilmez.
  2. Virüs ve serum hazırlık (2 gün)
    Not: Örnek türüne bağlı olarak, NAb tahlil önce ön işleme örnekleri için gereken adımlar vardır. Şimdi biyolojik standartları ve denetimleri (NIBSC) için Ulusal Enstitüsü'nden talep üzerine mevcuttur RSV uluslararası standart sera kullanılması önerilir.
    1. Serum seyreltme hazırlanması
      1. İnsan RSV başvuru anti-serum (başvuru serum, REF) çözülme ve serum örnekleri serum numuneleri RT. ısı devre dışı bırakabilirsiniz, test ve anti-serum kullanmadan 30 dk önce için 56 ° C'de bir su banyosunda başvuru. Dilutions plaka şablonu (Şekil 4) göre hazırlayın.
      2. 1: 100 seyreltme REF. hazırla, seyreltilmiş DMEM + kalem/strep tahlil plaka başına FCS olmadan REF 110 μL en az hazırlamak (örneğin, REF 1,5 μL toplam hacmine 150 μL). 1: 100 110 μL seyreltilmiş bir 96-şey U-Bottom iyi A12 REF eklemek steril plaka.
      3. DMEM + kalem/strep FCS olmadan 55 μL wells B12 H12 için sütun 12 ekleyin. Seri 1:2 dilutions plaka aşağı 55 μL A satırdan satıra B aktarma, yukarı ve aşağı 5 kez pipetting içeriğe göre çözüm karıştırma ve her son hacim de 55 μL böylece satır H. atma kadar medya son 55 μL devam etmeden gerçekleştirin. Yeni ipuçları her seyreltme için kullanın.
      4. 1: 100 seyreltme serum test örnekleri hazırlayın. Tüm serum numuneleri nüsha denetlesinler gibi 3 = 330 x 110 μL/iyi bir en küçük birim hazırlamak μL serum testi örnek başına.
      5. Her seyreltik serum test örneği (1: 100; 110 μL Ekle S1 = serum 1, S2 = serum 2, vs.) karşılık gelen wells için A1 ile A9 ve E1 E9 Şekil 4göre 96-şey steril plaka için.
      6. DMEM 55 μL Ekle + kalem/strep bütün wells için FCS olmadan X. Perform seri başı olarak adım 2.2.1.3 1:2 dilutions kadar satır D (örnek 1, 2 ve 3 için) etiketli. Böylece her şey son hacim 55 μL medya son 55 μL atmak. Benzer şekilde, belgili tanımlık seri halinde 1:2 dilutions örnekleri 4, 5 ve 6 satırları E H. için gerçekleştirmek
        Not: Her seyreltme için yeni ipuçları kullanmak önemlidir.
      7. DMEM + kalem/strep FCS olmadan 55 μL wells için yapılan 10 ve 11 sütun ekleyin.
    2. Virüs hazırlanması
      1. Hızla RSV tek bir donmuş şişe kadar neredeyse tamamen çözdürülen ve hemen buza koyun bir 37 ° C su banyosu içinde çözülme.
      2. 1.3.2. adımda belirlenen RSV aliquot konsantrasyonu dayalı FCS olmadan virüs DMEM + kalem/strep sulandırmak. Yaklaşık 200 PFU/iyi verir bir seyreltme uygulanır. Toplam hacmi 5.5 mL (100 kuyular için) hazırlayın.
    3. Virüs-serum karışımı hazırlanması
      1. Sütun 1-9 bütün wells ve wells, 10 ve 11 (pozitif kontrol) plaka şablonu (Şekil 4) göre sütunların satır E-H 55 seyreltilmiş şunun ekleyin.
