Summary
De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.
Abstract
Bot is een bindweefsel gevormd uit osteoblasten, osteocyten, en osteoclasten en een gemineraliseerde extracellulaire matrix, die het zijn kracht en flexibiliteit geeft en het in staat stelt om zijn functies te vervullen. Bot wordt continu blootgesteld aan een verscheidenheid aan stimuli, die in pathologische omstandigheden botremodelleren kunnen dereguleren. Om botbiologie en ziekten te bestuderen en potentiële therapeutische middelen te evalueren, was het noodzakelijk om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen.
Dit manuscript beschrijft het dissectieproces en de kweekomstandigheden van calvaria's geïsoleerd van neonatale muizen om botvorming en de bottumormicroomgeving te bestuderen. In tegenstelling tot in vitro en in vivo modellen, dit ex vivo model maakt het behoud van de driedimensionale omgeving van het weefsel, evenals de cellulaire diversiteit van het bot, terwijl het kweken onder gedefinieerde omstandigheden om de gewenste micro-omgeving te simuleren. Daarom is het mogelijk om botremodellering en de mechanismen ervan te onderzoeken, evenals de interacties met andere celtypen, zoals de interacties tussen kankercellen en bot.
De testen hier gemeld gebruik calvarias van 5-7 dagen oude BALB / C muizen. De verkregen hemi-calvarias worden gekweekt in aanwezigheid van insuline, borstkankercellen (MDA-MB-231), of geconditioneerd medium uit borstkankercelculturen. Na analyse werd vastgesteld dat insuline nieuwe botvorming veroorzaakte, terwijl kankercellen en hun geconditioneerde medium geïnduceerde botresorptie. Het calvariële model is met succes gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek om botontwikkeling en door kanker veroorzaakte botziekten te bestuderen. Kortom, het is een uitstekende optie voor een eenvoudige, informatieve en low-cost test.
Introduction
Bot is een dynamisch bindweefsel dat verschillende functies heeft, waaronder het ondersteunen van de spieren, het beschermen van de inwendige organen en beenmerg, en het opslaan en vrijgeven van calcium en groeifactoren1,2. Om zijn integriteit en de juiste functie te behouden, botweefsel is voortdurend onder het proces van remodelleren. In het algemeen kan een cyclus van botremodelleren worden onderverdeeld in botresorptie en botvorming1. Een onbalans tussen deze twee fasen van botremodelleren kan leiden tot de ontwikkeling van botpathologieën. Ook ziekten zoals borstkanker beïnvloeden vaak de integriteit van het bot; ongeveer 70% van de patiënten in vergevorderde stadia hebben of zullen botmetastasen hebben. Wanneer borstkankercellen de botten binnenkomen, beïnvloeden ze het botmetabolisme, wat resulteert in overmatige resorptie (osteoclastische laesies) en/of vorming (osteoblastische laesies)3.
Om de biologie van botziekten te begrijpen en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, is het noodzakelijk om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij botremodellering. In kankeronderzoek is het essentieel om het botmetastaseproces en de relatie tot de uitgezaaide micro-omgeving te onderzoeken. In 1889 veronderstelde Stephen Paget dat metastasen optreden wanneer er compatibiliteit is tussen de tumorcellen en het doelweefsel, en suggereerde dat de uitgezaaide site afhangt van de affiniteit van de tumor voor de micro-omgeving4. In 1997 introduceerden Mundy en Guise het concept van de "vicieuze cirkel van botmetastasen" om uit te leggen hoe tumorcellen de botmicroomgeving wijzigen om hun overleving en groei te bereiken, en hoe de botmicroomgeving hun groei bevordert door calcium- en groeifactoren5,6,7te verstrekken .
Om de mechanismen te karakteriseren die betrokken zijn bij botremodelleren en botmetastase en om moleculen met mogelijk therapeutisch potentieel te evalueren, is het noodzakelijk geweest om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen. Deze modellen bieden momenteel echter vele beperkingen, zoals de vereenvoudigde weergave van de botmicroomgeving, en de kosten8,9. De cultuur van botexplants ex vivo heeft het voordeel dat de driedimensionale organisatie en de diversiteit van botcellen behouden blijven. Bovendien kunnen de experimentele omstandigheden worden gecontroleerd. De explant modellen omvatten de cultuur van middenvoetsbeentje botten, dijbeenhoofden, calvarias, en mandibulaire of trabecular kernen10. De voordelen van de ex vivo modellen zijn aangetoond in diverse studies. In 2009 meldden Nordstrand en medewerkers de oprichting van een cocultuurmodel op basis van de interacties tussen bot- en prostaatkankercellen11. Ook, in 2012, Curtin en medewerkers gemeld de ontwikkeling van een driedimensionaal model met behulp van ex vivo cocultures12. Het doel van dergelijke ex vivo modellen is om de omstandigheden van de botmicroomgeving zo nauwkeurig mogelijk te recreëren om de mechanismen te kunnen karakteriseren die betrokken zijn bij normale of pathologische botremodelleren en de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen te evalueren.
Het huidige protocol is gebaseerd op de procedures gepubliceerd door Garrett13 en Mohammad et al.14. Neonatale muis calvaria culturen zijn gebruikt als een experimenteel model, omdat ze de driedimensionale architectuur van het bot in ontwikkeling en botcellen behouden, met inbegrip van cellen in alle stadia van differentiatie (dat wil zeggen, osteoblasten, osteoclasten, osteocyten, stromalcellen) die leiden tot volwassen osteoclasten en osteoblasten, evenals de gemineraliseerde matrix14. Het ex vivo-model vertegenwoordigt niet volledig het pathologische proces van botziekten. Echter, effecten op bot remodelleren of kanker-geïnduceerde bot osteolyse kan nauwkeurig worden gemeten.
Kortom, dit protocol bestaat uit de volgende stappen: de dissectie van calvarias van 5-7 dagen oude muizen, calvaria precultuur, calvaria cultuur toepassingen (bijv. cultuur in aanwezigheid van insuline, kankercellen of geconditioneerd medium, en zelfs agenten met therapeutisch potentieel, volgens het doel van het onderzoek), botfixatie en calvaria ontkalking, weefselverwerking, histologische analyse en resultaatinterpretatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen die in deze testen werden gebruikt, werden verkregen uit BALB/c muizenstammen, waarbij mannelijke en vrouwelijke muizen lukraak werden gebruikt. Eerdere cultuurexperimenten zijn ook uitgevoerd met andere stammen, zoals FVB, Zwitserse muizen, CD-1 en CsA muizen11,12,14. Alle muizen werden ondergebracht volgens de richtlijnen van het National Institutes of Health (NIH), Appendix Q. Procedures met betrekking tot proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) van het Center for Scientific Research and Higher Education in Ensenada (CICESE).
1. Calvarial dissectie
- Sterilisatie dissectie-instrumenten (bijvoorbeeld 1 x 2 tandenweefseltangen, rechte chirurgische schaar, ontleden schaar, fijn getipte pincet, fijne gebogen tip ontleden tangen, ontleden tangen, scalpel). Steriel gedestilleerd water kan worden gebruikt om de chirurgische gereedschappen tussen elke dissectie schoon te maken, en steriele 1x PBS kan worden gebruikt voor het reinigen van elke hemi-calvaria.
- Plaats de steriele dissectie-instrumenten, water, 1x PBS en benodigde materialen om de procedure uit te voeren (bijvoorbeeld micropipetten, neerslaande glazen, steriele petrischalen) in een laminaire stroomkap.
OPMERKING: Voer de hele procedure uit onder steriele omstandigheden. - Voeg 12 mL steriele 1x PBS toe in twee 10 cm petrischaaltjes.
- Selecteer de pups en plaats ze in de buurt van de kap.
LET OP: Ontleed de calvarias van 5-7 dagen oude pups. - Kies en houd de muis voorzichtig met behulp van ontleden tangen.
- Onthoofd de muis met behulp van ontleden schaar en plaats het hoofd in een petrischaaltje met PBS.
LET OP: Onthoofding is niet geschikt voor oudere muizen. Als het experiment moet worden gedaan met oudere muizen, moet de methode van euthanasie worden aangepast volgens de regels voor dierproeven. - Houd het hoofd stevig bij het neusgebied met 1 x 2 tandenweefsel tangen en verwijder de huid over de schedel totdat de calvaria zichtbaar is.
- Identificeer de hechtingen (d.w.z. sagittale, coronale en lambdoïde stoffen) van de schedel op de blootgestelde calvaria.
- Doordringen met de punt van de microschaar ongeveer 2 mm achter de lambdoïde hechting en maak een rechte snede ernaast.
- Plaats de punt van de microschaar aan de achterzijde van de schedel. Maak een rechte snede langs de distale kant van de lambdoïde hechting naar de coronale hechting. Ga zo ook met de andere lambdoïde hechting.
- Maak nog een snede (onder een hoek van 45°) om het uiteinde van de snede gemaakt aan te sluiten met de snede van de voorste fontanel.
- Herhaal stap 1.10 en 1.11 met de andere lambdoïdenhechting.
OPMERKING: Het is belangrijk om de hechtingen te identificeren om passende bezuinigingen te maken en om adequate inbedding en data-analyse uit te voeren. - Gebruik fijnpunttangen om de calvaria te verwijderen en in een petrischaaltje te plaatsen. Met een scalpel, maak een rechte snede van de achterste fontanel langs de sagittale hechting door de coronale hechting en eindigend in de voorste fontanel om twee hemi-calvarias te verkrijgen.
- Pak elk van de hemi-calvarias met de fijn-getipt ecet en plaats ze in een nieuwe Petri schotel met PBS.
2. Calvaria cultuur
- Voeg 1 mL hoogglucose DMEM medium aangevuld met 0,1% runderserum albumine (BSA) en 1% antibioticum /antimycotisch (d.w.z. penicilline en streptomycine) in de putten van een 24 putplaat. Met fijne-tip tangen, pick-up elke hemi-calvaria en plaats het in een put.
LET OP: Zet de hemi-calvarias concave kant naar beneden. - Incubeer de hemi-calvaria's voor 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
- Verwijder het kweekmedium uit elke put en voeg 1 mL verse media toe die de verbinding bevatten om media uit andere cellen te testen of geconditioneerd te worden.
OPMERKING: Gebruik ten minste drie hemi-calvaria's voor elke behandelingsgroep en gebruik negatieve en positieve controles. - Incubeer de hemi-calvarias gedurende 7 dagen, het veranderen van de media om de 2-3 dagen.
3. Cultuur met kankercellen
- Selecteer een petrischaaltje met kankercellen bij 80-90% samenvloeiing en trypsinize hen. Om te proberen, was de kankercellen 1x met BEHULP VAN PBS (5 mL per 75 cm2 kolf), gevolgd door incubatie in een HBSS-oplossing met 0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA (2 mL per 75 cm2 kolf).
- Breng de celvering over in een conische buis van 15 mL en centrifuge op 800 x g voor 5 min bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder en gooi de supernatant weg.
- Resuspend de pellet in 2 mL DMEM met 2% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum/antimycotisch. Tel levende cellen.
- Wijs hemi-calvaria's toe aan elke studiegroep (d.w.z. de negatieve controle- en cocultuurgroep voor RNA- of histologieanalyse).
- Verwijder de kweekmedia uit de hemi-calvarias en voeg 1 mL DMEM toe met 2% FBS en 1% antibioticum/antimycotisch aangevuld of niet aangevuld met kankercellen.
OPMERKING: De hoeveelheid cellen die u wilt toevoegen, kan veranderen afhankelijk van de geteste cellijn. Met kankercellen zoals MDA-MB-231 of PC-3, werken 500.000 cellen per goed gepast. - Incubeer voor 24 uur bij 37 °C met 5% CO2. Geef elke hemi-calvaria door aan een nieuwe bron om alleen kankercellen te behouden die zich aan het botweefsel hebben gehecht.
- Incubeer gedurende 7 dagen bij 37 °C met 5% CO2 en verander de media elke 2-3 dagen.
4. Fixatie
- Snijd vierkantjes tissuepapier om de hemi-calvarias te wikkelen.
OPMERKING: Biopsie schuimpads of stalen capsules voor kleine biopten kunnen ook worden gebruikt. - Gebruik rechte fijne-tip tangen op te halen elke hemi-calvaria uit de sagittale hechting, plaats op een tissue papier, en wrap.
- Plaats de verpakte hemi-calvaria in een gelabelde inbeddingscassette.
- Plaats de cassette in een container met 10% fosfaatgebufferde formaline.
- Fix for 24 h bij 4 °C.
5. Ontkalking
- Verwijder de formaline, voeg 1x PBS toe en roer de weefsels gedurende 30 min om de hemi-calvaria's te spoelen.
- Verwijder de PBS en voeg 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M) toe.
OPMERKING: Controleer of de oplossing de weefsels volledig bedekt. - Ontkalk de weefsels gedurende 48 uur bij 4 °C.
- Gooi de EDTA-oplossing weg en voeg 1x PBS toe om het weefsel te spoelen.
- Bewaar de hemi-calvarias in 70% ethanol tot de histologieverwerking.
6. Weefselverwerking
- Dehydrateer de weefsels met rondes van 96% ethanol, 60 min (3x), gevolgd door 100% ethanol, 60 min (3x).
- Vervang de ethanol door 100% xyleen, 60 min (3x).
- Incubeer de cassettes in paraffine was, 60 min (2x).
7. Insluiten
- Open de cassettes, verwijder voorzichtig het tissuepapier en pak de calvaria uit.
- Pak elke calvaria zorgvuldig op en stapel alle hemi-calvaria's uit dezelfde groep in dezelfde oriëntatie.
- Doe wat paraffine in een mal.
- Pak alle hemi-calvarias met de tangen en plaats ze in de mal met de sagittale hechting naar beneden naar de basis van de mal.
OPMERKING: Oriëntatie van de hemi-calvarias in de mal tijdens de opname is van cruciaal belang om consistente histologische secties en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, omdat deze oriëntatie achterste identificatie van de voorste en pariëtale botten van de calvarias mogelijk zal maken en de coronale hechting die de kwantitatieve beoordeling vergemakkelijkt. - Laat de tangen los en controleer of de hemi-calvarias op hun plaats blijven.
- Plaats de gelabelde cassette op de top van de mal en vul het met meer paraffine om de hemi-calvarias te dekken.
- Verplaats de mallen naar het koude oppervlak.
8. Sectie
- Trim 500-600 μm van de sagittale hechting met de microtoom.
- Snijd 4 μm dikke secties, en verzamel de benodigde secties.
- Trim nog eens 300 μm.
- Snijd en verzamel nog eens zes 4 μm dikke secties.
- Snijd het blok 300 μm verder en verzamel meer secties.
- Monteer de secties op glazen microscoopdia's.
- Droog de glijbanen bij RT.
9. Kleuring
- Dompel de secties 3 min onder in 100% xyleen.
- Dompel 100% ethanol onder in 1 min.
- Voeg samen in 96% ethanol voor 1 min.
- Dompel in 80% ethanol voor 1 min.
- Dompel onder in 70% ethanol voor 1 min.
- Spoel in water gedurende 3 min.
- Dompel 3 min onder in hematoxyline.
- Spoel in water tot de sectie helder is.
- Dompel gedurende 10 sec onder in een verzadigde lithiumcarbonaatoplossing.
- Spoel in water gedurende 3 min.
- Dompel 96% ethanol onder voor 1 min.
- Dompel gedurende 3 min onder in eosin.
- Dompel 96% ethanol onder gedurende 1 min.
- Dompel 100% ethanol onder in 1 min.
- Dompel onder in 100% xyleen gedurende 3 min.
- Voeg wat per montagemedium toe aan de glijbaan en bescherm deze met een coverslip.
OPMERKING: U de hematoxyline en eosine (H&E) kleuring aanvullen met tartrate-resistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring om osteoclast en osteolyse te evalueren.
10. Kwantitatieve beoordeling: bepalingsgebied voor analyse
- Bestudeer de secties onder laag vermogen (d.w.z. 4x) om de oriëntatie en de hechtingen te identificeren.
- Definieer de coronale hechting en identificeer het lange botoppervlak aan de ene kant en het korte oppervlak aan de andere kant.
- Identificeer de coronale hechting onder 40x vergroting en verplaats twee of drie optische velden weg van de hechting langs het lange oppervlak. Leg beelden van dit gebied vast voor analyse.
- Definieer het oude botgebied en het nieuwe botgebied. De eosin Y met oranje G vlekken het oude bot donkerder en de nieuwe bot lichter.
- Meet het totale botgebied van het oude en nieuwe bot met Image J-software met behulp van het gereedschap kleurdrempel. Druk de resultaten uit als μm2.
11. Gegevensanalyse
- Analyseer de resultaten met behulp van statistische software. Significante verschillen tussen groepen kunnen worden bepaald aan de hand van passende tests (bijvoorbeeld niet-parametrische Mann-Whitney U-test zoals hier wordt gedaan).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om botvorming in het calvariële model te evalueren, cultiveerden we de hemi-calvaria's in media met of zonder 50 μg/mL insuline. Weefselsecties werden bereid en bevlekt met H&E. In deze omstandigheden toonde de histologie aan dat de structurele integriteit van het calvariale bot werd gehandhaafd, waardoor de verschillende componenten ervan kunnen worden geïdentificeerd (figuur 1). De calvarias behandeld met insuline presenteerde een toename van de hoeveelheid botweefsel in vergelijking met de controle (figuur 2A). Kwantitatieve histomorfometrische analyse voor het dikte- en botgebied van hemi-calvaria bevestigde een aanzienlijke toename voor beide parameters in de met insuline behandelde weefsels in vergelijking met de controle(figuur 2B). Deze gegevens geven de haalbaarheid aan van het ex vivo modelprotocol om botvormingscondities te reproduceren.
Bovendien kan het calvariële ex vivo-model worden gebruikt om kanker- en botmicroomgevingaandoeningen te reproduceren. Het protocol werd gebruikt om het effect van de borstkankercellen MDA-MB-231 op murine calvarias te evalueren. Om dit uit te voeren, werden de calvariële botten direct cocultuur dwijnde met de kankercellen of gekweekt alleen met de geconditioneerde media van de kankercellen. Na 7 dagen van cultuur, werden calvarias ingebed in paraffine, en H&E het vlekken werd uitgevoerd. De cocultuur met MDA-MB-231 borstkankercellen bleek osteolyse te verhogen, zoals blijkt uit de afname van het bot en de schade aan de calvariële structuur in vergelijking met de controle calvarias geteeld alleen met media (Figuur 2A). Botgebiedkwantificering van calvarias toonde een significante daling aan van het totale botgebied van de calvaria's gekweekt met MDA-MB-231 kankercellen in vergelijking met de controle (figuur 2B). Deze resultaten toonden aan dat de coculturen van kankercellen met calvarial weefsel de kanker- en botmicro-omgeving kunnen recreëren en kunnen worden gebruikt om de mechanismen van osteolytische botmetastase te onderzoeken of om mogelijke remmers van dit proces te evalueren.
Figuur 1: Histologische structuur van het calvariale bot. Representatieve weefselsectie van hemi-calvaria na H&E-vlekken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Insuline verhoogde het botgebied en de dikte van hemi-calvarias ex vivo, terwijl cocultuur van hemi-calvaria's met MDA-MB-231 borstkankercellen geïnduceerde osteolyse. Voor het botvormingsmodel werden de hemi-calvaria's gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van insuline (50 μg/mL), terwijl voor de cocultuur met kankercellen hemi-calvaria's gedurende 7 dagen in aanwezigheid of afwezigheid van 5 x 105 MDA-MB-231-cellen werden gekweekt en histomorfometale analyse werd uitgevoerd op H&E-gekleurde secties. (A) Representatieve weefselsecties. bB) Histomorfometrische analyse van het botgebied. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM (n = 3). *P < 0,05, niet-parametrische Mann-Whitney U test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we het protocol voor een calvarial ex vivo model om botvorming of resorptie te evalueren en om de interacties van kankercellen met calvarial muisbot te bestuderen. De kritieke stappen van deze techniek zijn de dissectie, cultuur, inbedding en histomorfoalanalyse van de calvaria's. Tijdens de dissectie van de calvarias is het cruciaal om de hemi-calvaria's in een trapezium te snijden, omdat het de oriëntatie tijdens de paraffineopname sterk zal vergemakkelijken. Bij het bestuderen van kankercel interacties met de calvarias, is het belangrijk om multiwell platen die niet worden behandeld voor celkweek te gebruiken om te voorkomen dat kankercellen vast te houden en te groeien op het plastic in plaats van het bot. Tijdens de weefselopname is het belangrijk om elke hemi-calvaria zorgvuldig te oriënteren. Ze moeten op een verticale manier worden geplaatst met de sagittale rand aan de buitenzijde van het paraffineblok. De oriëntatie van het bot is essentieel om consistente histologische secties en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Op dezelfde manier is het van cruciaal belang voor consistentie tijdens de histomorfometrische analyse om een specifieke regio in de calvaria te definiëren om botremodellering te meten. Hier identificeerden we eerst de coronale hechting en vervolgens het lange botoppervlak waar de foto's werden genomen en de metingen werden verricht.
Om de standaardisatie te bereiken en de beschreven protocollen te ontwikkelen, hebben we een aantal gevestigde methodologieën enigszins aangepast. Tijdens de dissectie van de hemi-calvarias werd PBS gebruikt om de muiskoppen te spoelen in plaats van cultuurmedia. Om het aantal cellen te bepalen dat nodig is om een effect op de calvaria's te produceren, werd het weefsel geïncubeerd met verschillende aantallen borstkankercellen. In het algemeen, 5 x 105 kankercellen werken goed voor een 7 dagen test. Ook, tijdens fixatie, tissue papier werd gebruikt in plaats van sponzen om de calvarias te beschermen. Het weefsel was goed bewaard gebleven in het papier.
Het beschreven model heeft een aantal beperkingen. De calvaria's van neonatale muizen missen een aantal van de componenten van de botten die de ontvanger zijn van metastasen, of het nu structurele (d.w.z. trabeculaire bot) of cellulaire componenten zoals immuuncellen of andere cellen van het beenmerg, waaronder hematopoietische stamcellen waarmee kankercellen interageren. De cultuur van de calvarias in vitro kan de volledige fysiopathologie niet simuleren. Ook als het gaat om botmetastasen, borstkankercellen zelden metastaseren naar de calvaria, en hebben de neiging om botten gunst met meer actieve bot remodelleren, zoals de wervels, de heup, of de lange botten van de armen en benen. Bovendien vertegenwoordigt de cocultuur van hemi-calvarias met kankercellen slechts de nieuwste stappen van de uitgezaaide cascade: de kolonisatie van het bot en de groei van de metastase. Bovendien wordt het aantal monsters beperkt door het aantal pups per nest. Het wordt aanbevolen om één nest per experiment te gebruiken en geen nesten te mengen om variaties in de resultaten te voorkomen. We verkregen vergelijkbare resultaten in bot remodelleren bij het gebruik van calvarias van BALB / c of FVB muizen, maar of de stam van invloed op de tijdreactie van bot remodelleren in deze test moet worden bepaald.
De belangrijkste voordelen van de calvarial ex vivo model in vergelijking met in vivo modellen zijn lagere kosten, eenvoud van de test, en kortere experimentele tijd om een bot remodelleren reactie te verkrijgen. De cocultuur van kankercellen en calvarias maakt het mogelijk om het celcontact afhankelijke interacties te bestuderen, evenals het effect van uitgescheiden factoren op botremodelleren, terwijl het gebruik van geconditioneerde media het mogelijk maakt zich te concentreren op het effect van oplosbare factoren. Bovendien kan het directe contactmodel de karakterisering van intercellulaire interacties en moleculaire mechanismen van de microomgeving van botmetastase vergemakkelijken, evenals de studie en evaluatie van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van skeletcomplicaties van maligniteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Mario Nomura, MD en Rodolfo Díaz voor hun hulp bij de histologie, en Pierrick Fournier, Ph.D. voor zijn waardevolle opmerkingen om de kwaliteit van het papier te verbeteren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
