Summary
התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.
Abstract
עצם היא רקמת חיבור היוו האוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, ו osteoclasts ו מטריצה החילוץ מינרליזציה, אשר נותן לו את כוחה וגמישות ומאפשר לו להגשים את תפקידיה. עצם הוא נחשף ברציפות למגוון של גירויים, אשר בתנאים פתולוגיים יכול deregulate העצם שיפוץ. כדי ללמוד ביולוגיה של עצם ומחלות ולהעריך את הסוכנים הטיפוליים הפוטנציאליים, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo .
כתב יד זה מתאר את תהליך הניתוח ותנאי התרבות של calvarias מבודדים מעכברי המין לחקור את היווצרות העצם ואת מיקרוסביבה הגידול בעצם. בניגוד למבחנה במודלים vivo , זה לשעבר מודל vivo מאפשר שימור של הסביבה תלת ממדית של הרקמה, כמו גם את הגיוון הסלולר של העצם תוך הימנעות תחת תנאים מוגדרים כדי לדמות את מיקרוהסביבה הרצויה. לכן, ניתן לחקור את שיפוץ העצם ואת המנגנונים שלה, כמו גם את האינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון האינטראקציות בין תאים סרטניים ועצם.
הבחני דיווחו כאן להשתמש calvarias מ 5-7 ביום הישן balb/C עכברים. המי-calvarias שהתקבלו הם מתורבתים בנוכחות של אינסולין, תאי סרטן השד (מד א-MB-231), או בינוני ממוזג מתרביות תאים של סרטן השד. לאחר הניתוח, זה הוקם כי אינסולין המושרה היווצרות העצם החדשה, בעוד תאים סרטניים המדיום הממוזג שלהם המושרה ספיגת העצם. מודל כיפת בוצע בהצלחה במחקר בסיסי ויישם כדי ללמוד פיתוח עצם ומחלות העצם המושרה בסרטן. באופן כללי, זוהי אפשרות מצוינת עבור שיטת קל, אינפורמטיבי, ובעלות נמוכה.
Introduction
עצם היא רקמת חיבור דינמית שיש לה מספר פונקציות, כולל תמיכה השרירים, הגנה על האיברים הפנימיים מח עצם, ואחסון ושחרור של סידן וגורמי גדילה1,2. כדי לשמור על שלמות ותפקוד תקין, רקמת העצם היא ברציפות תחת תהליך של שיפוץ. במונחים כלליים, מחזור של שיפוץ עצם ניתן לחלק לספיגת עצם היווצרות העצם1. חוסר איזון בין שני שלבים אלה של שיפוץ העצם יכול להוביל להתפתחות של הפתווגיות העצם. כמו כן, מחלות כגון סרטן השד משפיעים לעתים קרובות על שלמות העצם; כ 70% של חולים בשלבים מתקדמים יש או יהיה גרורות העצם. כאשר התאים סרטן השד להזין את העצמות, הם משפיעים על מטבוליזם העצם, וכתוצאה מכך ספיגת מוגזם (נגעים אוסטקלאסטיים) ו/או היווצרות (נגעים osteoblastic)3.
כדי להבין את הביולוגיה של מחלות העצם ולפתח טיפולים חדשים, יש צורך להבין את המנגנונים המעורבים בעיצוב מחדש של העצם. במחקר הסרטן, זה חיוני לחקור את התהליך גרורות העצם הקשר שלה מיקרוסביבה גרורתית. בשנת 1889, סטיבן פאג'ט שיערו כי גרורות מתרחשות כאשר יש תאימות בין תאי הגידול לבין רקמת היעד, והציע כי האתר גרורתי תלוי בזיקה של הגידול עבור מיקרוסביבה4. ב 1997, מונדי וגיז הציגו את המושג "מחזור אכזרי של גרורות העצם" כדי להסביר כיצד תאים סרטניים לשנות את מיקרוסביבה העצם כדי להשיג ההישרדות שלהם צמיחה, ואיך מיקרוסביבה העצם מקדמת את הצמיחה שלהם על ידי מתן סידן וגורמי צמיחה5,6,7.
כדי לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב העצם וגרורה, ולהעריך מולקולות בעלי פוטנציאל תרפויטי אפשרי, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo . עם זאת, מודלים אלה מציגים כיום מגבלות רבות, כגון הייצוג הפשוט של מיקרואקולוגיה העצם, והעלות שלהם8,9. התרבות של vivo העצם explants ex יש את היתרון של שמירה על ארגון תלת מימדי, כמו גם מגוון של תאי העצם. בנוסף, ניתן לשלוט בתנאים ניסיוניים. המודלים לחקור כוללים את התרבות של עצמות המסרק, ראשי הירך, calvarias, ו הלסת התחתונה או בליבת העור10. היתרונות של מודלים vivo ex הוכחו במחקרים שונים. בשנת 2009, נורסטרנד ומשתפי-פעולה דיווחו על הקמת מודל התרבות הבין-תרבותית המבוססת על האינטראקציות בין העצמות לתאי סרטן הערמונית11. גם, ב 2012, Curtin ומשתפי פעולה דיווחו על פיתוח של מודל תלת מימדי באמצעות vivo cocultures ex 12. המטרה של מודלים vivo ex לשעבר היא לשחזר את התנאים של סביבת מיקרו העצם באופן מדויק ככל האפשר כדי להיות מסוגל לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב שיפוץ נורמלי או פתולוגי בעצם ולהעריך את היעילות של הסוכנים הטיפוליים החדשים.
הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על ההליכים שפורסמו על ידי גארט13 ומחמד ואח '.14. התרבויות הcalvaria העכברים שימשו מודל ניסיוני, כפי שהם שומרים על הארכיטקטורה תלת מימדי של העצם תחת פיתוח ותאי עצם, כולל תאים בכל שלבי הבידול (כלומר, אוסטאופיות, אוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, סטרומה תאים) זה להוביל אוסטאופתיות בוגרת האוסטאופתיות, כמו גם מטריצה מינרליזציה14. המודל vivo ex אינו מייצג את התהליך הפתולוגי של מחלות העצם לחלוטין. עם זאת, השפעות על שיפוץ העצם או העצמות המושרה העצם אוסטאופוליזיס יכול להיות נמדד במדויק.
בקצרה, פרוטוקול זה כולל את השלבים הבאים: הניתוח של calvarias מ 5-7 הישן ביום עכברים, calvaria טרום תרבות, calvaria יישומי תרבות (למשל, תרבות בנוכחות של אינסולין, תאים סרטניים או בינוני ממוזג, ואפילו סוכנים עם פוטנציאל תרפויטי, על פי מטרת החקירה), קיבוע עצם וcalvaria decalcification, עיבוד רקמות, ניתוח היסטולוגית, ופרשנות התוצאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים המשמשים באותם מאמר הושגו מזנים BALB/c עכברים, באמצעות עכברים זכר ונקבה ללא אבחנה. ניסויים בתרבות הקודמת בוצעו גם באמצעות זנים אחרים, כגון fvb, עכברים שוויצריים, CD-1, ו csa עכברים11,12,14. כל העכברים שוכנו על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH), נספח ש. הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש (IACUC) במרכז למחקר מדעי והשכלה גבוהה ב אנסנאדה (CICESE).
1. ניתוח קלוריון
- לחטא מכשירים לחיתוך (g., 1 x 2 מלקחיים רקמת השיניים, מספריים כירורגי ישר, לבתר מספריים, מלקחיים בסדר מחודדות, טיפ מעוקל דק לנתח מלקחיים, לבתר מלקחיים, אזמל). מים מזוקקים סטרילי ניתן להשתמש כדי לנקות את כלים כירורגי בין כל ניתוח, וסטרילי 1x PBS ניתן להשתמש עבור ניקוי כל המי-calvaria.
- מניחים את כלי החיתוך הסטרילי, המים, הערוץ הראשון, והחומרים הדרושים לביצוע ההליך (למשל, מיקרופיפטות, משקפיים, מנות פטרי סטריליות) במכסה זרם למינארי.
הערה: בצע את ההליך כולו בתנאים סטריליים. - הוסף 12 מ ל של PBS 1 x סטרילי לתוך 2 10 ס"מ מנות פטרי.
- בחר את הגורים ומניחים אותם ליד המכסה.
הערה: לנתח את הקלוריון מ 5-7 גורים בני יום. - לאסוף ולהחזיק את העכבר בזהירות באמצעות מלקחיים מבתר.
- ערוף את ראשו של העכבר באמצעות ניתוח מספריים ומניחים את הראש בצלחת פטרי עם PBS.
הערה: עריפת ראש אינה מתאימה לעכברים ישנים יותר. אם יש לעשות את הניסוי בעכברים מבוגרים, יש לשנות את שיטת המתת החסד בהתאם לחוקי הניסויים בבעלי החיים. - החזק את הראש בחוזקה על ידי אזור האף עם 1 x 2 מלקחיים רקמת השיניים ולהסיר את העור מעל הגולגולת עד calvaria גלוי.
- זהה את התפרים (כלומר, המשונן, הקורלית והמדואיד) של הגולגולת על הcalvaria החשופה.
- חדרו עם קצה המיקרומספריים בערך 2 מ מ"מ מאחורי התפר של המדוגת והפוך לחתך ישר לצידו.
- הכנס את קצה המיקרו-מספריים. שבצד האחורי של הגולגולת לחתוך ישר לאורך הצד המרוחק של. התפר המקצץ כלפי תפר העור תמשיך באופן דומה עם. התפר השני של המדוגד
- לעשות חתך נוסף (בזווית 45 °) כדי לחבר את סוף החתך עשה עם החתך של הפונפונטיין הקדמי.
- חזור על שלבים 1.10 ו-1.11 עם התפר השני של המדואיד.
הערה: חשוב לזהות את התפרים כדי לבצע חתכים מתאימים ולהיות מסוגל לבצע הטבעה נאותה וניתוח נתונים. - השתמש מלקחיים טיפ עדין כדי להסיר את הcalvaria ולמקם אותו בצלחת פטרי. עם אזמל, הפוך את החלק הישר מפונפונטיין האחורי לאורך התפר המשונן דרך תפר הקורונולי, והסתיים בפונפונטיין הקדמי כדי להשיג שתי מוצרים של חמי-קלוריאס.
- הרימו את המי-קלוריון עם הפינצטה העדינה והניחו אותם בצלחת פטרי חדשה המכילה את ה-PBS.
2. תרבות Calvaria
- הוסף 1 מ ל של הגלוקוז גבוהה DMEM בינונית בתוספת 0.1% בסרום שור (BSA) ו 1% אנטיביוטי/antimycotic (כלומר, פניצילין ו-סטרפטומיצין) בבארות של הצלחת 24 הבאר. עם מלקחיים טיפ דק, להרים כל המי-calvaria ולמקם אותו בבאר.
הערה: הניחו את האלה מימין לקצה הקמור. - מודטה את המי-calvarias עבור 24 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- הסר את מדיום התרבות מכל באר והוסף 1 מ ל של מדיה חדשה המכילה את המתחם לבדיקה או מדיה ממוזגת מתאים אחרים.
הערה: השתמש לפחות שלושה חמי-קלוריון עבור כל קבוצת טיפולים והשתמש בפקדים חיוביים ושליליים. - במשך 7 ימים, משנה את התקשורת. כל 2-3 ימים
3. תרבות עם תאים סרטניים
- בחר צלחת פטרי עם תאים סרטניים ב 80-90% המפגש והטריזיזציה. כדי טריזיציזציה, לשטוף את התאים הסרטניים 1x באמצעות ה-PBS (5 מ"ל לכל 75 ס מ2 בקבוקון) ואחריו דגירה בתמיסה HBSS המכילה 0.05% טריפסין ו 0.53 MM edta (2 מ"ל לכל 75 ס מ2 בקבוקון).
- להעביר את ההשעיה התא לתוך 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר והשמט את הסופרנטאנט.
- השהה מחדש את הגלולה ב-2 מ ל של DMEM המכיל 2% סרום של שור עוברי (FBS) ו 1% אנטיביוטי/antimycotic. . לספור תאים חיים
- הקצאת חמי-calvarias לכל קבוצת לימוד (כלומר, השליטה השלילית וקבוצת התרבות של ה-RNA או ניתוח היסטולוגיה).
- הסר את מדיית התרבות של המי-calvarias ולהוסיף 1 mL של DMEM המכיל 2% FBS ו 1% אנטיביוטי/antimycotic בתוספת או לא בתוספת עם תאים סרטניים.
הערה: כמות התאים שיש להוסיף יכולה להשתנות בהתאם לקו התאים שנבדק. עם תאים סרטניים כמו מד א-מגה-בתים-231 או PC-3, 500,000 תאים לכל עבודה בצורה נאותה. - דגירה עבור 24 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2. להעביר כל המי-calvaria כדי באר חדשה כדי לשמור רק תאים סרטניים שדבקה לרקמת העצם.
- דגירה של 7 ימים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 ולשנות את התקשורת כל 2-3 ימים.
4. קיבעון
- חותכים את הריבועים של נייר טישו לעטוף את המי-קלוריון.
הערה: ביופסיה רפידות קצף או כמוסות פלדה עבור ביופסיות קטנות יכול לשמש גם. - השתמש ישר מלקחיים עצה בסדר כדי להרים כל המי-calvaria מן התפר משונן, מקום על נייר טישו, ולעטוף.
- הצב את המי העטוף-calvaria בתוך קלטת הטבעה בתווית.
- הצב את הקלטת לתוך מכולה עם מאגר באגירה של 10% פוספט.
- תיקון עבור 24 שעות ב -4 ° c.
5. דאלציפיקציה
- להסיר את formalin, להוסיף 1x PBS, ו מתפרעים את הרקמות עבור 30 דקות כדי לשטוף את המי-calvarias.
- הסר את ה-PBS והוסף 10% EDTA (pH = 8, 0.34 M).
הערה: ודא שהפתרון מכסה את הרקמות לחלוטין. - Decalcify הרקמות עבור 48 h ב 4 ° c.
- להיפטר פתרון EDTA ולהוסיף 1x PBS לשטוף את הרקמה.
- לאחסן את המי-calvarias ב 70% אתנול עד עיבוד היסטולוגיה.
6. עיבוד רקמה
- מייבשים את הרקמות עם סיבובים של 96% אתנול, 60 דקות (3x), ואחריו 100% אתנול, 60 מינימום (3x).
- החלף את האתנול על ידי 100% xylene, 60 דקות (3x).
- מודטה את הקלטות בשעווה פרפין, 60 דקות (2x).
7. הטבעה
- פתחו את הקלטות, הוציאו בזהירות את נייר הטישו והסירו את העטיפה מcalvaria.
- להרים כל calvaria בזהירות לערום את כל המי-calvarias מאותה קבוצה באותו אוריינטציה.
- . שים פרפין בתבנית
- לאסוף את כל המי-calvarias עם מלקחיים ולמקם אותם בתוך העובש עם תפר משונן למטה לכיוון הבסיס של העובש.
הערה: התמצאות של המי-calvarias בתבנית במהלך ההכללה היא חיונית להשגת מקטעים היסטלוגיים עקביים ותוצאות מיושנות משום שהכוונה זו תאפשר זיהוי אחורי של העצמות הקדמיות והקודקודית מהקלווריון והתפר הקורולי מסייע להערכה הכמותית. - שחררו את הלקחיים וודאו שה "נשארים במקומם.
- מניחים את הקלטת עם תווית על גבי העובש וממלאים אותו עם פרפין יותר כדי לכסות את המי-calvarias.
- הזיזו את התבניות למשטח הקריר.
8. המשך המכירה
- לקצץ 500-600 יקרומטר של תפר משונן עם microtome.
- חותכים 4 יקרומטר סעיפים עבים, ולאסוף את הסעיפים הדרושים.
- קצץ עוד 300 μm.
- לגזור ולאסוף עוד שישה 4 יקרומטר חלקים עבים.
- חתוך את הבלוק 300 יקרומטר עוד ולאסוף סעיפים נוספים.
- הר את הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
- יבש את השקופיות ב-RT.
9. צביעת מיכל
- לטבול את הסעיפים ב 100% קסילין עבור 3 דקות.
- לטבול 100% אתנול עבור 1 דקות.
- מיזוג ב-96% אתנול עבור 1 דקות.
- לטבול ב 80% אתנול עבור 1 דקות.
- לטבול 70% אתנול עבור 1 דקות.
- שטפו במים במשך 3 דקות.
- לטבול במטאוקסילין במשך 3 דקות
- שטפו במים עד שהחלק ברור.
- לטבול פתרון ליתיום פחמתי רווי עבור 10 שניות.
- שטפו במים במשך 3 דקות.
- לטבול 96% אתנול עבור 1 דקות.
- לטבול באאוזין עבור 3 דקות.
- לטבול ב 96% אתנול עבור 1 דקות.
- לטבול 100% אתנול עבור 1 דקות.
- לטבול 100% קסילן עבור 3 דקות.
- הוסף מספר בינוני להרכבה על ההרכבה לשקופית והגן עליו באמצעות שמיכות.
הערה: אתה יכול להשלים את המטאוקסיקו ואת אאוזין (H & E) הצביעת עם החומצה העמידים tartrate חומצות (מלכודת) מכתים להעריך אוסטאוקלסט ו אוסטאופוליזיס.
10. הערכה כמותית: הגדרת שטח לניתוח
- בדוק את הסעיפים תחת צריכת חשמל נמוכה (כלומר 4x) כדי לזהות את הכיוון ואת התפרים.
- הגדירו את התפר הפנימי ולזהות את משטח העצם הארוך בצד אחד ואת המשטח הקצר בצד השני.
- זהה את התפר הפנימי מתחת להגדלה של 40x, והעבר שניים או שלושה שדות אופטיים הרחק מהתפר לאורך המשטח הארוך. לכידת תמונות של אזור זה לצורך ניתוח.
- הגדירו את אזור העצם הישן. ואת אזור העצמות החדש אאוזין Y עם כתום G כתמי את העצם הישן כהה יותר מצית העצם החדש.
- מדוד את אזור העצם הכולל של העצם הישן והחדש עם תוכנת תמונה J באמצעות הכלי סף צבע. בטא את התוצאות כ-יקרומטר2.
11. ניתוח מידע
- נתח את התוצאות באמצעות תוכנה סטטיסטית. הבדלים משמעותיים בין קבוצות ניתן לקבוע באמצעות בדיקות המתאימות (למשל, מבחן לא פרמטרית מאן-וויטני U כפי שהוא עשה herel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את היווצרות העצם במודל כיפת, טיפצנו את המי-קלווריון במדיה עם או בלי 50 μg/mL של אינסולין. מקטעי רקמות היו מוכנים מוכתם עם H & E. בתנאים אלה, היסטולוגיה הראו כי השלמות המבנית של עצם הקאלוריון נשמרה ומאפשרת זיהוי של מרכיביה השונים (איור 1). הקלווריון שטופלו באינסולין הציג עלייה בכמות רקמת העצם בהשוואה לשליטה (איור 2א). ניתוח histomorphometric כמותי לאזור עובי ועצם של חמי-calvaria אישר גידול משמעותי בשני הפרמטרים ברקמות שטופלו באינסולין בהשוואה לפקד (איור 2ב). נתונים אלה מצביעים על הכדאיות של פרוטוקול מודל vivo ex להפקת תנאי היווצרות העצם.
בנוסף, מודל vivo לשעבר כיפת יכול לשמש להפקת סרטן ועצמות מיקרו בסביבה. הפרוטוקול שימש כדי להעריך את ההשפעה של תאים סרטניים בסרטן מד א-MB-231 על מורלין calvarias. כדי לבצע זאת, עצמות כיפת היו באופן ישיר מתורבת עם תאים סרטניים או תרבותי רק עם התקשורת הממוזגת של התאים הסרטניים. לאחר 7 ימים של תרבות, calvarias היו מוטבעים פרפין, ו H & E כתמים בוצע. התרבות עם התאים מד א-מגה-בתים-231 סרטן השד הופיע כדי להגדיל את האוסטאופהזיס, כפי שמוצג על ידי ירידה בעצם ואת הנזקים למבנה כיפת כאשר בהשוואה כיפת שליטה מטופח רק עם מדיה (איור 2א). באזור עצם הקוונפיקציה של calvarias הראה ירידה משמעותית באזור העצם הכולל של calvarias תרבותי עם מד א-MB-231 תאים סרטניים לעומת השליטה (איור 2B). תוצאות אלה הראו כי התרבויות של תאים סרטניים עם רקמת כיפת יכול לשחזר את סרטן ומיקרוסביבה העצם יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים של גרורות עצם אוסטאופתי או להעריך מעכבי אפשרי של תהליך זה.
איור 1: מבנה היסטולוגית של עצם הקלווריון. החלק רקמת מייצג של חמי-calvaria אחרי כתמים H & E. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: האינסולין הגביר את אזור העצמות ואת עובי הvivo לשעבר בעוד התרבות של החברה-calvarias עם מד א-MB-231 בתאי סרטן השד המושרה אוסטאופוליזיס. , למודל היווצרות העצמות המי-calvarias היו תרבותיים בנוכחות או העדר אינסולין (50 μg/mL), בעוד עבור התרבות הקוגית עם תאים סרטניים, המי-calvarias היו תרבותיים בנוכחות או היעדרות של 5 x 105 מד א-MB-231 תאים במשך 7 ימים ו ניתוח histomorphometrical בוצע על H & E מוכתם סעיפים. (א) מקטעי רקמות מייצגים. (ב) ניתוח הימסטומיטריקל של אזור העצם. התוצאות מיוצגות כממוצע ± SEM (n = 3). * P < 0.05, מבחן לא פרמטרית מאן-ויטני U. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור מודל vivo לשעבר כיפת להערכת היווצרות העצם או ספיגת וללמוד את האינטראקציות של תאים סרטניים עם עצם העכבר כיפת. הצעדים הקריטיים של טכניקה זו הם הניתוח, התרבות, ההטבעה, ו היפוסטומיטריקל אנליזה של calvarias. במהלך הניתוח של calvarias, זה חיוני לחתוך את המי-calvarias לתוך טרפז, כפי שהוא מאוד להקל על כיוון במהלך הכללת פרפין. כאשר לומדים אינטראקציות תאים סרטניים עם calvarias, חשוב להשתמש לוחות multiwell יטב כי אינם מטופלים עבור תרבות התא כדי למנוע תאים סרטניים לדבוק ולצמוח על הפלסטיק במקום העצם. במהלך הכללת הרקמה, חשוב לאוריינט בזהירות כל המי-calvaria. הם צריכים להיות ממוקמים באופן אנכי עם הגבול המשונן בצד החיצוני של בלוק פרפין. כיוון העצם חיוני להשגת מקטעים היסטלוגיים עקביים ותוצאות מועצמות. באופן דומה, הוא קריטי לעקביות במהלך ניתוח histomorphometric כדי להגדיר אזור מסוים calvaria למדוד שיפוץ העצם. כאן, זיהינו תחילה את התפר הפנימי ואחר כך את משטח העצם הארוך שבו צולמו התמונות ואת המידות שנעשו.
כדי להשיג את הסטנדרטיזציה ולפתח את הפרוטוקולים שתוארו, שינו מעט מתודולוגיות מבוססות קצת. במהלך הניתוח של המי-קלוריון, שימש PBS לשטוף את ראשי העכבר במקום מדיה תרבותית. כדי לקבוע את מספר התאים הנחוצים כדי לייצר אפקט על calvarias, הרקמה היתה מודחטת עם מספרים שונים של תאים סרטניים בשד. באופן כללי, 5 x 105 תאים סרטניים לעבוד היטב במשך 7 יום. גם, במהלך קיבעון, נייר טישו שימש במקום ספוגים כדי להגן על הקלוריון. . הרקמה שמורה היטב בתוך העיתון
למודל המתואר יש מספר מגבלות. Calvarias מעכברים המטוקיים חוסר חלק ממרכיבי העצמות כי הם המקבל של גרורות, בין אם מבנית (כלומר, בעצם טראפקאני) או רכיבים סלולריים כגון תאים חיסוניים או תאים אחרים של מח העצם, כולל תאי גזע המטפאות כי תאים סרטניים אינטראקציה עם. התרבות של הקלוריון בחוץ לא יכולה לדמות את הphysiopathology המלאה. גם, כשמדובר גרורות העצם, סרטן השד תאים לעתים רחוקות גרורות כדי calvaria, ונוטים להעדיף עצמות עם שיפוץ עצם פעיל יותר, כגון החוליות, הירך, או העצמות הארוכות של הזרועות והרגליים. חוץ מזה, התרבות של החברה של המי-calvarias עם תאים סרטניים רק מייצג את הצעדים האחרונים של אשד גרורתי: הקולוניזציה של העצם ואת הצמיחה של גרורות. יתר על כן, מספר הדגימות מוגבל על ידי מספר גורים לכל המלטה. מומלץ להשתמש בחול אחד לכל ניסוי ולא לערבב לכלוך כדי למנוע וריאציות בתוך התוצאות. הצלחנו להשיג תוצאות דומות שיפוצים בעצם בעת שימוש calvarias מ BALB/c או FVB עכברים, אבל אם המתח משפיע על תגובת הזמן של שיפוץ העצם בתוך הקבוע הזה נשאר להיקבע.
היתרונות העיקריים של מודל vivo לשעבר כיפת לעומת מודלים vivo כוללים עלות נמוכה יותר, פשטות הכדאיות, וזמן ניסיוני קצר יותר כדי לקבל תגובה שיפוץ עצם. התרבות הקוקולנית של תאים סרטניים ו calvarias מאפשר ללמוד את התא קשר תלוי האינטראקציות, כמו גם את ההשפעה של גורמים מופרש על שיפוץ העצם, בעוד השימוש בתקשורת ממוזג מאפשר התמקדות על ההשפעה של גורמים מסיסים. בנוסף, מודל המגע הישיר יכול להקל על האפיון של אינטראקציות בין-סלולריות ומנגנונים מולקולריים של מיקרואקולוגיה העצם גרורות, כמו גם לימוד והערכה של תרופות חדשות לטיפול בסיבוכים השלד של ממאירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים מריו Nomura, md ו Rodolfo דיז על עזרתם עם היסטולוגיה, ופירט פורנייה, Ph.D. על הערות יקרות שלו כדי לשפר את איכות הנייר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