      2. 55 DMEM + kalem/strep FCS olmadan tüm satırları sütunlar 10 ve 11 (negatif kontrol) A-D wells için ekleyin. 1 h 37 ° c, % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    4. Virüs aşısı A549 hücrelere
      1. Kuluçka süresi tamamlanmadan önce 2.1.1. adımda hazırlanan A549 cell plate(s) almak. A549 hücre monolayers 96-şey tabak içinde ~ %80 birleşmesi olduğundan emin olun.
      2. Yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havluda Blot tarafından medya atmak. Bütün wells PBS 100 μL ile iki kez yıkayın, yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havlu üzerinde sonra her yıkama kurutma tarafından aşırı PBS atın. Tabak kuru izin vermez.
      3. Virüs-serum karışımı 100 /well A549 hücre Incubate 1 h 37 ° c, % 5 CO2plaka plaka şablonu takip plaka üzerinde karşılık gelen wells aktarın.
      4. Bir pipet kullanarak 1 h 90/iyi çıkar ve ekledikten sonra 100, 1 x M199 + %1,5 CMC + % 2 FCS + kalem/strep prewarmed. Plaka 37 ° c, % 5 CO23 gün kuluçkaya.
        Not: Çözüm 37 ° C'de plakaları için eklemeden önce ısındı emin olun.
  3. Gelişmekte olan tahlil plaka ve analiz (5 gün)
    1. Fiksasyon ve tahlil plaka aşağıdaki adımları 1.3.1.1-1.3.1.8 geliştirmek.
    2. % 50 nötralizasyon titresi belirlemek
      1. Hesaplayarak % 50 nötralizasyon titresi orantılı uzaklığı arasında karşılıklı serum dilutions yukarıdaki ve 'serum' denetiminin % 50'in altında Kuyu yapımı (pozitif virüs denetimi - sütun 10, satır E-H) belirlemek.
      2. PFU (yani, plaklar) saymak serum wells ve hiçbir serum denetim wells bireysel viral enfeksiyonlar kaynaklanan. PFU yok serum denetim Wells ortalama sayısını hesaplamak ve % 50 değerini belirlemek.
      3. Serum dilutions hemen üstündeki ve altındaki hiçbir serum denetim wells % 50 değerini olan sayıları ile tanımlayın. Bir yarı oturum grafik veya elektronik tablo şablonu kullanarak, PFU sayısına (doğrusal ölçek) x ekseni ve y ekseni (günlük10 ölçek) üzerinde karşılıklı serum seyreltme arsa. İki nokta arasında bir çizgi çizmenizi ve % 50 nötralizasyon titreleri test serum numuneleri bu satırından okuyun.
        Not: RSV PRN tahlil çalışma sayfası (Ek çalışma) % 50 nötralizasyon titresi belirlemek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir virüs hisse senedi titrasyon 1:10 1:10 gerçekleştirilen8 seyreltme PRN tahlil ( Şekil 5' te gösterilen temsilcisi sonuçları) önce virüs hisse senedi konsantrasyonu belirlemek için. Şekil 5, PFU güvenilir 1:10 dilutions sayabiliriz4 ve 1:105. PFU aynı seyreltme, ineklemek kuyulardan ortalama sayısı hesaplanır. Noktalar 1:105 seyreltme 14 oldu ortalama sayısı beri bu viral stok viral titresi aşağıdaki gibi belirlenmiştir:

