Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En forbedret og høy gjennomstrømning respiratorisk Syncytial Virus (RSV) mikro-nøytralisering analysen

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59025
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2,4, 1,2
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

Summary

Denne studien beskriver en høy gjennomstrømning, imaging-baserte mikro-nøytralisering analysen å bestemme titer av nøytraliserende antistoffer spesifikke for respiratorisk syncytial virus (RSV). Denne analysen format har blitt testet på ulike utvalg typer.

Abstract

Respiratory syncytial virus-spesifikke nøytraliserende antistoffer (RSV NAbs) er en viktig indikator for beskyttelse mot RSV. En rekke forskjellige analysen formater er i bruk over hele verden så er det behov for en nøyaktig og høy gjennomstrømming metode for å måle RSV NAbs. Her beskriver vi imaging-baserte mikro-nøytralisering analysen som er testet på RSV undergruppe A og kan også tilpasses for RSV undergruppe B og forskjellige utvalg. Denne metoden er svært reproduserbare, med Inter analysen varianter for referansen antiserum blir mindre enn 10%. Vi tror denne analysen kan lett bli etablert i mange laboratorier over hele verden til relativt lav kostnad. Utvikling av forbedret, høy gjennomstrømming analysen som måler RSV NAbs representerer et betydelig skritt fremover for standardisering av denne metoden internasjonalt samt å være kritisk for vurdering av romanen RSV vaksine kandidater i fremtiden.

Introduction

Respiratorisk syncytial virus (RSV) er den ledende årsaken til nedre luftveisinfeksjoner i pediatric befolkningen verden1. Til tross for sin høye byrden er det fortsatt ingen vaksine eller behandling tilgjengelig. Siden 2013, har World Health Organization (WHO) erklært RSV vaksineutvikling som en stor forskning prioritet, med årlige WHO samråd møter2,3. WHO har avtalt med RSV nøytralisere antistoff (NAb) måling overvåke vaksine immunogenisitet, som dette er anerkjent som den store serologisk markøren beskyttelse4. NAbs har vist seg å beskytte mot alvorlig RSV infeksjon i en rekke studier som kliniske studier av anti-RSV monoklonalt antistoff palivizumab, er det bare forebyggende strategi tilgjengelig4.

Det er flere NAb analysen formater som brukes av laboratorier over hele verden, inkludert celle- og molekylær-baserte analyser, som har gjort standardisering innsats utfordrende5,6,7,8. Konvensjonelle plakk-reduksjon nøytralisering (PRN) analysen som måler antallet redusert plakk danner enheter (PFU) av tilstedeværelsen av en RSV-spesifikke antistoffer er imidlertid fortsatt gullstandarden9. Her rapporterer vi en forbedret, forenklet og høy gjennomstrømming PRN-protokoll som kan brukes på flere linjer, for forskjellige RSV stammer og økte analysen gjennomstrømming. Denne protokollen er testet klinisk utvalg fra forskjellige innstillinger og prøver fra dyremodell eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle trinn må utføres i en BSL2 hette med mindre annet opplyses. Viral titrering er nødvendig før en PRN-analysen for å bestemme optimale RSV konsentrasjonen i PRN analysen. Det anbefales å aliquot virus aksjer i et lite volum som blir tint gang og brukt for hver NAb analysen. Det anbefales også å bruke den samme viral for alle NAb analyser utført for alle prøver fra en studie. Kontroller at kultur medier og fosfat-bufret saltvann (PBS) er varmet på 37 ° C før du legger til celle plater.

1. RSV Viral titrering

Merk: Avhengig av hvor mange virus aksjer og antall duplikater, kan analysen plate settes opp i henhold til figur 1. Hver virus aksje bør være titreres i tre eksemplarer ned analysen platen, starter på den høyeste viral konsentrasjonen (dvs. 1:10). Seriell titrations kan vanligvis 1:10. A549 cellekultur og vedlikehold samt RSV kulturen prosedyren utføres ved hjelp av standard prosedyrer og er ikke inkludert i denne protokollen.

