Summary
Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.
Abstract
Kemik osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar oluşan bir bağ dokusu ve onun güç ve esneklik verir ve işlevlerini yerine getirmek için izin veren bir mineralize ekstrasellüler matris vardır. Kemik sürekli olarak çeşitli uyaranlara maruz kalır ve patolojik koşullarda kemik remodelingini bozabilir. Kemik biyolojisi ve hastalıkları nın incelenmesi ve potansiyel terapötik ajanların değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Bu makale, kemik oluşumu nu ve kemik tümörü mikroçevresini incelemek için neonatal farelerden izole edilen kalvariaların diseksiyon sürecini ve kültür koşullarını açıklamaktadır. In vitro ve in vivo modellerin aksine, bu ex vivo modeli istenilen mikroortamı simüle etmek için tanımlanmış koşullar altında kültürleme sırasında dokununma sırasında dokunun üç boyutlu ortamının yanı sıra kemik hücresel çeşitliliğin korunmasına olanak sağlar. Bu nedenle, kemik remodeling ve mekanizmaları, yanı sıra diğer hücre tipleri ile etkileşimleri araştırmak mümkündür, kanser hücreleri ve kemik arasındaki etkileşimler gibi.
Burada bildirilen tahliller 5-7 günlük BALB/C farelerden calvarias kullanır. Elde edilen hemi-kalvarias insülin varlığında kültürlü, meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231), ya da meme kanseri hücre kültürlerinden klimalı orta. Analizden sonra insülinin yeni kemik oluşumuna neden olduğu, kanser hücreleri ve bunların şartlı orta indüklenen kemik rezorpsiyonu olduğu saptandı. Kalvarial model, kemik gelişimi ve kansere bağlı kemik hastalıklarının araştırılmasında temel ve uygulamalı araştırmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, kolay, bilgilendirici ve düşük maliyetli bir teşp için mükemmel bir seçenektir.
Introduction
Kemik, kasların desteklenmesi, iç organların ve kemik iliğinin korunması, kalsiyum ve büyümefaktörlerinin,depolanması ve serbest bırakılması dahil olmak üzere çeşitli işlevleri olan dinamik bir bağ dokusudur.2 Bütünlüğünü ve uygun işlevini korumak için, kemik dokusu sürekli remodeling süreci altındadır. Genel anlamda, kemik remodeling döngüsü kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu1ayrılabilir. Kemik remodeling bu iki aşamaları arasında bir dengesizlik kemik patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, meme kanseri gibi hastalıklar genellikle kemik bütünlüğünü etkiler; ileri evrelerde hastaların yaklaşık %70'inde kemik metastazı vardır veya olacaktır. Meme kanseri hücreleri kemiklere girdiğinde, kemik metabolizmasını etkiler, aşırı rezorpsiyon (osteoklastik lezyonlar) ve /veya oluşum (osteoblastiklezyonlar)ile sonuçlanır 3 .
Kemik hastalıklarının biyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için kemik remodeling ile ilgili mekanizmaları anlamak gerekir. Kanser araştırmalarında kemik metastazı prosesi ve metastatik mikroçevre ile ilişkisi nin araştırılması esastır. 1889 yılında, Stephen Paget metastaztümör hücreleri ve hedef doku arasında uyumluluk olduğunda meydana geldiğini hipotez, ve metastatik site mikroçevre için tümörün yakınlık bağlıdır önerdi4. 1997 yılında, Mundy ve Guise tümör hücrelerinin hayatta kalma ve büyüme elde etmek için kemik mikroçevre değiştirmek nasıl açıklamak için "kemik metastazlarının kısır döngüsü" kavramını tanıttı, ve nasıl kemik mikroçevre kalsiyum ve büyümefaktörlerisağlayarak büyümesini teşvik 5,6,7.
Kemik remodeling ve kemik metastazı ile ilgili mekanizmaları karakterize etmek ve olası terapötik potansiyele sahip molekülleri değerlendirmek için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir. Ancak, bu modeller şu anda kemik mikroortamının basitleştirilmiş temsili gibi birçok sınırlamalar mevcut, ve maliyet8,9. Kemik eksektis ex vivo kültürü, kemik hücrelerinin çeşitliliğinin yanı sıra üç boyutlu organizasyonu koruma avantajına sahiptir. Buna ek olarak, deneysel koşullar kontrol edilebilir. Eksplant modelleri metatarsal kemikler, femoral kafaları, calvarias ve mandibular veya trabeküler çekirdek10kültürünü içerir. Ex vivo modellerinin avantajları çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. 2009 yılında, Nordstrand ve işbirlikçileri kemik ve prostat kanseri hücreleri arasındaki etkileşimleri dayalı bir coculture modelinin kurulması bildirdi11. Ayrıca, 2012 yılında, Curtin ve işbirlikçileri ex vivo cocultures12kullanarak üç boyutlu bir modelin geliştirilmesi rapor . Bu tür ex vivo modellerinin amacı, normal veya patolojik kemik remodeling inde yer alan mekanizmaları karakterize edebilmek ve yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kemik mikroortamının koşullarını mümkün olduğunca doğru bir şekilde yeniden oluşturmaktır.
Bu protokol Garrett13 ve Mohammad ve ark.14tarafından yayınlanan prosedürlere dayanmaktadır. Yenidoğan fare kalvari kültürleri deneysel bir model olarak kullanılmıştır, onlar geliştirme ve kemik hücreleri altında kemik üç boyutlu mimarisi korumak gibi, farklılaşma tüm aşamalarında hücreleri de dahil olmak üzere (yani, osteoblastlar, osteositler, stromal hücreler) olgun osteoklastlar ve osteoblastlar yol, yanı sıra mineralize matris14. Ex vivo modeli kemik hastalıklarının patolojik sürecini tam olarak temsil etmez. Ancak, kemik remodeling veya kansere bağlı kemik osteoliz üzerindeki etkileri doğru ölçülebilir.
Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: 5-7 günlük fareler, calvaria preculture, calvaria kültür uygulamaları (örneğin, insülin varlığında kültür, kanser hücreleri veya şartlı orta ve hatta ajanlar gelen kalvarias diseksiyon terapötik potansiyel, araştırma amacına göre), kemik fiksasyonu ve kalsifikasyon, doku işleme, histolojik analiz ve sonuç yorumu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu tahlillerde kullanılan tüm fareler BALB/c fare suşlarından elde edilip, erkek ve dişi farelerin gelişigüzel kullanılmasına neden oldu. Önceki kültür deneyleri de FVB, İsviçre fareler, CD-1 ve CsA fareler11,,12,14gibi diğer suşları kullanılarak yapılmıştır. Tüm fareler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre barındırıldı, Ek S. Hayvan denekleri içeren prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından Ensenada Bilimsel Araştırma ve Yüksek Öğretim Merkezi (CICESE) tarafından onaylanmıştır.
1. Kalvariyal diseksiyon
- Diseksiyon aletlerini (örn. 1 x 2 diş doku kasları, düz cerrahi makas, diseksiyon makasları, ince uçlu cımbızlar, ince kavisli uçlu kesme terpler, diseksiyon perçeleri, neşter) sterilize edin. Steril distile su her diseksiyon arasındaki cerrahi araçları temizlemek için kullanılabilir ve steril 1x PBS her hemi-calvaria temizlik için kullanılabilir.
- Steril diseksiyon aletleri, su, 1x PBS ve prosedürü gerçekleştirmek için gerekli malzemeleri (örn. mikro pipetler, çökelti gözlükleri, steril Petri kaportaları) laminar akış kaputuna yerleştirin.
NOT: Tüm prosedürü steril koşullarda gerçekleştirin. - İki 10 cm Petri kabına 12 mL steril 1x PBS ekleyin.
- Yavruları seçin ve kaputun yakınına yerleştirin.
NOT: 5-7 günlük yavrulardan kalvariaları inceleyin. - Kesme forceps kullanarak fareyi dikkatlice seçin ve tutun.
- Kesme makası kullanarak farenin kafasını koparın ve başı PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Decapitation yaşlı fareler için uygun değildir. Deney daha yaşlı farelerle yapılacaksa, ötanazi yöntemi hayvan deney kurallarına göre değiştirilmelidir. - 1 x 2 diş dokusu forceps ile burun bölgesi tarafından sıkıca baş tutun ve calvaria görünür olana kadar kafatası üzerinde deri çıkarın.
- Maruz kalan kalvariüzerinde kafatasının dikişlerini (yani sagittal, koronal ve lambdoid) tanımlayın.
- Lambdoid sütür arkasında yaklaşık 2 mm mikrosksorucu ucu ile nüfuz ve yanında düz bir kesim yapmak.
- Kafatasının arka tarafına mikrosksorsucu ucu nu yerleştirin. Koronal sütür doğru lambdoid sütür distal tarafı boyunca düz bir kesim olun. Diğer lambdoid dikiş ile benzer devam edin.
- Ön fontanel kesim ile yapılan kesim sonunda bağlamak için başka bir kesim (45 ° açıyla) olun.
- Diğer lambdoid sütür ile 1.10 ve 1.11 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Uygun kesimler yapmak ve yeterli katıştırma ve veri analizi yapabilmek için dikişleri belirlemek önemlidir. - Calvaria kaldırmak ve bir Petri kabına yerleştirmek için ince uçlu forceps kullanın. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak ve iki hemi-calvarias elde etmek için ön fontanel biten.
- İnce uçlu cımbızile hemi-calvarias her almak ve PBS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.
2. Calvaria kültürü
- 24 kuyunun kuyularına %0.1 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ve %1 antibiyotik/antimikotik (yani penisilin ve streptomisin) ile takviye edilmiş 1 mL yüksek glukozlu DMEM ortamı ekleyin. İnce uçlu forceps ile, her hemi-calvaria almak ve bir kuyuya yerleştirin.
NOT: Hemi-calvarias içbükey tarafını aşağı koyun. - Hemi-kalvarileri %5 CO2ile 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
- Kültür ortamını her kuyudan çıkarın ve diğer hücrelerden test etmek veya koşullandırılmış ortam için bileşiği içeren 1 mL taze ortam ekleyin.
NOT: Her tedavi grubu için en az üç hemi-kalvarikullanın ve negatif ve pozitif kontroller kullanın. - Hemi-kalvarileri 7 gün kuluçkaya yatırın, 2-3 günde bir ortam değiştirin.
3. Kanser hücreleri ile Kültür
- %80-90 oranında kanser hücrelerinin birleştiği bir Petri kabı seçin ve onları deneyin. Tripsin için kanser hücrelerini 1 x PBS (75 cmbaşına 5 mL 2 şişe) kullanarak yıkayın ve ardından %0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA (75 cm2 şişede 2 mL) içeren HBSS çözeltisinde kuluçka yada kuluçka yada sın.
- Hücre süspansiyonuna 15 mL konik tüp ve 800 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika (RT) aktarın.
- Supernatant'ı çıkarın ve atın.
- %2 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik içeren 2 mL DMEM'deki peleti yeniden askıya alın. Canlı hücreleri say.
- Her çalışma grubuna hemi-kalvarias atayın (yani RNA veya histoloji analizi için negatif kontrol ve kokültür grubu).
- Kültür ortamını hemi-kalvarilerden çıkarın ve %2 FBS ve %1 antibiyotik/antimikotik içeren 1 mL DMEM ekleyin veya kanser hücreleriyle desteklenmez.
NOT: Eklenecek hücre miktarı, test edilen hücre satırına bağlı olarak değişebilir. MDA-MB-231 veya PC-3 gibi kanser hücreleri ile, iyi başına 500.000 hücreleri uygun çalışır. - 37 °C'de %5 CO2ile 24 saat kuluçka . Kemik dokusuna yapışan sadece kanser hücrelerini korumak için yeni bir kuyuya her hemi-calvaria geçirin.
- %5 CO2 ile 37 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın ve 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
4. Fiksasyon
- Hemi-calvarias sarmak için kağıt mendil kareler kesin.
NOT: Küçük biyopsiler için biyopsi köpük pedleri veya çelik kapsüller de kullanılabilir. - Sagittal sütür her hemi-calvaria almak için düz ince uçlu forceps kullanın, bir doku kağıt üzerine yerleştirin, ve sarın.
- Sarılmış hemi-calvaria etiketli bir gömme kaset içine yerleştirin.
- Kaseti %10 fosfat tamponlu formalin içeren bir kaba yerleştirin.
- 4 °C'de 24 saat için düzeltin.
5. Kireçlenme
- Formalin çıkarın, 1x PBS ekleyin ve hemi-calvarias durulamak için 30 dakika boyunca dokuları ajite.
- PBS'yi çıkarın ve %10 EDTA ekleyin (pH = 8, 0,34 M).
NOT: Çözümün dokuları tamamen kapsadığını doğrulayın. - 4 °C'de 48 saat dokuları dekalsite edin.
- EDTA çözeltisini atın ve doymak için 1x PBS ekleyin.
- Histoloji işlemine kadar hemi-kalvarileri %70 etanolde saklayın.
6. Doku işleme
- % 96 etanol, 60 dakika (3x), % 100 etanol, 60 dakika (3x) tur ile dokuları dehydrate.
- Etanol% 100 ksilen, 60 dakika (3x) ile değiştirin.
- Parafin balmumu, 60 dk (2x) kasetler kuluçka.
7. Gömme
- Kasetleri açın, kağıt mendilini dikkatlice çıkarın ve calvaria'yı açın.
- Her calvaria dikkatle almak ve aynı oryantasyon da aynı gruptan tüm hemi-calvarias yığını.
- Kalıba biraz parafin koy.
- Tüm hemi-calvarias'ları çifenler ile toplayın ve kalıbın tabanına doğru sagittal sütür ile kalıbın içine yerleştirin.
NOT: Dahil sırasında kalıptaki hemi-kalvarilerin oryantasyonu tutarlı histolojik kesitler ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir, çünkü bu oryantasyon kalvarilerden ön ve parietal kemiklerin posterior olarak tanımlanmasına olanak sağlar. ve koronal sütür kantitatif değerlendirmeyi kolaylaştırır. - Forceps bırakın ve hemi-calvarias yerinde kalmak doğrulayın.
- Etiketli kaseti kalıbın üzerine yerleştirin ve hemi-calvarias'ı kapsayacak şekilde daha fazla parafinle doldurun.
- Kalıpları soğuk yüzeye taşıyın.
8. Kesitleme
- Mikrotom ile sagittal sütür 500-600 μm trim.
- 4 μm kalınlığında kesin ve gerekli bölümleri toplayın.
- 300 μm daha kırpın.
- Kesip altı 4 μm kalınlığında kesin.
- Bloğu 300 μm daha fazla kırpın ve daha fazla kesit toplayın.
- Bölümleri cam mikroskop slaytlarına monte edin.
- Slaytları RT'de kurutun.
9. Boyama
- 3 dakika için% 100 xylene bölümleri batırın.
- 1 dakika boyunca % 100 etanol batırın.
- 1 dakika için% 96 etanol birleştirin.
- 1 dakika boyunca % 80 etanol batırın.
- 1 dakika boyunca % 70 etanol batırın.
- 3 dakika suda durulayın.
- 3 dakika hematoksilin batırın.
- Bölüm temizlenene kadar suda durulayın.
- 10 sn için doymuş lityum karbonat çözeltisine batırın.
- 3 dakika suda durulayın.
- 1 dakika boyunca % 96 etanol batırın.
- 3 dakika boyunca eozin batırın.
- 1 dakika boyunca %96 etanol batırın.
- 1 dakika boyunca % 100 etanol batırın.
- 3 dk için% 100 xylene batırın.
- Slayta montaj ortamı başına biraz ekleyin ve bir kapak kayma ile koruyun.
NOT: Osteoklast ve osteolizi değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (H&E) lekesini tartaratdirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ile tamamlayabilirsiniz.
10. Nicel değerlendirme: analiz alanının tanımlanması
- Oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için düşük güç altındaki bölümleri (yani 4x) inceleyin.
- Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi ve diğer kısa yüzeyi tanımlayın.
- 40x büyütme altında koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntülerini yakalayın.
- Eski kemik bölgesini ve yeni kemik bölgesini tanımlayın. Turuncu G lekeleri ile eozin Y eski kemik koyu ve yeni kemik çakmak lekeleri.
- Renk eşik aracını kullanarak Image J yazılımı ile eski ve yeni kemiğin toplam kemik alanını ölçün. Sonuçları μm2olarak ifade edin.
11. Veri analizi
- Sonuçları istatistiksel yazılımkullanarak analiz edin. Gruplar arasındaki önemli farklar uygun testler kullanılarak belirlenebilir (örn. herel yapıldığı gibi parametrik olmayan Mann-Whitney U testi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalvarial modelde kemik oluşumunu değerlendirmek için hemi-kalvariaları 50 g/mL insüliniçeren veya olmayan ortamda yetiştirdik. Doku bölümleri hazırlandı ve H&E ile boyandı. Bu koşullarda histoloji, kalvariyal kemiğin yapısal bütünlüğünün korunarak farklı bileşenlerinin tanımlanmasına olanak sağladığını göstermiştir(Şekil 1). İnsülin ile tedavi edilen kalvariler kontrole göre kemik dokusu miktarında artış gösterdiler (Şekil 2A). Hemi-kalvarikalınlığı ve kemik alanı için kantitatif histomorfometrik analiz, insülin letedavi edilen dokularda her iki parametrede de kontrole göre anlamlı bir artış olduğunu doğrulamıştır(Şekil 2B). Bu veriler, kemik oluşum koşullarını yeniden üretmek için ex vivo model protokolünün fizibilitesini göstermektedir.
Ayrıca, kalvarial ex vivo modeli kanser ve kemik mikroçevre koşulları çoğaltmak için kullanılabilir. Protokol meme kanseri hücreleri MDA-MB-231'in mindik kalvariaları üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanıldı. Bunu gerçekleştirmek için, kalvarial kemikler doğrudan kanser hücreleri ile cokültüre edildi veya kanser hücrelerinin şartlı medya ile sadece kültürlü edildi. 7 günlük kültürden sonra calvarialar parafine gömülür ve H&E boyama işlemi yapılmıştır. MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri ile coculture osteoliz artırmak için ortaya çıktı, kemik azalması ve kalvarial yapıya zarar gösterdiği gibi kontrol calvarias sadece medya ile yetiştirilen karşılaştırıldığında(Şekil 2A). Kalvarilerin kemik alanı nicelliği, kontrole göre MDA-MB-231 kanser hücreleri ile kültürlenmiş calvariaların toplam kemik bölgesinde önemli bir azalma göstermiştir(Şekil 2B). Bu sonuçlar, kalvariyal doku ile kanser hücrelerinin kokültürkanser ve kemik mikroçevre yeniden ve osteolitik kemik metastazı mekanizmaları araştırmak veya bu sürecin olası inhibitörlerini değerlendirmek için kullanılabilir gösterdi.
Şekil 1: Kalvariyal kemiğin histolojik yapısı. H&E boyama sonrası hemi-kalvarinin temsili doku bölümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsülin kemik alanını ve hemi-kalvarias ex vivo kalınlığını artırırken, hemi-kalvarilerin MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri ile birlikte liği osteolyzile neden oldu. Kemik oluşum modelinde hemi-kalvarialar insülin (50 g/mL) varlığında veya yokluğunda kültürlenmiş, kanser hücreleri ile birlikte kültür için hemi-calvarialar 7 gün boyunca 5 x 105 MDA-MB-MB-231 hücre varlığında veya yokluğunda kültürlenmiş ve H&E lekeli kesitlerde histomorfometrik analiz yapılmıştır. (A) Temsili doku bölümleri. (B) Kemik bölgesinin histomorfometrik analizi. Sonuçlar ortalama ± SEM (n = 3) olarak temsil edilir. *P < 0.05, parametrik olmayan Mann-Whitney U testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kemik oluşumunu veya rezorpsiyonlarını değerlendirmek ve kanser hücrelerinin kalvarial fare kemiği ile etkileşimlerini incelemek için kalvarial ex vivo modelinin protokolünü açıklıyoruz. Bu tekniğin kritik adımları kalvariaların diseksiyon, kültür, katıştırma ve histomorfometrik analizidir. Calvarias diseksiyon sırasında, bir yamuk içine hemi-kalvarias kesmek için çok önemlidir, bu kuvvetle parafin dahil sırasında yönünü kolaylaştıracak gibi. Calvarias ile kanser hücresi etkileşimleri incelerken, bu kemik yerine plastik üzerinde yapışmasını ve büyümesini kanser hücrelerinin önlemek için hücre kültürü için tedavi edilmez multiwell plakalar kullanmak önemlidir. Doku dahil sırasında, dikkatle her hemi-calvaria yönlendirmek için önemlidir. Parafin bloğunun dış tarafında sagital sınır ile dikey bir şekilde yerleştirilmelidir. Kemiğin yönelimi tutarlı histolojik kesitler ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Benzer şekilde, kemik remodeling ölçmek için kalvari belirli bir bölge tanımlamak için histomorfometrik analiz sırasında tutarlılık için önemlidir. Burada önce koronal sütür, sonra da fotoğrafların çekildiği ve yapılan ölçümlerin yapıldığı uzun kemik yüzeyini tespit ettik.
Standardizasyona ulaşmak ve açıklanan protokolleri geliştirmek için, bazı yerleşik metodolojileri biraz değiştirdik. Hemi-kalvariaların diseksiyonu sırasında PBS, kültür ortamı yerine fare başlarını durulamak için kullanıldı. Kalvarialar üzerinde bir etki üretmek için gerekli hücrelerin sayısını belirlemek için, doku meme kanseri hücrelerinin farklı sayıda inkübe edildi. Genel olarak, 5 x 105 kanser hücreleri 7 günlük bir tsöz için iyi çalışır. Ayrıca, fiksasyon sırasında, kağıt mendil yerine kalvarias korumak için sünger kullanılmıştır. Doku kağıt içinde iyi korunmuştu.
Açıklanan modelin bazı sınırlamaları vardır. Neonatal farelerden kalvarialar metastaz alıcı olan kemiklerin bazı bileşenleri eksikliği, yapısal olsun (yani, trabeküler kemik) veya bağışıklık hücreleri veya kemik iliği diğer hücreler gibi hücresel bileşenler, kanser hücreleri ile etkileşim de dahil olmak üzere. Calvarias in vitro kültürü tam fizyopatoloji simüle edemez. Ayrıca, kemik metastazları söz konusu olduğunda, meme kanseri hücreleri nadiren kalvari metastaz, ve daha aktif kemik remodeling ile kemikleri lehine eğilimindedir, vertebra gibi, kalça, ya da kol ve bacak uzun kemikler. Ayrıca, kanser hücreleri ile hemi-kalvarias coculture sadece metastatik kaskad son adımları temsil: kemik kolonizasyonu ve metastaz büyümesi. Ayrıca, numune sayısı çöp başına yavru sayısı ile sınırlıdır. Deney başına bir çöp kullanılması ve sonuçlar daki farklılıkları önlemek için çöpleri karıştırmaması önerilir. BALB/c veya FVB farelerinden kalvaria lar kullanırken kemik remodeling'de de benzer sonuçlar elde ettik, ancak bu tahtta kemik remodeling'in zaman tepkisini türünün etkileyip etkilemediği henüz belirlenemedi.
Kalvarial ex vivo modelinin in vivo modellere göre başlıca avantajları daha düşük maliyet, töz basitliği ve kemik remodeling yanıtı elde etmek için daha kısa deneysel süre dir. Kanser hücreleri ve kalvariaların coculture hücre teması bağımlı etkileşimleri yanı sıra kemik remodeling üzerinde salgılanan faktörlerin etkisi incelenmesine olanak sağlar, koşullu ortam kullanımı çözünür faktörlerin etkisi üzerinde duruluyor sağlarken. Buna ek olarak, doğrudan temas modeli kemik metastazı mikroortamının hücre içi etkileşimlerin ve moleküler mekanizmaların karakterizasyonunun yanı sıra malignitelerin iskelet komplikasyonlarının tedavisi için yeni ilaçların araştırılmasını ve değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.
Acknowledgments
Yazarlar, mario Nomura, M.D. ve Rodolfo Díaz histoloji ile ilgili yardımları için teşekkür eder ve Pierrick Fournier, Ph.D. onun değerli yorum için kağıt kalitesini artırmak için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