14 (ortalama sayısı noktalar) / [10-5 (seyreltme) 0.1 mL (inoculum hacmi) x] 1.4 x 10 =7 PFU/mL

Yukarıdaki kullanarak açıklanan yöntemi, her iki RSV için yakalar ölçülen var-A ve B insan örneklerinde. Şekil 6 NAb titreleri RSV-A. karşı değişen üç temsilcisi serum numuneleri iyi görüntülerini yorumlanması gösterir Şekil 6A de örnek titrasyon görüntülerini çoğaltır (gerçek tahlil plaka üç teknik çoğaltır vardı) her temsilcisi serum için gösterir. Belirtildiği gibi serum dilutions her örnek için farklıdır. Sadece virüs ve yok serum içeren virüs denetimi wells PFU hesaplanır ve % 50 nötralizasyon kesme, bu örnekte 52 olmadığını belirlemek için kullanılan ortalama vardı. Şekil 6B gösterir üç sera titrasyon nasıldı bu kesme kullanarak kararlı. Günlük2 Devrik değerlerin serum seyreltme x ekseni ve PFU sayısı y ekseni üzerinde denetim yüzdesi olarak çizilir. Sembol ve hata çubukları triplicates ± standart sapma ortalamasını temsil eder. Ortalama noktalar (yatay kesikli çizgiyle belirtilir) virüs denetimi Wells yüzde ellisi % 50 antikor titresi serum örneği nötralize belirlemek için bir kesme kullanıldı. Nötralize antikor titresi virüs etkinliğini % 50 inhibisyonu yol açacağı seyreltme karşılıklı olarak tanımlanır.

Her deney RSV başvuru anti-serum ve olumlu virüs denetimi wells içerir gibi arası tahlil değişkenlik izleme deneyler arasında kalite kontrol sağlar. Şekil 7 Gambiya kohort gelen iki farklı yetişkin tabur RSV-A PRN tahlil sonuçlarını gösterir (N = 21)10 ve sağlıklı gönüllü Melbourne (N = 36). RSV NAb titreleri Melbourne yetişkinlere kıyasla daha düşük ortalama NAb titresi olan Gambiya yetişkin ile her nüfus içinde değişken vardı. RSV başvuru anti-serum de gösterilir (N = 52 çoğaltır), varyasyon (CV) %6.82 katsayısı ile çok düşük değişkenlik gösteren.

Figure 1
Şekil 1: Viral titrasyon plaka düzen RSV stoklarının Nefelometri için. v = RSV virüs (v1, viral toplu 1 stokunun v2, 2 viral toplu stok; v3, viral toplu 3 hisse senedi), hisse senedi N negatif kontrol =, X = medya eklendi. Renk kodlaması yalnızca görselleştirme plaka düzeninin yardım etmektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: noktalar okuyucu için kullanılan örnek sayısını ayarlar. Ekran görüntüsü genellikle virüs plaklar sayım için kullanılan parametreler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: yapay doku ve kesintiye hücre monolayers örnekleri. (A) eserler. (B) bozulmuş hücre monolayers. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: plaka şablon RSV PRN tahlil için. V viral olumlu denetim wells, N = negatif kontrol wells, = X eklendi, medya S = sütun 12 (1: 1:12, 800 100) üzerinden tüm dilutions ile başvuru anti-serum =. Renk kodlaması yalnızca görselleştirme plaka düzeninin yardım etmektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: örnek bir RSV viral titrasyon sonucunun. Nüsha gerçekleştirilen bir tahlil kuyulardan temsilcisi gösterilir. Her şey sayılarda noktalar reader'ı kullanarak sayılır plaklar sayıya bakın. TMC = saymak için çok fazla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: sonuç bir temsilcisi RSV PRN tahlil. (A)üç bireysel serum örnekleri göre farklı seyreltme aralıkları için sayılan PFU sayısı. Her iyi görüntü sayıları sayılan plaklar sayıya bakın. (B) titresi yorumu panelinde A üç temsilcisi insan serum numuneleri için iyi görüntülerden NAb. Veri % 50 kesme virüs denetimi kuyulardan temel alınarak hesaplanır. Yatay çubuklar gösterir ortalama ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: antikor titreleri Melbourne nötralize RSV (N = 21) ve Gambiya (N = 36) Yetişkin. İnsan RSV başvuru serumu da karşılaştırma için görüntülenir (N = 52 çoğaltır). Bireysel titreleri sembolleri temsil ve yatay çubuklar geometrik ortalama titresi ± % 95 CI gösterir. N 52 = sonuçları bir iki aylık süre içinde üç teknisyen üzerinde temel alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure S1
Ek resim 1: bir karşılaştırma NAb titreleri için RSV-A. (Sol) doğrusal ve doğrusal olmayan regresyon modelleri kullanılarak hesaplanan titreleri NAb (N = 152 deneyleri). (Sağ) Doğrusal her iki kullanarak RSV-A NAb titreleri ve doğrusal olmayan regresyon modelleri arasında korelasyon. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz geliştirdik ve çoğu laboratuvarlarında kolayca uyarlanabilir bir basit ve etkili RSV mikro-nötralizasyon tahlil en iyi duruma getirilmiş. Bu tahlil viral enfeksiyon yeteneği hem de viral enfeksiyon NAb bilgisayarlı görüntü tarama kullanarak hücresel düzeyde tarafından inhibisyonu ölçme ölçmek yapabiliyor. Bir görüntüleme tabanlı platform ve belirli antikor tabanlı sistemler özgüllük ve geleneksel plak algılama yöntemleri6,7' ye göre nokta algılama hassasiyeti artmıştır. Bu sayede RSV karakterizasyonu ile düşük infektivite suşları ve de doğru bir miktar PRN assay olarak kullanmak için önceden RSV konsantrasyon sağlar.