  1. Såing plater (dag 1)
    1. Resuspend A549 celler i Dulbeccos endret Eagles medium (DMEM) + 10% fosterets kalv serum (FCS) + 1000 IU penicillin/streptomycin (penn/strep) på 4 x 105/mL. Frø 96-brønns flat bunn sterilt plater med 100 μL/godt som inneholder 4 x 104 A459 celler.
    2. Inkuber plater overnatting på 37 ° C, 5% CO2 (celler blir i logg-fase vekst).
      Merk: Bruk ny A549 celle medisinglass etter 23 passasjer. Det anbefales ikke å starte eksperimenter når en ny cellen medisinglass er fortsatt på tre første avsnittene.
  2. Virusinfeksjon (dag 2)
    1. Utarbeidelse av virus føljetong fortynning
      1. Raskt tine enkelt frosne ampuller med RSV i et 37 ° C vannbad til nesten helt Tint og sted umiddelbart på is. Forberede 3 gjentak hver RSV virus lager å være assayed, bruke en innledende virus lager fortynning av 1:10 med 100 μL utvannet virus/godt og bestille minst en kolonne for negativ kontroll.
        Merk: Figur 1 viser negativ kontroll i triplicates.
      2. Tilsett 100 μL av hver utvannet virus på 1:10 i tre eksemplarer rad A av en 96-brønns U-bunn sterilt plate. Legge til 90 μL/vel DMEM + 1000 IU penn/strep uten FCS rader B H.
      3. Utføre føljetong 1:10 fortynninger ned platen ved å overføre 10 μL fra rad A til rad B. Mix løsning av pipettering innholdet opp og ned 5 ganger og fortsette tidoble fortynninger til p H. forkaste de siste 10 μL slik at det siste bindet i hver vel er 90 μL.
        Merk: Det er viktig å bruke nye tips for hver fortynning.
    2. Virus vaksinering A549 celler
      1. Hente A549 cell plate(s) forberedt på gårsdagen. Kontroller at A549 celle monolayers i 96-brønnen platene er ~ 80% confluent. Kast media forsiktig invertere plate og lett blotting på sterilt absorberende papirhåndkle.
      2. Vask alle brønner med 100 μL PBS to ganger, kaste overflødig PBS forsiktig invertere plate og lett blotting på sterilt absorberende papirhåndkle etter hver vask. Tillat ikke plater tørke.
      3. Overføre virus fortynninger fra viral titrering platen (figur 1) til tilsvarende brønner på A549 celle tallerkenen. Inkuber platen i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2. Etter 1 h inkubasjon Dekanter supernatants bruker en pipette (for å unngå kryss-kontaminering). Ta ut 90 μL/godt.
      4. Tilsett 100 μL av 1 x medium 199 (M199, se tabellen for materiale) + 1,5% carboxymethylcellulose natrium salt (CMC) lav viskositet + 2% FCS som inneholder penn/strep i hver brønn.
        Merk: 2 x M199 + 4% FCS + 2% penn/strep og 3% CMC løsninger må være forberedt på forhånd og lagret på 4 ° C for fremtidig bruk. Kontroller at løsningen er varmet på 37 ° C før du legger til plater.
        1. Forberede 2 x M199 løsning: 1 pose/500 mL destillert vann, 20 mL FCS + 10 mL penn/strep (utgjør 2 x MI99). Filtrere løsningen ved å benytte en 0.22 μm filter enhet.
        2. For utarbeidelse av 3% CMC, legge 15 g CMC sakte i 500 mL destillert vann. Oppløse CMC i vann ved hjelp av metalliske rørestang ovnen ved 50 ° C, som tar ca 1 time forberedelser. Bland godt å gjøre 3% CMC og autoklav løsningen.
          Merk: CMC solid legges til vannet for å bli oppløst; å legge vann til tørre solid produserer en "klump" av solid som er svært vanskelig å oppløse.
        3. Forberede 1 x M199 + 1,5% CMC lav viskositet + 2% FCS som inneholder penn/strep ved å blande 11:2 x M199 og 3% CMC forberedt i trinn 1.2.2.4.2.
      5. Inkuber plate for 3 dager på 37 ° C, 5% CO2.
  3. Utvikle analysen plate og analyse (dag 5)
    1. Fiksering og utvikle analysen plate
      1. Kast M199 + CMC + 2% FCS som inneholder penn/strep ved å forsiktig snu platen. Legge til sakte (for å unngå forstyrre celle laget) 200 μL fiksering bufferen (80% aceton, 20% PBS, lagret på 20 ° C) å fastsette celler. Ruge på 20 ° C for 20 min.
      2. Forkast fiksering bufferen og forsiktig klatt på absorberende papirhåndkle. La platen ansikt til tørr i 10 min.
        Merk: Dette trinnet og utover, kan analysen utføres utenfor BSL2 panseret.
      3. Forberede 5% melk fortynningsmiddel blokkerer løsning i filtrert PBS 0,05 prosent polysorbat 20 (PBS-polysorbat, se Tabellen for materiale). Én plate, beregne volumet nødvendig for blokkering basert på 200/godt og 110: 200/vel x 110 brønner = 22 mL (1.1 mL konsentrert melk fortynningsmiddel i 20.9 mL filtrert PBS-polysorbat). På dette stadiet, må du også utgjør tilstrekkelig blokkerer løsning for primære og sekundære antistoffer. Én plate, beregne volumet nødvendig for hver antistoff løsning basert på 50/godt og 110: 50/godt x 110 brønner = 5,5 mL. Derfor er det totale volumet av melk fortynner blokkerer løsningen som kreves for en enkelt plate analysen 33 mL.
      4. Legge til 200 /well blokkerer løsning. Inkuber plate ved romtemperatur (RT) for 30 min. Forkast løsningen ved å forsiktig snu platen og blot på absorberende papirhåndkle.
      5. Forberede 1:500 geit X RSV antistoff (mAb-primære antistoff) fortynnet i blokkering løsning. Legg til 50 /well mAb løsningen og ruge ved 37 ° C i 1 h. vask plate 3 ganger med filtrerte PBS-polysorbat.
      6. Forberede 1:5,000 Alexa-Fluor esel anti-geit IgG (sekundær antistoff) fortynnet i blokkering løsning. Legg til 50 /well av sekundære antistoff løsningen og ruge ved 37 ° C i 1 h. vask plate 5 ganger med filtrerte PBS-polysorbat.
      7. Les plate på en automatisert flekker leser bruker fluorescein isothiocyanate (FITC) kanalen og telle innstillingene som vist i figur 2. Pakk plate i folie og lagre på 4 ° C. Kalibrere maskinen bruker en ubrukt 96-brønns kultur plate og innrykker antall innstillingene før analysen.
        Merk: Ny skanning innen få dager er mulig hvis nødvendig. Kalibreringen og antall innstillingen kan lagres og brukes for fremtidige skanning hvis analysen bruker samme type platen brukes for kalibrering.
      8. Se bilder av brønner for gjenstanden plaketter eller forstyrret celle monolayers (Figur 3). Ekskludere brønner med forstyrret celle monolayers.
        Merk: Avhengig av gjenstanden plaketter, manuell teller må utføres for disse brønnene eller de brønnene må forkastes fra dataanalyse. Kriterier for et gyldig resultat inkluderer ingen forstyrret celle monolayer eller gjenstanden plaketter oppdaget i flere replikere godt og ingen PFU oppdaget i negativ brønner (wells uten ekstra virus).
    2. Bestemme viral konsentrasjoner
      1. Velg de to siste fortynninger der flekker kan telles klart. Beregne gjennomsnittlig antall flekker fra Repliker brønner på samme fortynning. Beregn den viral titer (PFU per mL) på lager utvalget ved hjelp av formelen nedenfor:
        PFU/mL = gjennomsnittlig antall plaketter / (fortynning faktor × volumet av utvannet virus lagt til brønnen)
        Merk: Virus konsentrasjonen fastsatt for hver RSV aksje kan nå brukes i PRN analysen (trinn 2).

2. RSV nøytralisering analysen

  1. Såing plater (dag 1)
    1. Resuspend A549 celler i DMEM + 10% FCS + 1000 IU penn/strep på 4 x 105/mL. Frø 96-brønns flat bunn sterilt plater med 100 μL/godt som inneholder 4 x 104 A459 celler og ruge plater overnatting på 37 ° C, 5% CO2 (celler blir i logg-fase vekst).
      Merk: Bruk ny A549 celle medisinglass etter 23 passasjer. Det anbefales ikke å bruke A549 celler før passering nummer 3.
  2. Virus og serum forberedelse (dag 2)
    Merk: Avhengig utvalg finnes det nødvendige trinn for pre-prosessering prøver før NAb analysen. Det anbefales å bruke de RSV internasjonale standard sera som nå er tilgjengelig på forespørsel fra National Institute for Biological standarder og kontroller (NIBSC).
    1. Utarbeidelse av serum fortynning
      1. Tine den menneskelige RSV referanse antiserum (referanse serum, REF) og serum test prøver på RT. varme-Deaktiver serumprøver og referanse antiserum i et vannbad ved 56 ° C i 30 min før bruk. Forberede fortynninger som malen plate (Figur 4).
      2. Forberede 1: 100 fortynning av REF. Forbered minst 110 μL REF fortynnet i DMEM + penn/strep uten FCS per analysen plate (f.eks, 1,5 μL REF i et totalt volum på 150 μL). Legge til 110 μL av 1: 100 utvannet REF i godt A12 til 96-brønns U-bunn sterilt plate.
      3. Legge til 55 μL DMEM + penn/strep uten FCS brønner B12 til H12 i kolonnen 12. Utføre føljetong 1:2 fortynninger ned platen ved å overføre 55 μL fra rad A raden B, blande løsning av pipettering innholdet opp og ned 5 ganger og fortsetter til p H. forkaste de siste 55 μL media slik at det siste bindet i hver vel er 55 μL. Bruk nye tips for hver fortynning.
      4. Forberede 1: 100 fortynning av serum test prøver. Som alle serumprøver er assayed i tre eksemplarer, forberede et minimum volum 110 μL/godt x 3 = 330 μL per serum testprøven.
      5. Tilsett 110 μL av hver utvannet serum testprøven (1: 100; S1 = serum 1, S2 = serum 2, etc.) tilsvarende brønner A1 A9 og også E1 til E9 av 96-brønns sterilt plate ifølge Figur 4.
      6. Legge til 55 μL DMEM + penn/strep uten FCS alle brønner merket X. utføre føljetong 1:2 fortynninger per trinn 2.2.1.3 til rad D (for prøvene 1, 2 og 3). Kast den siste 55 μL media slik at det siste bindet i hver brønn er 55 μL. Likeledes utføre fortsettelsene 1:2 fortynninger for prøver 4, 5 og 6 for rader E H.
        Merk: Det er viktig å bruke nye tips for hver fortynning.
      7. Legge til 55 μL DMEM + penn/strep uten FCS brønner i kolonner 10 og 11.
    2. Utarbeidelse av virus
      1. Raskt tine enkelt frosne ampuller med RSV i et 37 ° C vannbad til nesten helt Tint og sted umiddelbart på is.
      2. Fortynne virus i DMEM + penn/strep uten FCS basert på konsentrasjonen av RSV aliquot i trinn 1.3.2. Bruke en fortynning som gir ca 200 PFU/godt. Forberede et totalt volum på 5,5 mL (100 wells).
    3. Utarbeidelse av virus-serum blanding
      1. Legge til 55 av utvannet viruset i alle kolonner 1-9 og førte rader eh kolonner 10 og 11 (positiv kontroll) etter malen plate (Figur 4).
      2. Legge til 55 DMEM + penn/strep uten FCS alle brønnene rader A-D av kolonner 10 og 11 (negativ kontroll). Inkuber platen i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
    4. Virus vaksinering A549 celler
      1. Før ferdigstillelse av inkubasjonstiden, hente A549 cell plate(s) i trinn 2.1.1. Kontroller at A549 celle monolayers i 96-brønnen platene er ~ 80% confluent.
      2. Kast media forsiktig invertere plate og lett blotting på sterilt absorberende papirhåndkle. Vask alle brønner med 100 μL PBS to ganger, kaste overflødig PBS forsiktig invertere plate og lett blotting på sterilt absorberende papirhåndkle etter hver vask. Tillat ikke plater tørke.
      3. Overføre 100 /well av virus-serum blandingen til tilsvarende brønnene på A549 celle platen etter malen plate Incubate platen i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
      4. Etter 1 h, bruker en pipette, ta 90/godt og legge prewarmed 100 1 x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + penn/strep. Inkuber plate for 3 dager på 37 ° C, 5% CO2.
        Merk: Kontroller at løsningen er varmet på 37 ° C før du legger til plater.
  3. Utvikle analysen plate og analyse (dag 5)
    1. Utvikle fiksering og analysen plate følgende 1.3.1.1 til 1.3.1.8.
    2. Fastslå 50% nøytralisering titer
      1. Fastslå 50% nøytralisering titer ved å beregne proporsjonale avstanden mellom de gjensidige serum fortynninger over og under 50% av kontrollen 'ingen serum' brønner (positiv virus kontroll - kolonne 10, rader eh).
      2. Antall PFU (dvs., plaketter) som oppstår fra personlige virusinfeksjoner i serum og ingen serum kontroll førte. Beregne gjennomsnittlig antall PFU av ingen serum kontroll og bestemme 50%.
      3. Identifisere serum fortynninger med teller som er umiddelbart over og under 50% verdien av ingen serum kontroll. Bruker en semi logge grafen eller regnearkmal, tegne antall PFU på x-aksen (lineær skala) og gjensidige serum fortynning på y-aksen (Logg10 skala). Tegne en linje mellom to punkt og lese de 50% nøytralisering titers av testen serumprøver fra denne linjen.
        Merk: RSV PRN analysen regnearket (Supplerende regneark) brukes til å fastslå 50% nøytralisering titer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et virus lager Serine var utføres fra 1:10 til 1:108 fortynning å bestemme virus lager konsentrasjonen før PRN analysen (representant resultater som vist i figur 5). Figur 5, PFU kan telles pålitelig på fortynninger av 1:104 og 1:105. Gjennomsnittlig antall PFU fra tre eksemplarer brønner på samme fortynning ble beregnet. Siden gjennomsnittlig antall flekker på 1:105 fortynning var 14, identifiserte det viral titer av denne virus lager som følger:

14 (gjennomsnittlig antall flekker) / [10-5 (fortynning) x 0,1 mL (antall inoculum)] = 1.4 x 107 PFU/mL

Bruker ovenfor beskrevet metoden, vi har målt NAbs for både RSV-A og B i prøver fra mennesker. Figur 6 viser tolkningen av godt bilder av tre representant serumprøver med varierende NAb titers mot RSV-A. Figur 6A viser også bilder av prøven titrering replikerer for hver representant serum (faktisk analysen platen hadde tre tekniske gjentak). Serum fortynninger som indikert er forskjellig for hvert utvalg. Virus kontroll brønner som inneholder bare virus og ingen serum hadde gjennomsnittlig PFU beregnes og brukes til å fastslå 50% nøytralisering cut-off, som i dette eksemplet var 52. Figur 6B illustrerer hvor titrering av de tre sera var bestemmes ved hjelp av denne cut-off. Logg2 resiprok verdi av serum fortynning tegnes inn på x-aksen og antall PFU som en prosentandel av kontroll på y-aksen. Symbol og feilfelt representerer gjennomsnittet av triplicates ± standardavvik. Femti prosent av den gjennomsnittlige flekker i virus-kontroll brønnene (angitt med den vannrette stiplede linjen) ble brukt som et cut-off for å fastslå 50% nøytralisere antistoff titer i en serum utvalg. Den nøytraliserende antistoff titer er definert som resiproke av fortynning som vil resultere i 50% hemming av virusaktivitet.

Som hvert eksperiment inkluderer RSV referanse antiserum og positiv virus kontroll brønner, gir overvåking variasjon mellom analysen kvalitetskontroll mellom eksperimenter. Figur 7 viser resultatet av RSV-A PRN analysen i to forskjellige voksen kohorter fra Gambia kohort (N = 21)10 og friske frivillige i Melbourne (N = 36). Titers av RSV NAb var variabel i hver befolkningen, med de Gambian voksne har en lavere gjennomsnittlig NAb titer forhold til Melbourne voksne. RSV referanse antiserum vises også (N = 52 gjentak), viser svært lav variasjon med en variasjonskoeffisienten (CV) på 6.82%.

Figure 1
Figur 1: Viral titrering plate oppsett for kvantifisering av RSV aksjer. v = lager av RSV virus (v1, aksje av viral satsvise 1 v2, aksje av viral satsvise 2; v3, aksje av viral satsvise 3), N = negativ kontroll Vel, X = media lagt. Fargekoding er bare å hjelpe visualisering av platen oppsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempel teller innstillingene som brukes for flekker leseren. Skjermbilde av parameterne som vanligvis brukes for å telle virus plaketter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempler på gjenstanden og forstyrret celle monolayers. (A) gjenstander. (B) forstyrret celle monolayers. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Plate mal for RSV PRN analysen. V = viral positiv kontroll brønner, N = negativ kontroll brønner, X = media lagt, S = referanse antiserum med alle fortynninger (fra 1: 100 til 1:12, 800) i kolonnen 12. Fargekoding er bare å hjelpe visualisering av platen oppsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: et eksempel på en RSV viral titrering resultat. Representant brønner fra analysen utført i tre eksemplarer vises. Tallene i hver brønn se antall plaketter telles med flekker leseren. TMC = for mange til å telle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: resultater fra en representant RSV PRN analysen. (A) antall PFU telles for tre individuelle serumprøver etter ulike fortynning områder. Tallene i hvert godt bilde se antall plaketter telles. (B) NAb titer tolkning fra godt bilder i panelet A de tre representant koagulasjon. Dataene beregnes på grunnlag av 50% cut-off fra virus kontroll brønnene. Vannrette stolper representerer gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: RSV nøytralisere antistoff titers i Melbourne (N = 21) og Gambian (N = 36) voksne. Menneskelige RSV referanse serum vises også for sammenligning (N = 52 gjentak). Symboler representerer personlige titers og vannrette stolper representerer geometriske gjennomsnittet titer ± 95% CI. N = 52 resultatene er basert på tre teknikere over en to måneders periode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure S1
Supplerende figur 1: sammenligning av NAb titers for RSV-A. (Venstre) NAb titers beregnes ved hjelp av den lineære og ikke-lineær regresjon modeller (N = 152 analyser). (Høyre) Sammenhengen mellom RSV-A NAb titers bruker både lineære og ikke-lineær regresjon modeller. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utviklet og optimalisert en enkel og effektiv RSV mikro-nøytralisering analysen som lett kan tilpasses i de fleste laboratorier. Denne analysen er kjøpedyktig mål virusinfeksjon evne samt måle hemming av viral infeksjon av NAb på cellenivå ved hjelp av datastyrt bildeskanning. Bruk av en imaging-basert plattform og spesifikke antistoffer-baserte systemer har økt spesifisitet og følsomhet av spot sammenlignet med tradisjonelle plakk gjenkjenning metoder6,7. Dette gir karakteristikk av RSV påkjenningen med lav infectivity og gir også en nøyaktig kvantifisering RSV konsentrasjon før å bruke i PRN analysen.

Det anbefales at den samme gruppen av viral lager brukes for hver studie for å minimere alle parti til parti variasjoner mellom RSV aksjer. Andre viktige aspekter av analysen omfatter konsistensen av virus input konsentrasjon, integriteten til A549 celle monolayer, og bruker samme antall innstillingene slik analysen konsistens og nøyaktighet. Mengden av virus lagt til platen kan bekreftes igjen i en egen plakk viral titrering. Men overvåking positiv kontroll brønnene til PRN analysen også gir en indikasjon på faktiske viral titer og er også verdt å overvåke over analyser. Videre, inkludert referanse serum hver tallerken er en annen kvalitetskontroll mål å sikre at analyser er reproduserbare. Vår eksperimenter brukte ikke den nylig godkjente RSV internasjonale standard antiserum fra NIBSC, som det ikke var tilgjengelig ved vår studie11. Bruke denne RSV internasjonale standard antiserum bør anbefales for fremtidige studier måle RSV NAb slik at resultatene over laboratorier kan sammenlignes med tillit.

Utvikling av en relativt enkel, høy gjennomstrømming analysen vil lette global standardisering innsats for bruk av RSV NAbs som mer laboratorier over hele verden kunne bruke denne metoden. Dette er spesielt viktig gitt antall RSV vaksine kandidater i utvikling, med noen i forsøk fase 3. Det er viktig at resultatene av fremtidige kliniske studier av RSV vaksiner være sammenlignbare, og derfor en standardisert analysen representerer et viktig aspekt til dette målet. Mens en rekke lav og middels inntekt land ikke kanskje direkte støtte anskaffelse av utstyr nødvendig, sammenhengene via internasjonale samarbeid og/eller kapasitetsbygging programmer vil være avgjørende over mellomlang til lang sikt.

Denne NAb analysen protokollen er fleksibel kan tilpasses for ulike linjer (A549, Hep2 og Vero) og kan brukes for ulike RSV stammer. Vi har også tilpasset denne metoden for RSV-B vellykket. Som analysen plattformen har blitt utviklet for en 96-brønns plate format, dette gir en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømming alternativ med høy nøyaktighet fordi det tillater mer gjentak og inkludering av serum Referansekontrollen og negativ kontroll på hver plate. Bruker samme serum Referansekontrollen er også anbefalt som dette er avgjørende for å sikre kvalitetskontroll og kvalitetssikring. I våre hender observerte vi svært lav CVs på 6.82% for referanse serum som er mye lavere enn rapportert CVs for andre biologiske metoder i størrelsesorden 30-40%5.

Videre kan bildedataene og telle data (rådata) generert fra denne protokollen lagres på ubestemt tid for fremtidig referanse og/eller analyse. Opprettholde poster med rådata er en viktig forutsetning for kliniske studier, spesielt de som involverer fremtidige RSV vaksiner. Våre regneark (se Utfyllende regneark) foreslått i denne protokollen kan bidra til å registrere alle aspektene av eksperimentet for kvalitetskontroll og forsikring kontroll. Regnearket inneholder beregningen av 50% nøytralisere titer bruker en enkel lineær modell som dette har fordelen av ikke krever noen spesialisert programvare. Imidlertid kan rådata fra våre NAb analysen analyseres ved hjelp av ikke-lineær regresjonsmodell som også har blitt brukt i vaksinen forskning for beregning av 50% nøytraliserende titers, men dette krever andre programvare pakker12,13 . Bruker vår eksperimentelle data, resultatene som oppnås med disse to metodene var lik, gir tillit til titer verdier Hentet ved hjelp av forenklet lineær modell (se utfyllende figur 1). Kostnaden for å sette opp denne analysen er rimelig for mange laboratorier med kanskje det dyreste elementet som flekker leseren (ca USD $50K). Men har flekker leseren fordelen av å kunne brukes for andre programmer som de enzym-koblede immunospot (ELISpot) for cytokin og/eller antistoff-sekresjon celle måling, noe som gjør den en verdifull komponent vaksine prøvelsen bedømmelse.

Avslutningsvis denne forbedret, høy gjennomstrømming RSV PRN analysen kan enkelt implementeres i mange laboratorier og støtter internasjonal harmonisering innsats som for RSV NAb analyser. Dette vil være avgjørende for vurdering av romanen RSV vaksine kandidater i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker alle deltakerne er involvert. Vi erkjenner den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtteprogrammet. PVL er en NHMRC karriere utvikling Fellowship-mottaker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line
A549 ATCC CCL-185 provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2 ATCC VR-1540 lot number 60430286
Reagents
Acetone Merck 1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) Life Technologies A11055
CMC sodium salt powder Sigma-Aldrich C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) Interpath SFBS-F
Goat X RSV antibody Merck AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) BEI Resources NR-4022 Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder Life Technologies 31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) Australian Biosearch 50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) Life Technologies 15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser Merck In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate Sigma-Aldrich 9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL) Invitro Technologies FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL) Thermo Fisher NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) Australia PL AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) Interpath 655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid) Interpath 650180
5 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4487-200EA
10 mL serological pipette Interpath 607180
25 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 Fisher Biotec TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 Fisher Biotec TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0 AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Tags

Medisin problemet 143 Respiratory syncytial virus nøytralisere antistoff antistoff plakk reduksjon smittsomme sykdommer standardisering
En forbedret og høy gjennomstrømning respiratorisk Syncytial Virus (RSV) mikro-nøytralisering analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz,… More

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz, J., Anderson, J., Ong, D. S., Chappell, K., Mulholland, K., Licciardi, P. V. An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (143), e59025, doi:10.3791/59025 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter