Summary
Cette étude décrit un haut débit, essai micro-neutralisation d’imagerie afin de déterminer le titre des anticorps neutralisants spécifiques pour le virus respiratoire syncytial (VRS). Ce format de test a été testé sur les types d’échantillons différents.
Abstract
Respiratoires syncytiales virus spécifique des anticorps neutralisants (RSV NAbs) sont un marqueur important de protection contre la RSV. Un certain nombre de formats différents test est actuellement utilisées dans le monde y a donc un besoin d’une méthode précise et haut-débit pour mesurer la RSV NAbs. Nous décrivons ici une analyse micro-neutralisation axée sur l’imagerie qui a été testée sur le sous-groupe RSV A et peut également être adaptée pour la RSV sous-groupe B et types d’échantillons différents. Cette méthode est très reproductible, avec des variations entre dosages pour l’antisérum de référence est inférieur à 10 %. Nous croyons que ce dosage peut être facilement établi dans de nombreux laboratoires dans le monde entier à un coût relativement faible. Développement d’un test amélioré et à haut débit qui mesure RSV NAbs représente une avancée significative pour la normalisation de cette méthode au niveau international comme étant critiques pour l’évaluation des nouveaux vaccins RSV à l’avenir.
Introduction
Virus respiratoire syncytial (VRS) est la principale cause des infections des voies respiratoires basses dans la population pédiatrique dans le monde1. Malgré son poids élevé, il n’existe encore aucun vaccin ou traitement. Depuis 2013, l’organisation mondiale de la santé (OMS) a déclaré au point de vaccins RSV comme une priorité de recherche majeur, avec des réunions de la consultation de WHO annuel2,3. L’OMS a convenu sur l’utilisation de RSV neutralisant la mesure des anticorps (NAb) pour surveiller l’immunogénicité des vaccins, comme cela est reconnu comme le marqueur sérologique majeur de protection4. NAbs auraient dû être divulgués pour se protéger contre l’infection à VRS grave dans un certain nombre d’études ainsi que des essais cliniques de l’anticorps monoclonal anti-VRS palivizumab, actuellement la stratégie prophylactique uniquement disponible4.
Il existe plusieurs formats de dosage de NAb utilisées par les laboratoires dans le monde entier, y compris des analyses cellulaires et moléculaires, qui ont fait des efforts de normalisation difficile5,6,7,8. Cependant, le test de neutralisation (PRN) de plaque-réduction conventionnels qui mesure le nombre de plaque réduite formant des unités (PFU) par la présence d’un anticorps spécifique au RSV demeure l' étalon-or9. Nous rapportons ici un protocole PRN amélioré, simplifié et haut débit qui peut être utilisé sur nombreuses lignées cellulaires, pour différentes souches de RSV et avec un débit accru de dosage. Ce protocole a été testé à l’aide d’échantillons cliniques de différents paramètres, ainsi que sur des échantillons provenant des expériences de modèle animal.
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Protocol
Remarque : Toutes les mesures doivent être effectuées sous une hotte BSL2 à moins d’indication contraire. Titrage viral est requis avant un test PRN pour déterminer la concentration optimale de RSV, utilisée dans l’essai de PRN. Il est recommandé de la partie aliquote les stocks de virus dans un petit volume qui sera décongelé une fois et utilisés pour chaque dosage NAb. À l’aide de la même souche virale pour toutes les analyses de NAb exécutées pour tous les échantillons provenant d’une étude est également recommandée. Veillez à ce que les milieux de culture et de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est chauffé à 37 ° C avant d’ajouter aux plaques de la cellule.
1. RSV titrage Viral
Remarque : Selon le nombre de stocks de virus et le nombre de doublons, la plaque de test peut être configurée selon la Figure 1. Chaque stock de virus devrait être titré en trois exemplaires vers le bas de la plaque d’essai, à partir de la plus forte concentration virale (par exemple, 01:10). Titrages de série peuvent être généralement 01:10. Culture de cellules A549 et entretien ainsi que mise en culture RSV est effectuée à l’aide de procédures standards et ne sont pas inclus dans le présent protocole.
- Plaques de semis (1 jour)
- Remettre en suspension les cellules A549 de Dulbecco milieu modifié Eagles (DMEM) + 10 % de sérum de veau foetal (FCS) + 1000IU pénicilline/streptomycine (stylo/strep) à 4 x 105/ml. Graine de 96 puits à fond plat plaques stériles avec 100 μL/puits contenant des cellules de 4 x 104 A459.
- Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 (cellules seront dans la croissance de la phase logarithmique).
Remarque : Utilisez le nouveau flacon de cellules A549 après 23 passages. Il est recommandé de ne pas commencer les expériences quand un nouveau flacon de cellule est toujours dans les trois premiers passages.
- Infection par le virus (jour 2)
- Préparation des dilutions de virus
- Rapidement décongeler un seul flacon congelé du VRS dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que presque complètement décongelés et placer immédiatement sur la glace. Préparer 3 répétitions pour chaque RSV stock de virus à être dosés, utiliser une dilution de stock de virus initial de 01:10 avec 100 μL de virus/bien dilué et réserver au moins une colonne de contrôle négatif.
Remarque : Figure 1 illustre le contrôle négatif en géométrie. - Ajouter 100 μL de chaque virus dilué à 01:10 en trois exemplaires de la ligne A du 96 puits U fond plaque stérile. Ajouter 90 μL/puits de DMEM + 1000IU stylo/strep sans FCS aux lignes B à H.
- Effectuer la série 01:10 dilutions vers le bas de la plaque en transférant 10 μL de la ligne A au rang de solution B. Mix de pipetage contenu et descendre 5 fois et continuer les dilutions dix fois jusqu’en ligne H. jeter la finale 10 μL afin que chacun le volume final est bien 90 μL.
Remarque : Il est important d’utiliser de nouvelles astuces pour chaque dilution.
- Rapidement décongeler un seul flacon congelé du VRS dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que presque complètement décongelés et placer immédiatement sur la glace. Préparer 3 répétitions pour chaque RSV stock de virus à être dosés, utiliser une dilution de stock de virus initial de 01:10 avec 100 μL de virus/bien dilué et réserver au moins une colonne de contrôle négatif.
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Inoculation du virus aux cellules A549
- Récupérer cell plate(s) A549 préparé la veille. S’assurer que les monocouches de cellules A549 dans les plaques de 96 puits sont ~ 80 % anastomosé. Jeter les médias en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile.
- Laver tous les puits avec 100 μl de PBS, jeter les excès PBS en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile après chaque lavage. Ne pas laisser les plaques sécher.
- Transférer les dilutions de virus de la plaque de titrage viral (Figure 1) aux puits correspondants sur la plaque de cellules A549. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2. Après 1 h d’incubation, décanter le surnageant à l’aide d’une pipette (pour éviter la contamination croisée). Retirer 90 μL/puits.
- Ajouter 100 μl de milieu 1 x 199 (M199, voir Table des matières) + 1,5 % sel de sodium carboxyméthylcellulose (CMC) faible viscosité + 2 % FCS contenant pen/strep dans chaque puits.
NOTE : 2 x M199 + FCS 4 % + 2 % plume/strep et solutions de CMC 3 % doivent être préparées à l’avance et conservés à 4 ° C pour une utilisation future. Assurez-vous que la solution est chauffée à 37 ° C avant d’ajouter aux plaques.- Préparer la solution de x M199 2 : 1 sachet/500 mL eau distillée, eau + 20 mL FCS + 10 mL stylo/strep (compenser 2 x MI99). Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Pour la préparation de 3 % de MCC, ajouter 15 g de CMC lentement dans 500 mL d’eau distillée. Dissoudre le MCC dans l’eau à l’aide de radiateur agitateur métallique à 50 ° C, ce qui prend environ 1 h de préparation. Mélanger bien pour faire 3 % CMC et stériliser la solution.
Remarque : Le CMC solid doit être ajouté à l’eau afin d’être dissoute ; ajouter de l’eau à la solide sec produit un « bouquet » de solide qui est très difficile à dissoudre. - Préparer 1 x M199 + faible viscosité CMC 1,5 % + 2 % FCS contenant pen/strep en mélangeant 1:1 le 2 x M199 et 3 % CMC établie à l’étape 1.2.2.4.2.
- Incuber les plaques pendant 3 jours à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Préparation des dilutions de virus
- Développement de la plaque de test et d’analyse (jour 5)
- Fixation et plaque de test en développement
- Jetez M199 + MCC + 2 % FCS stylo contenant/strep en retournant délicatement la plaque. Ajouter lentement (afin d’éviter de perturber la couche de cellules) 200 μL de tampon de fixation (80 % d’acétone, PBS de 20 %, conservés à-20 ° C) pour fixer les cellules. Incuber à-20 ° C pendant 20 min.
- Jeter le tampon de fixation et éponger doucement sur la serviette de papier absorbant. Laisser le visage de la plaque vers le bas pour sécher pendant 10 min.
Remarque : De partir de cette étape, essai peut être effectué à l’extérieur de la hotte BSL2. - Préparer le solution blocage diluant dans du PBS filtrée contenant 0,05 % de 5 % lait polysorbate 20 (PBS-polysorbate, voir Table des matières). Pour une plaque, calculer le volume nécessaire pour blocage basé sur 200/puits et 110 puits : 200/puits x 110 puits = 22 mL (1,1 mL concentré de lait diluant à 20,9 mL filtrés PBS-polysorbate). À ce stade, composent aussi solution de blocage suffisante pour des anticorps primaires et secondaires. Pour une plaque, calculer le volume nécessaire pour chaque solution d’anticorps issue des puits/50 et 110 : 110 puits x 50/bien = 5,5 mL. Par conséquent, le volume total de lait diluant bloquant la solution requise pour un dosage Monodisque est 33 mL.
- Ajouter 200 /well de solution de saturation. Incuber plaque à température ambiante (RT) pendant 30 min. jetez la solution en retournant délicatement la plaque et sécher sur une serviette de papier absorbant.
- Préparer des anticorps de chèvre X VRS de 1/500 (mAb-anticorps primaire) dilué en bloquant la solution. Ajouter 50 /well de la solution de mAb et incuber à 37 ° C pendant 1 h. plaque de lavage 3 fois avec PBS-polysorbate filtrée.
- Préparer l’âne d’Alexa Fluor 1:5,000 anti-chèvre IgG (anticorps secondaire) dilué en bloquant la solution. Ajouter 50 /well de la solution d’anticorps secondaire et incuber à 37 ° C pendant 1 h. plaque de lavage 5 fois avec PBS-polysorbate filtrée.
- Lire la plaque sur un lecteur de taches automatisées en utilisant le canal de fluorescéine isothiocyanate (FITC) et compter les paramètres, comme illustré à la Figure 2. Enrouler la plaque au fleuret et conserver à 4 ° C. Calibrer l’appareil à l’aide d’une plaque de culture de 96 puits inutilisé et saisie des paramètres de compte avant le dosage.
Remarque : Re-scanner dans les prochains jours est possible si nécessaire. L’étalonnage et le réglage du comte peuvent être enregistrés et utilisés pour la numérisation future si le test utilise le même type de plaque utilisée pour l’étalonnage. - Vérifier les images des puits pour plaques d’artefact ou monocouches de cellules perturbé (Figure 3). Exclure les puits avec les monocouches de cellules perturbées.
Remarque : Selon la taille des plaques artefact, comptages manuels peuvent doivent être effectuées pour ces puits ou ces puits pourraient devoir être rejetées par l’analyse des données. Critères pour un résultat valide comprennent les plaques monocouche ou artefact aucune cellule perturbé détectés dans plus d’une réplique bien et aucun PFU détecté en négatifs puits (puits sans virus ajouté).
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Déterminer les concentrations virales
- Choisissez les deux dernières dilutions où les taches peuvent être comptées clairement. Calculer le nombre moyen de taches de puits répétées à la même dilution. Calculer le titre viral (UFP / mL) de l’exemple stock, en utilisant la formule ci-dessous :
UFP/mL = nombre moyen de plaques / (Volume de virus dilué × facteur de Dilution ajoutée au puits)
NOTE : La concentration de virus déterminée pour chaque stock RSV peut maintenant servir dans le dosage de la PRN (étape 2).
- Choisissez les deux dernières dilutions où les taches peuvent être comptées clairement. Calculer le nombre moyen de taches de puits répétées à la même dilution. Calculer le titre viral (UFP / mL) de l’exemple stock, en utilisant la formule ci-dessous :
- Fixation et plaque de test en développement
2. RSV neutralisation Assay
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Plaques de semis (1 jour)
- Remettre en suspension les cellules A549 DMEM + 10 % FCS + 1000IU stylo/strep à 4 x 105/ml. Plaques de stériles semences 96 puits à fond plat avec 100 μL/puits contenant 4 x 104 A459 cellules et incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 (cellules seront dans la croissance de la phase logarithmique).
Remarque : Utilisez le nouveau flacon de cellules A549 après 23 passages. Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules A549 avant numéro de passage 3.
- Remettre en suspension les cellules A549 DMEM + 10 % FCS + 1000IU stylo/strep à 4 x 105/ml. Plaques de stériles semences 96 puits à fond plat avec 100 μL/puits contenant 4 x 104 A459 cellules et incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 (cellules seront dans la croissance de la phase logarithmique).
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Préparation de virus et de sérum (jour 2)
Remarque : Selon le type de l’échantillon, il y a des étapes requises pour le pré-traitement des échantillons avant le dosage de la NAb. Il est recommandé d’utiliser le sérum standard international RSV qui sont maintenant disponible sur demande de l’Institut National Biological Standards and Controls (NIBSC).-
Préparation de la dilution du sérum
- Décongeler l’antisérum de référence RSV humain (sérum de référence, REF) et sérum tester des échantillons à inactiver les Heat RT.-des échantillons de sérum et référencer l’antisérum dans un bain d’eau à 56 ° C pendant 30 min avant de l’utiliser. Préparer des dilutions selon le modèle de la plaque (Figure 4).
- Dilution au 1/100 de la préparation de la réf. du préparer un minimum de 110 μL de REF dilué dans DMEM + stylo/strep sans FCS par plaque de test (par exemple, 1,5 μL de REF dans un volume total de 150 μL). Ajouter 110 μL de 1/100 dilué REF dans bien A12 de 96 puits U fond plaque stérile.
- Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/strep sans FCS aux puits B12 à H12 dans la colonne 12. Effectuer série des dilutions de 1:2 vers le bas de la plaque de transfert μL 55 entre ligne A et ligne B, solution de mélange de pipetage contenu et descendre 5 fois et continuant jusqu'à ligne H. jeter le μL 55 final des médias afin que chacun le volume final est bien 55 μL. Utilisez les nouvelles astuces pour chaque dilution.
- Préparer au 1/100 dilution du sérum échantillons essayés. Comme tous les échantillons de sérum sont testés en triple exemplaire, préparer un volume minimum de 110 μL/puits x 3 = 330 μL / échantillon de sérum.
- Ajouter 110 μL de chaque échantillon de sérum dilué (1/100 ; S1 = sérum 1, S2 = sérum 2, etc..) correspondant à des puits A1 à A9 et aussi E1 à E9 de la plaque 96 puits stérile selon la Figure 4.
- Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/strep sans FCS dans toutes les loges étiquetés Perform X. série 1:2 dilutions comme par l’Etape 2.2.1.3 jusqu’au rang D (pour exemples 1, 2 et 3). Jeter le μL 55 final des médias afin que le volume final de chaque puits est 55 μL. De même, effectuer la série des dilutions de 1:2 pour les échantillons de 4, 5 et 6 pour les lignes E à H.
Remarque : Il est important d’utiliser de nouvelles astuces pour chaque dilution. - Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/strep sans FCS à Herbert George wells dans les colonnes 10 et 11.
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Préparation du virus
- Rapidement décongeler un seul flacon congelé du VRS dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que presque complètement décongelés et placer immédiatement sur la glace.
- Diluer les virus en DMEM + stylo/strep sans FCS basées sur la concentration de l’aliquote de RSV, déterminé à l’étape 1.3.2. Appliquer une dilution qui donne environ 200 PFU/puits. Préparer un volume total de 5,5 mL (pour 100 puits).
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Préparation du mélange de virus-sérum
- Ajouter 55 du virus dilué à tous les puits des colonnes 1 à 9 et les puits de lignes E-H des colonnes 10 et 11 (contrôle positif) selon le modèle de la plaque (Figure 4).
- Ajouter 55 de DMEM + stylo/strep sans FCS dans toutes les loges de lignes A-D des colonnes 10 et 11 (témoin négatif). Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
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Inoculation du virus aux cellules A549
- Avant la fin de la période d’incubation, récupérer cell plate(s) A549 préparées à l’étape 2.1.1. S’assurer que les monocouches de cellules A549 dans les plaques de 96 puits sont ~ 80 % anastomosé.
- Jeter les médias en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile. Laver tous les puits avec 100 μl de PBS, jeter les excès PBS en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile après chaque lavage. Ne pas laisser les plaques sécher.
- Transférer 100 /well du mélange virus-sérum dans les puits correspondants sur la plaque de cellules A549 suivant le modèle de plaque incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Après que 1 h, à l’aide d’une pipette, sortir 90/bien et ajouter 100 de préchauffé 1 x M199 + 1,5 % MCC + 2 % FCS + stylo/strep. Incuber les plaques pendant 3 jours à 37 ° C, 5 % de CO2.
Remarque : Assurez-vous que la solution est chauffée à 37 ° C avant d’ajouter aux plaques.
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Préparation de la dilution du sérum
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Développement de la plaque de test et d’analyse (jour 5)
- Mettre la plaque de fixation et dosage suivant étapes 1.3.1.1 à 1.3.1.8.
- Déterminer le titre de neutralisation de 50 %
- Déterminer que le titre de neutralisation de 50 % en calculant la distance proportionnelle entre les dilutions du sérum réciproque ci-dessus et inférieure à 50 % du contrôle « aucun sérum » wells (contrôle positif de virus - colonne 10, lignes E-H).
- Compter le nombre de PFU (c.-à-d., plaques) dus à des infections virales dans les puits de sérum et aucun puits de contrôle sérum. Calculer le nombre moyen de PFU aucun puits contrôle sérum et déterminer la valeur de 50 %.
- Identifier les dilutions de sérum de chefs qui sont immédiatement au-dessus et au-dessous de la valeur de 50 % des aucun puits de contrôle de sérum. À l’aide d’un modèle de feuille de calcul ou en graphique semi-logarithmique, tracer le nombre de PFU sur l’axe des abscisses (échelle linéaire) et la dilution du sérum réciproque sur l’axe des ordonnées (échelle10 log). Tracer une ligne entre deux points et lire les titres de neutralisation de 50 % de l’essai des échantillons de sérum de cette ligne.
Remarque : La feuille de test RSV PRN (Feuille de calcul complémentaire) est utilisée pour déterminer le titre de neutralisation de 50 %.
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Representative Results
Le titrage d’un stock de virus a été réalisé à partir de 01:10 à 01:108 dilution pour déterminer la concentration de virus stock avant l’essai PRN (résultats représentatifs illustrés à la Figure 5). De la Figure 5, PFU peut compter sûrement à des dilutions de 01:104 et 01:105. Le nombre moyen de PFU de puits en triple à la même dilution a été calculé. Depuis le nombre moyen de taches à 01:10 dilution5 a 14, le titre viral de ce stock viral a été déterminé comme suit :
14 (nombre moyen de taches) / [10-5 (dilution) x 0,1 mL (volume d’inoculum)] = 1,4 x 107 UFP/mL
En utilisant ce qui précède décrit la méthode, nous avons mesuré les NAbs pour les deux RSV-A et B dans des échantillons humains. La figure 6 illustre l’interprétation des images bien de trois échantillons de sérum représentatif avec différents titres de NAb contre RSV-A. Figure 6 a montre bien réplique les images de titrage de l’échantillon pour chaque sérum représentatif (la plaque de test réel avait trois répétitions techniques). Les dilutions de sérum comme indiqué sont différentes pour chaque échantillon. Puits de contrôle de virus ne contenant que des virus et pas de sérum avaient leur moyenne PFU calculé et utilisé pour déterminer le seuil de 50 % neutralisation, dans cet exemple a été 52. Figure 6 b illustre comment le titrage des trois sérums a été déterminée à l’aide de cette coupure. La réciproque de2 log de la dilution de sérum est tracée sur l’axe des abscisses et le nombre de PFU sous forme de pourcentage de contrôle sur l’axe y. Symbole et erreur barres représentent la moyenne ± écart type réanalysés. Cinquante pour cent des moyennes taches dans les puits de contrôle des virus (indiqués par la ligne pointillée horizontale) a été utilisé comme un seuil pour déterminer le titre d’anticorps d’un échantillon de sérum de neutralisation de 50 %. Le titre d’anticorps neutralisants est défini comme l’inverse de la dilution qui se traduirait par 50 % d’inhibition de l’activité du virus.
Comme chaque expérience comprend les Antisera de référence RSV et les puits des témoins positifs de virus, suivi de la variabilité inter-essai fournit contrôle de la qualité entre les expériences. La figure 7 illustre les résultats de l’essai RSV-A PRN dans deux différentes cohortes adultes de la cohorte de Gambie (N = 21)10 et des volontaires sains à Melbourne (N = 36). Les titres de NAb RSV sont variable au sein de chaque population, avec les adultes Gambiens ayant un titre de NAb moyens inférieur par rapport aux adultes Melbourne. L’antisérum de référence RSV montre aussi (N = 52 répétitions), ce qui démontre une variabilité très faible avec un coefficient de variation (CV) de 6,82 %.
Figure 1 : schéma titrage Viral pour le dosage des stocks RSV. v = stock de virus RSV (v1, parc de virale lot 1 v2, stock de viral lot 2 ; v3, stock de viral lot 3), N = contrôle négatif bien, X = données ajoutées. Codage couleur est seulement à l’aide de visualisation du schéma. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : paramètres de comte exemple utilisés pour le lecteur taches. Capture d’écran des paramètres habituellement utilisés pour compter les plaques de virus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : exemples d’artefact et monocouches de cellules perturbées. (A) objets d’art. (B) Disrupted monocouches de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : modèle de plaque pour l’analyse de la RSV PRN. V = contrôle positif virale wells, N = puits témoin négatif, X = données ajoutées, S = référence antisérum avec toutes les dilutions (à partir de 1/100 à 01:12, 800) dans la colonne 12. Codage couleur est seulement à l’aide de visualisation du schéma. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : un exemple d’un résultat de titrage viral RSV. Puits de représentant d’un test effectué en trois exemplaires sont indiqués. Les numéros dans chaque puits se réfèrent au nombre de plaques compté en utilisant le lecteur de taches. TMC = trop pour les compter. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : résulte d’un dosage de RSV PRN représentatif. (A) le nombre de PFU compté pour trois échantillons de sérum individuels selon les gammes différentes de dilution. Les numéros dans chaque image bien se réfèrent au nombre de plaques comptées. (B) interprétation du titre à partir des images bien dans le groupe A pour les trois échantillons de sérum humain représentatif de NAb. Les données sont calculées sur la base de la séparation de 50 % par les puits de contrôle du virus. Barres horizontales représentent la moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : RSV neutralisant les titres d’anticorps à Melbourne (N = 21) et gambien (N = 36) adultes. Le sérum de référence RSV humain montre aussi aux fins de comparaison (N = 52 répétitions). Les symboles représentent des titres individuels et des barres horizontales représentent la moyenne géométrique titre ± 95 % CI. N = 52 résultats reposent sur trois techniciens sur une période de deux mois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : comparaison de NAb titres pour RSV-A. (Gauche) NAb titres calculées d’après les modèles de régression linéaire et non linéaire (N = 152 essais). (Droit) Corrélation entre les titres RSV-A NAb utilisant à la fois linéaire et des modèles de régression non linéaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Nous avons développé et optimisé un test de micro-neutralisation de la RSV simple et efficace qui peut être facilement adapté à la plupart des laboratoires. Ce test est capable de mesurer la capacité d’infection virale ainsi que l’inhibition de l’infection virale par NAb au niveau cellulaire à l’aide de balayage d’image informatisée de mesure. L’utilisation d’une plateforme d’imagerie et systèmes de base d’anticorps spécifiques a augmenté la spécificité et la sensibilité de détection tache par rapport à la plaque traditionnelle détection méthodes6,7. Cela permet de caractérisation du VRS souches avec faible potentiel infectieux et fournit également une quantification précise de concentration RSV avant de les utiliser dans le dosage au besoin.
Il est recommandé que le même lot de stock virale est utilisé pour chaque étude afin de minimiser toutes les variations entre les stocks de la RSV à lot. D’autres aspects importants de l’analyse comprennent la cohérence de la concentration d’entrée de virus, l’intégrité de la monocouche de cellules A549 et utilisant les mêmes paramètres de compte pour assurer l’uniformité de dosage et de précision. La quantité de virus ajoutés à la plaque peut être vérifiée à nouveau dans un titrage viral plaque séparé. Cependant, les puits de contrôle positif du test au besoin de surveillance aussi fournit une indication du titre viral réelle et est aussi utile de suivre à l’échelle des essais. Par ailleurs, y compris le sérum de référence dans chaque assiette sont une autre mesure de contrôle de la qualité pour s’assurer que les tests sont reproductibles. Nos expériences n’a pas utilisé l’antisérum de standard international récemment validé RSV de la NIBSC, car il n’était pas disponible au moment de notre étude11. En utilisant cet antisérum RSV de standard international devrait être recommandé pour de futures études mesurant RSV NAb afin que les résultats à travers des laboratoires peuvent être comparés avec confiance.
Développement d’un test relativement simple et à haut débit faciliterait les efforts de normalisation globale pour l’utilisation du RSV NAbs que plusieurs laboratoires dans le monde serait en mesure d’utiliser cette méthode. Ceci est particulièrement important étant donné le nombre de candidats vaccins RSV en développement, avec certains actuellement en essais de phase 3. Il est essentiel que les résultats des futures études cliniques des vaccins RSV comparable, et donc un test normalisé représente un aspect essentiel à cet objectif. Alors qu’un certain nombre de pays à revenu faible et intermédiaire n’est peut-être pas en mesure de soutenir directement l’acquisition de l’équipement nécessaire, liens par le biais de collaborations internationales et/ou programmes de renforcement des capacités sera essentielle à moyen et à long terme.
Ce protocole d’analyse de NAb est flexible en pouvant être adaptés aux différentes lignées cellulaires (A549, Hep2 et Vero) et peut être utilisé pour différentes souches du RSV. Nous avons également adapté cette méthode pour RSV-B avec succès. Comme la plateforme de test a été développée pour un format de plaque à 96 puits, cela fournit une alternative rentable et haut débit avec une grande précision car il permet plus de répétitions et l’inclusion de la référence sérum contrôle et le contrôle négatif sur chaque plaque. En utilisant le même contrôle de sérum de référence est également recommandée car c’est essentiel de s’assurer le contrôle de la qualité et l’assurance qualité. Dans nos mains, nous avons observé des CV très faibles de 6,82 % pour le sérum de référence qui est beaucoup plus faible que CVs rapportés pour les autres dosages biologiques de l’ordre de 30-40 %5.
En outre, les données d’image et les données de comptage (données brutes) générées à partir de ce protocole peuvent être stockées indéfiniment pour référence ultérieure ou d’analyses. Tenue de registres de données brutes est une exigence essentielle pour les essais cliniques, en particulier celles impliquant des futurs vaccins RSV. Notre feuille de calcul (voir la Feuille de calcul complémentaire) proposées dans le présent protocole peut aider à enregistrer tous les aspects de l’expérience aux fins de contrôle de la qualité et le contrôle de l’assurance. La feuille de calcul permet le calcul des 50 % neutralisant le titre à l’aide d’un modèle linéaire simple comme cela a l’avantage de ne pas nécessiter un logiciel spécialisé. Toutefois, les données brutes de notre essai de la NAb peuvent être analysées en utilisant le modèle de régression non linéaire qui a également été utilisé dans la recherche d’un vaccin pour le calcul des 50 % des titres neutralisants, même si cela exige d’autres logiciels paquets12,13 . À l’aide de nos données expérimentales, les résultats obtenus à l’aide de ces deux méthodes sont semblables, ce qui donne confiance à titre valeurs obtenues en utilisant le modèle linéaire simplifié (voir supplémentaire Figure 1). Le coût pour la mise en place de ce dosage est abordable pour de nombreux laboratoires avec peut-être l’élément plus cher étant le lecteur de taches (environ USD $50K). Cependant, le lecteur de taches a l’avantage de pouvoir être utilisé pour d’autres applications telles que l’enzyme-linked immunospot (ELISpot) pour les cytokines et/ou mesure cellules sécrétant des anticorps, ce qui en fait un élément précieux dans l’évaluation du vaccin.
En conclusion, cet essai de RSV PRN amélioré et à haut débit peut être facilement mis en œuvre dans de nombreux laboratoires et soutiendra l’effort d’harmonisation internationale de l’OMS pour des dosages de RSV NAb. Cela sera crucial pour l’évaluation des nouveaux vaccins RSV à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient tous les participants impliqués. Nous reconnaissons programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure. PVL est une NHMRC carrière développement bourse bene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
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- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
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- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