Bu viral stok aynı toplu iş için her çalışma RSV hisse senetleri arasında toplu iş toplu iş değişiklikleri en aza indirmek için kullanılır önerilir. Tahlil önemli diğer yönleri virüs Giriş konsantrasyon, A549 hücre monolayer ve tahlil tutarlılığı ve doğruluğu sağlamak için aynı sayısı ayarları kullanarak bütünlüğünü tutarlılığını içerir. Plakasına eklendi virüs miktarı yine bir ayrı plak viral titrasyon doğrulanabilir. Ancak, aynı zamanda gerçek viral titresi belirtisi sağlar PRN testin pozitif kontrol wells izleme ve ayrıca deneyleri izlemek için faydalıdır. Ayrıca, her tabak içinde başvuru serum dahil deneyleri tekrarlanabilir olduğundan emin olmak için başka bir kalite kontrol ölçüsüdür. Bu bizim çalışma11anda mevcut değildi gibi bizim deneyler son zamanlarda doğrulanmış RSV uluslararası standart anti-serum NIBSC üzerinden kullanmak vermedi. Bu RSV uluslararası standart anti-serum kullanarak gelecekteki çalışmaları böylece sonuçları laboratuvarlar arasında güven ile karşılaştırılabilir RSV NAb ölçme için tavsiye.

Daha fazla laboratuarları dünya çapında bu yöntemi kullanmak mümkün olacak gibi nispeten basit, yüksek üretilen iş tahlil gelişimi RSV yakalar kullanımı için küresel standartlaştırma çabaları kolaylaştırmak. Bu geliştirme, bazı Şu anda faz 3 çalışmalarda RSV aşısı adayların sayısı göz önüne alındığında özellikle önemlidir. RSV aşıların gelecekteki klinik çalışmaların sonuçları karşılaştırılabilir ve bu nedenle standart bir tahlil bu amaç için önemli bir yönü temsil eden çok önemlidir. Düşük ve orta gelirli ülkeler bir dizi doğrudan desteklemek mümkün olmayabilir iken ekipman satın alma gerekli, uluslararası işbirliği yoluyla bağlantıları/veya kapasite geliştirme programları üzerinde Orta ve uzun vadede önemli olacaktır.

Bu NAb tahlil iletişim kuralı için farklı hücre hatları (A549, Hep2 ve Vero) adapte için güçlü olmak esnek ve farklı RSV suşları için kullanılabilir. Biz de başarıyla RSV-B için bu yöntem adapte olması. Tahlil platformu için bir 96-şey plaka biçim geliştirilmiştir gibi üzerinde daha fazla çoğaltır ve başvuru serum denetim ve negatif kontrol dahil sağlar çünkü bu bir düşük maliyetli ve yüksek işlem hacmi alternatif yüksek doğrulukta sağlar her plaka. Bu kalite kontrol ve kalite güvencesi sağlamak için kritik olduğu gibi aynı başvuru serum denetimini kullanarak da önerilir. Bizim ellerde %6.82 30-%405aralığındaki diğer biyolojik deneyleri için bildirilen CVs daha çok düşük olan başvuru serum için çok düşük CVs görülmektedir.

Ayrıca, görüntü verilerini ve bu iletişim kuralından oluşturulan sayısı verileri (ham veri) süresiz olarak ileride ve/veya analiz için saklanır. Ham veri kayıtlarının bakımı için klinik çalışmalarda, özellikle de gelecekteki RSV aşılar içeren temel bir gereksinimdir. Bizim çalışma sayfası (bkz. Ek çalışma) içinde önerilen bu protokolü deney kalite kontrol ve güvence denetim amacıyla tüm yönleriyle kaydetmek için yardımcı olabilir. Çalışma sayfasının herhangi bir özel yazılım gerektirmeyen avantajı olduğu gibi basit bir doğrusal model kullanarak titresi nötralize % 50 hesaplanması sağlar. Ancak, bizim NAb tahlil ham verileri bu diğer yazılım paketleri12,13 gerektirse de % 50 nötralize titreleri, hesaplamak için aşı araştırma da kullanılmıştır doğrusal regresyon modeli kullanılarak analiz edilebilir . Bizim deneysel verileri kullanarak, bu iki yöntem kullanarak elde edilen sonuçlar için Basitleştirilmiş Doğrusal model kullanılarak elde titresi değerlerle güven veren, benzerdi (bkz. ek Şekil 1). Bu tahlil ayarlamak için maliyet noktalar okuyucu (yaklaşık USD $50 K) olmak belki de en pahalı parça ile birçok laboratuarlar için uygun olduğu. Ancak, noktalar okuyucu sitokin ve/veya aşı deneme değerlendirme içinde değerli bir bileşeni yapar antikor salgılayan hücre ölçüm, enzim bağlı immunospot (ELISpot) gibi diğer uygulamalar için kullanılacak mümkün olmanın avantajı var.

Sonuç olarak, bu gelişmiş, yüksek üretilen iş RSV PRN tahlil birçok laboratuvarlarda kolayca uygulanabilir ve kim Uluslararası uyumlaşma çaba RSV NAb deneyleri için destek olacak. Bu roman RSV aşısı adayların değerlendirilmesi için gelecekte önemli olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar dahil tüm katılımcılara teşekkür ederim. Victoria Hükümeti'nın operasyonel altyapı destek programı anıyoruz. PVL NHMRC kariyer geliştirme bursu alıcı olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line
A549 ATCC CCL-185 provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2 ATCC VR-1540 lot number 60430286
Reagents
Acetone Merck 1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) Life Technologies A11055
CMC sodium salt powder Sigma-Aldrich C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) Interpath SFBS-F
Goat X RSV antibody Merck AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) BEI Resources NR-4022 Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder Life Technologies 31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) Australian Biosearch 50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) Life Technologies 15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser Merck In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate Sigma-Aldrich 9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL) Invitro Technologies FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL) Thermo Fisher NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) Australia PL AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) Interpath 655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid) Interpath 650180
5 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4487-200EA
10 mL serological pipette Interpath 607180
25 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 Fisher Biotec TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 Fisher Biotec TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0 AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Tags

Tıp sayı 143 solunum sinsisyal virüs nötralize antikor antikor plak azaltma bulaşıcı hastalık standardizasyon,
Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz,… More

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz, J., Anderson, J., Ong, D. S., Chappell, K., Mulholland, K., Licciardi, P. V. An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (143), e59025, doi:10.3791/59025 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter