Summary
يمكن أن تكون ثقافة الجسم الحي السابق للنباتات العظمية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا العظام والتقييم المحتمل للأدوية في إعادة عرض العظام وأمراض العظام. ويصف البروتوكول المقدم إعداد وثقافة الكلفاريا المعزولة عن جماجم الفئران حديثي الولادة، فضلا عن تطبيقاتها.
Abstract
العظام هي نسيج ضام يتكون من العظام، والعظام، والعظام ومصفوفة معدنية خارج الخلية، مما يعطيها قوتها والمرونة ويسمح لها بالوفاء بوظائفها. يتعرض العظم باستمرار لمجموعة متنوعة من المحفزات ، والتي في الحالات المرضية يمكن أن تؤدي إلى تحرير إعادة عرض العظام. لدراسة بيولوجيا العظام والأمراض وتقييم العوامل العلاجية المحتملة ، كان من الضروري تطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي.
تصف هذه المخطوطة عملية تشريح الكلفاريا المعزولة عن الفئران الوليدية والظروف الثقافية التي تُعزل عن الفئران الوليدية لدراسة تكوين العظام والبيئة الدقيقة لأورام العظام. على النقيض من نماذج المختبر وفي الجسم الحي ، يسمح هذا النموذج السابق للفحص الحي بالحفاظ على البيئة ثلاثية الأبعاد للأنسجة وكذلك التنوع الخلوي للعظم أثناء الزراعة في ظل ظروف محددة لمحاكاة البيئة الدقيقة المطلوبة. لذلك ، من الممكن التحقق من إعادة عرض العظام وآلياتها ، وكذلك التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى ، مثل التفاعلات بين الخلايا السرطانية والعظام.
والتجارب ذكرت هنا استخدام calvarias من 5-7 اليوم القديمة BALB / C الفئران. يتم استزراع الهيمي-كالفاريا التي تم الحصول عليها في وجود الأنسولين أو خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-231) أو المتوسطة المكيفة من ثقافات خلايا سرطان الثدي. بعد التحليل ، ثبت أن الأنسولين يسبب تكوين العظام الجديدة ، في حين أن الخلايا السرطانية وارتشاف العظام متوسط الحجم. وقد استخدم النموذج الكلوري بنجاح في البحوث الأساسية والتطبيقية لدراسة تطور العظام وأمراض العظام الناجمة عن السرطان. وعموما، بل هو خيار ممتاز لسهولة، ومفيدة، ومنخفضة التكلفة.
Introduction
العظام هي نسيج ضام ديناميكي له عدة وظائف، بما في ذلك دعم العضلات، وحماية الأعضاء الداخلية ونخاع العظام، وتخزين وإطلاق الكالسيوم وعوامل النمو1،2. للحفاظ على سلامتها ووظيفتها السليمة ، فإن أنسجة العظام تخضع باستمرار لعملية إعادة عرض. بشكل عام ، يمكن تقسيم دورة إعادة عرض العظام إلى ارتشاف العظام وتكوين العظام1. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين هاتين المرحلتين من إعادة عرض العظام إلى تطور أمراض العظام. أيضا, أمراض مثل سرطان الثدي غالبا ما تؤثر على سلامة العظام; ما يقرب من 70٪ من المرضى في المراحل المتقدمة لديهم أو سيكون لديهم نقائل العظام. عندما تدخل خلايا سرطان الثدي العظام ، فإنها تؤثر على استقلاب العظام ، مما يؤدي إلى ارتشاف مفرط (آفات العظام) و / أو تشكيل (آفات العظام)3.
لفهم بيولوجيا أمراض العظام وتطوير علاجات جديدة ، من الضروري فهم الآليات التي ينطوي عليها إعادة عرض العظام. في أبحاث السرطان ، من الضروري التحقيق في عملية الانبثاث العظمي وعلاقته بالبيئة الدقيقة النقيلية. في عام 1889 ، افترض ستيفن باجيت أن الانبثاث تحدث عندما يكون هناك توافق بين الخلايا السرطانية والأنسجة المستهدفة ، واقترح أن الموقع النقيلي يعتمد على تقارب الورم للبيئة الدقيقة4. في عام 1997، قدم موندي وغيس مفهوم "الحلقة المفرغة لنقائل العظام" لشرح كيفية تعديل الخلايا السرطانية للبيئة الدقيقة للعظام لتحقيق بقائها والنمو، وكيف تعزز البيئة الدقيقة للعظام نموها من خلال توفير الكالسيوم وعوامل النمو5،6،7.
لتوصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام والانبثاث العظام وتقييم الجزيئات مع إمكانات علاجية ممكنة، فقد كان من الضروري لتطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج تقدم حاليا العديد من القيود ، مثل التمثيل المبسط للبيئة الدقيقة للعظام ، وتكلفتها8،9. ثقافة العظام explants السابقين في الجسم الحي لديه ميزة الحفاظ على منظمة ثلاثية الأبعاد، فضلا عن تنوع خلايا العظام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحكم في الظروف التجريبية. نماذج explant تشمل ثقافة عظام مشط القدم، رؤساء الفخذ، calvarias، والنوى الفك السفلي أو trabecular10. وقد تم إثبات مزايا نماذج الجسم الحي السابقين في دراسات متنوعة. في عام 2009 ، ذكرت Nordstrand والمتعاونين إنشاء نموذج الثقافة المشتركة على أساس التفاعلات بين خلايا سرطان العظام والبروستاتا11. أيضا، في عام 2012، أفاد كورتين والمتعاونين تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام ex vivo cocultures12. والغرض من هذه النماذج الجسم الحي السابق هو إعادة ظروف البيئة الدقيقة العظام بأكبر قدر ممكن من الدقة لتكون قادرة على توصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام العادية أو المرضية وتقييم فعالية العوامل العلاجية الجديدة.
ويستند البروتوكول الحالي إلى الإجراءات التي نشرها غاريت13 ومحمد وآخرون14. وقد استخدمت ثقافات كالفاريا الفأر الوليدية كنموذج تجريبي، لأنها تحتفظ بالهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للعظم قيد التطوير والخلايا العظمية، بما في ذلك الخلايا في جميع مراحل التمايز (أي العظام، والعظام، والخلايا العظمية، والخلايا النجمية) التي تؤدي إلى العظام الناضجة والعظام، فضلا عن المصفوفة المعدنية14. نموذج الجسم الحي السابق لا يمثل العملية المرضية لأمراض العظام تماما. ومع ذلك، يمكن قياس الآثار على إعادة عرض العظام أو انسياب العظام الناجم عن السرطان بدقة.
وباختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية : تشريح calvarias من الفئران القديمة 5-7 أيام ، calvaria preculture ، تطبيقات ثقافة calvaria (على سبيل المثال ، الثقافة في وجود الأنسولين والخلايا السرطانية أو المتوسطة مكيفة ، وحتى وكلاء مع الإمكانات العلاجية ، وفقا لهدف التحقيق) ، تثبيت العظام وإزالة الكلس ، معالجة الأنسجة ، التحليل النسيجي ، وتفسير النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على جميع الفئران المستخدمة في هذه المقالات من سلالات فئران BALB/c ، باستخدام الفئران الذكور والإناث بشكل عشوائي. كما تم إجراء تجارب الثقافة السابقة باستخدام سلالات أخرى، مثل FVB، الفئران السويسرية، CD-1، والفئران CsA11،,12،,14. تم إيواء جميع الفئران وفقا للمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المبادئ التوجيهية ، التذييل س. تمت الموافقة على الإجراءات التي تشمل الحيوانات الموضوعات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية (IACUC) في مركز البحث العلمي والتعليم العالي في Ensenada (CICESE).
1- تشريح كالفاريال
- تعقيم أدوات تشريح (على سبيل المثال، 1 × 2 ملقط أنسجة الأسنان، مقص الجراحية على التوالي، تشريح مقص، ملاقط غرامة ذات رؤوس، طرف منحني غرامة تشريح ملقط، تشريح ملقط، مشرط). يمكن استخدام الماء المقطر المعقم لتنظيف الأدوات الجراحية بين كل تشريح ، ويمكن استخدام 1x PBS المعقم لتنظيف كل هيمي كالفاريا.
- ضع أدوات التشريح المعقم ، الماء ، 1x PBS ، والمواد المطلوبة لتنفيذ الإجراء (على سبيل المثال ، المايكروبيبات ، النظارات المترسبة ، أطباق بيتري العقيمة) في غطاء تدفق لامينار.
ملاحظة: تنفيذ الإجراء بأكمله في ظل ظروف معقمة. - أضف 12 مل من 1x مقسم تلفزيوني معقم إلى طبقين 10 سم بيتري.
- حدد الجراء ووضعها بالقرب من غطاء محرك السيارة.
ملاحظة: تشريح calvarias من الجراء 5-7 أيام القديمة. - اختيار وعقد الماوس بعناية باستخدام ملقط تشريح.
- قطع رأس الماوس باستخدام مقص تشريح ووضع الرأس في طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: قطع الرأس غير مناسب للفئران الأكبر سناً. إذا كان يجب إجراء التجربة مع الفئران الأكبر سنا ، يجب تعديل طريقة القتل الرحيم وفقًا لقواعد التجارب الحيوانية. - عقد الرأس بحزم من قبل منطقة الأنف مع 1 × 2 ملقط الأسنان الأسنان وإزالة الجلد على الجمجمة حتى calvaria مرئية.
- تحديد الغرز (أي الترهل، الإكليلي، واللامبيد) من الجمجمة على كالفاريا المكشوفة.
- اختراق مع غيض من المقص الدقيق حوالي 2 ملم وراء خياطة lambdoid وجعل قطع مستقيم جنبا إلى جنب معها.
- أدخل طرف المقص الصغير على الجانب الخلفي من الجمجمة. جعل قطع على التوالي على طول الجانب القاصي من خياطة اللامبيد نحو خياطة الإكليل. المضي قدما على نحو مماثل مع خياطة اللامبيد الأخرى.
- جعل قطع آخر (بزاوية 45 درجة) لربط نهاية القطع المحرز مع قطع فونتانل الأمامي.
- كرر الخطوات 1.10 و 1.11 مع خياطة اللامبيد الأخرى.
ملاحظة: من المهم تحديد الغرز لإجراء التخفيضات المناسبة ولتكون قادرة على إجراء تضمين كاف وتحليل البيانات. - استخدام ملقط غرامة تلميح لإزالة calvaria ووضعها في طبق بيتري. مع مشرط، وجعل قطع على التوالي من فونتانل الخلفي على طول خياطة القوس من خلال خياطة التاجيو وتنتهي في فونتانل الأمامي للحصول على اثنين من هيمي كالفارياس.
- التقاط كل من هيمي-calvarias مع ملاقط غرامة يميل ووضعها في طبق بيتري جديدة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
2- ثقافة كالفاريا
- إضافة 1 مل من متوسط DMEM عالية الجلوكوز تستكمل مع 0.1٪ الزلال مصل البقر (BSA) و 1٪ مضاد حيوي / مضاد للميكولتيك (أي البنسلين والعقدية) في آبار لوحة 24 جيدا. مع ملقط طرف غرامة، والتقاط كل هيمي-كالفاريا ووضعها في بئر.
ملاحظة: ضع الجانب المقعر hemi-calvarias لأسفل. - احتضان الهيمي-كالفاريا لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
- قم بإزالة وسط الثقافة من كل بئر وإضافة 1 مل من الوسائط الطازجة التي تحتوي على المركب لاختبار أو وسائط مكيفة من خلايا أخرى.
ملاحظة: استخدم ثلاثة على الأقل من السعرات الحرارية من hemi-calvarias لكل مجموعة معالجة واستخدم عناصر تحكم سالبة وإيجابية. - احتضان هيمي-كالفاريا لمدة 7 أيام، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
3. الثقافة مع الخلايا السرطانية
- حدد طبق بيتري مع الخلايا السرطانية في التقاء 80-90٪ والتربسينات لهم. لالتربسينزية، اغسل الخلايا السرطانية 1x باستخدام PBS (5 مل لكل 75 سم2 قارورة) تليها الحضانة في محلول HBSS يحتوي على 0.05٪ التربسين و 0.53 mM EDTA (2 مل لكل 75 سم2 قارورة).
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة وتجاهل supernatant.
- إعادة تعليق بيليه في 2 مل من DMEM تحتوي على 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ المضادات الحيوية / مضاد الأميكتيك. عد الخلايا الحية.
- تعيين هيمي-كالفارياإلى كل مجموعة دراسة (أي، مجموعة التحكم السلبي والثقافة المشتركة لالحمض النووي الريبي أو تحليل الأنسجة).
- إزالة وسائل الإعلام الثقافة من الكالفاريات هيمي وإضافة 1 مل من DMEM تحتوي على 2٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية / antimycotic تستكمل أو لا تستكمل مع الخلايا السرطانية.
ملاحظة: يمكن أن يتغير مقدار الخلايا التي يجب إضافتها اعتمادًا على خط الخلية الذي تم اختباره. مع الخلايا السرطانية مثل MDA-MB-231 أو PC-3، 500،000 خلية لكل عمل جيد يعمل بشكل مناسب. - احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تمرير كل هيمي كالفاريا إلى بئر جديد للاحتفاظ فقط الخلايا السرطانية التي تلتزم الأنسجة العظمية.
- احتضان لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
4- التثبيت
- قطع مربعات من ورق الأنسجة لالتفاف هيمي-كالفارياس.
ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام منصات رغوة الخزعة أو كبسولات الصلب للخزعات الصغيرة. - استخدام ملقط غرامة على التوالي لالتقاط كل من هيمي-كالفوريا من خياطة القوس، ووضع هاعلى ورقة الأنسجة، والتفاف.
- ضع الهيمي-كالفاريا الملفوفة داخل كاسيت تضمين مكتوب عليه.
- ضع الكاسيت في حاوية مع 10٪ فورمالين فوسفير المخزنة.
- إصلاح لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
5- إزالة الكلسة
- إزالة الفورمالين، إضافة 1x PBS، وتحريك الأنسجة لمدة 30 دقيقة لشطف هيمي-كالفارياس.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 10٪ EDTA (درجة الحموضة = 8، 0.34 M).
ملاحظة: تحقق من أن الحل يغطي الأنسجة بالكامل. - إزالة الكليسسيف الأنسجة لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
- تجاهل محلول EDTA وإضافة 1x PBS لشطف الأنسجة.
- تخزين هيمي كالفاريا سفي 70٪ الإيثانول حتى تجهيز الأنسجة.
6- معالجة الأنسجة
- تجفيف الأنسجة مع جولات من الإيثانول 96٪ ، 60 دقيقة (3x) ، تليها الإيثانول 100 ٪ ، 60 دقيقة (3x).
- استبدال الإيثانول بنسبة 100٪ xylene، 60 دقيقة (3x).
- احتضان الأشرطة في شمع البارافين، 60 دقيقة (2x).
7- التضمين
- فتح الأشرطة، وإزالة بعناية ورقة الأنسجة، وفك calvaria.
- التقاط كل calvaria بعناية وكومة جميع هيمي-calvarias من نفس المجموعة في نفس الاتجاه.
- ضع بعض البارافين في قالب
- التقاط جميع هيمي-calvarias مع ملقط ووضعها داخل القالب مع خياطة القوس أسفل نحو قاعدة القالب.
ملاحظة: اتجاه الهيمي-كالفاريا في القالب أثناء التضمين أمر بالغ الأهمية للحصول على أقسام النسيجية المتسقة والنتائج القابلة للتكرار لأن هذا التوجه سيسمح بالتعرف الخلفي للعظام الأمامية والجدارية من الكلفاريا والخياطة الإكليلية التي تسهل التقييم الكمي. - الافراج عن ملقط والتحقق من أن هيمي كالفاريا ستبقى في مكانها.
- ضع الكاسيت المسمى فوق القالب واملأه بالمزيد من البارافين لتغطية الهيمي-كالفارياس.
- نقل القوالب إلى السطح البارد.
8- قسمة
- تقليم 500-600 ميكرومتر من خياطة القوس مع microtome.
- قطع 4 ميكرومتر أقسام سميكة، وجمع المقاطع اللازمة.
- تقليم آخر 300 ميكرون.
- قص وجمع آخر ستة أقسام سميكة 4 ميكرون.
- تقليم كتلة 300 ميكرون كذلك وجمع المزيد من المقاطع.
- قم بتركيب المقاطع على شرائح المجهر الزجاجي.
- تجفيف الشرائح في RT.
9. تلطيخ
- تزج المقاطع في 100٪ xylene لمدة 3 دقيقة.
- الغمر في الإيثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة.
- دمج في 96٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
- تزج في الإيثانول 80٪ لمدة 1 دقيقة.
- الغمر في الإيثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة.
- شطف في الماء لمدة 3 دقيقة.
- غمر في هيماتوكسيلين لمدة 3 دقيقة.
- شطف في الماء حتى القسم واضح.
- غمر في محلول كربونات الليثيوم المشبعة لمدة 10 ثوان.
- شطف في الماء لمدة 3 دقيقة.
- مغمورة في 96٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
- غمر في إيوسين لمدة 3 دقيقة.
- تزج في 96٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
- الغمر في الإيثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة.
- غمر في 100٪ xylene لمدة 3 دقيقة.
- أضف بعضًا لكل وسط جبل إلى الشريحة وقم بحمايتها باستخدام قسيمة تغطية.
ملاحظة: يمكنك استكمال هيماتوكسيلين وإيوسين (H & E) تلطيخ مع الفوسفاتاتا حمض مقاومة الترطانات (TRAP) تلطيخ لتقييم هشاشة العظام وهشاشة العظام.
10 - التقييم الكمي: تحديد مجال التحليل
- فحص المقاطع تحت قوة منخفضة (أي 4x) لتحديد الاتجاه والغرز.
- تحديد خياطة الإكليلية وتحديد سطح العظام طويلة على جانب واحد وسطح قصير على الجانب الآخر.
- تحديد خياطة الإكليلتحت التكبير 40x، ونقل اثنين أو ثلاثة حقول بصرية بعيدا عن خياطة على طول السطح الطويل. التقط صورًا لهذه المنطقة لتحليلها.
- حدد منطقة العظام القديمة ومنطقة العظام الجديدة. وإيوسين Y مع البرتقالي G البقع العظام القديمة أغمق وأخف وزنا العظام الجديدة.
- قياس المساحة الإجمالية للعظم القديم والجديد مع برنامج Image J باستخدام أداة عتبة اللون. التعبير عن النتائج كما μm2.
11 - تحليل البيانات
- تحليل النتائج باستخدام البرامج الإحصائية. يمكن تحديد الاختلافات الكبيرة بين المجموعات باستخدام الاختبارات المناسبة (على سبيل المثال، اختبار مان ويتني يو غير البارامترية كما هو الحال في هيرل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم تكوين العظام في نموذج الكلفاري، قمنا بزراعة الهيمي-كالفاريا في الوسائط مع أو بدون 50 ميكروغرام/مل من الأنسولين. تم إعداد أقسام الأنسجة وملطخة بـ H & E. في هذه الظروف ، أظهر علم الأنسجة أنه تم الحفاظ على السلامة الهيكلية للعظم الكلوري ، مما يسمح بتحديد مكوناته المختلفة(الشكل 1). قدمت الكلفاريات المعالجة بالأنسولين زيادة في كمية الأنسجة العظمية مقارنة بالتحكم(الشكل 2A). أكد التحليل الكمي للمقاييس الهيمتومورفومترية لسمك ومنطقة العظام في هيمي-كالفاريا زيادة كبيرة لكلا المعلمتين في الأنسجة المعالجة بالأنسولين مقارنة بالتحكم(الشكل 2B). تشير هذه البيانات إلى جدوى بروتوكول نموذج الجسم الحي السابق لإعادة إنتاج ظروف تكوين العظام.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نموذج الجسم الحي السابق calvari لإعادة إنتاج السرطان والحالات الدقيقة العظام. تم استخدام البروتوكول لتقييم تأثير خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 على الكلفاريات المورين. لتنفيذ هذا، كانت العظام الكلفارية مباشرة شارك مع الخلايا السرطانية أو المستزرعة فقط مع وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا السرطانية. بعد 7 أيام من الثقافة ، تم تضمين الكلفاريات في البارافين ، وتم تنفيذ تلطيخ H & E. ويبدو أن الاستزراع المشترك مع خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 يزيد من انحلال العظام ، كما يتضح من انخفاض العظام والأضرار التي لحقت ببنية الكالفارية بالمقارنة مع calvarias التحكم المزروعة فقط مع وسائل الإعلام(الشكل 2A). أظهرت كمية منطقة العظام من الكالفاريات انخفاضا كبيرا في المساحة الإجمالية للعظام من الكلفاريا المستزرعة مع خلايا سرطان MDA-MB-231 مقارنة مع السيطرة(الشكل 2B). أظهرت هذه النتائج أن الثقافات المشتركة للخلايا السرطانية ذات الأنسجة الكلفارية يمكن أن تعيد خلق بيئة السرطان والعظام الدقيقة ويمكن استخدامها للتحقيق في آليات انبثاث العظام العظمية أو لتقييم مثبطات محتملة لهذه العملية.
الشكل 1: البنية النسيجية للعظم الكلفاري. قسم الأنسجة التمثيلية من هيمي-كالفاريا بعد تلطيخ H & E. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زاد الأنسولين من منطقة العظام وسماكة الجسم الحي السابق هيمي-كالفارياس في حين أن الاستزراع المشترك لهيمي-كالفارياس مع خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 الناجمة عن التهاب العظام. بالنسبة لنموذج تكوين العظام، تم استزراع الهيمي-كالفاريا في وجود أو عدم وجود الأنسولين (50 ميكروغرام/مل)، بينما بالنسبة للزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية، تم استزراع الهيمي-كالفاريافيا في وجود أو عدم وجود 5 × 105 خلايا MDA-MB-231 لمدة 7 أيام وتم إجراء تحليل لللقياس الهيمتومورفومترية على أقسام ملطخة بـ H&E. (أ)أقسام الأنسجة التمثيلية. (ب)تحليل القياسات الهيمتومورفية لمنطقة العظام. يتم تمثيل النتائج كمتوسط ± SEM (n = 3). * P < 0.05، غير بارامترية مان ويتني يو الاختبار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، ونحن نصف بروتوكول لنموذج الجسم الحي السابق calvari لتقييم تكوين العظام أو ارتشاف ودراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع عظم الفأر ة calvarial. الخطوات الحاسمة لهذه التقنية هي تشريح ، والثقافة ، والتضمين ، وتحليل الكالفتريا. خلال تشريح الكالفاريات ، من الأهمية بمكان قطع الهيمي -كالفاريا إلى شبه منحرف ، لأنه سيسهل بقوة التوجه أثناء إدراج البارافين. عند دراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع الكلفاريات، من المهم استخدام لوحات متعددة الآبار التي لا يتم علاجها لثقافة الخلايا لمنع الخلايا السرطانية من التمسك والنمو على البلاستيك بدلا من العظام. أثناء دمج الأنسجة ، من المهم توجيه كل هيمي كالفاريا بعناية. يجب وضعها بطريقة عمودية مع الحدود المترهلة على الجانب الخارجي من كتلة البارافين. اتجاه العظام ضروري للحصول على أقسام النسيج ية متسقة ونتائج قابلة للتكرار. وبالمثل، من الأهمية بمكان للاتساق خلال التحليل الهيمتومورفومتري تحديد منطقة معينة في كالفاريا لقياس إعادة عرض العظام. هنا، حددنا أولاً الخياطة التاجية ثم سطح العظام الطويل حيث تم التقاط الصور والقياسات.
ولتحقيق التوحيد وتطوير البروتوكولات الموصوفة، قمنا بتعديل بعض المنهجيات المعمول بها بشكل طفيف. أثناء تشريح الهيمي-كالفاريا، تم استخدام PBS لشطف رؤوس الماوس بدلاً من الوسائط الثقافية. لتحديد عدد الخلايا اللازمة لإنتاج تأثير على الكلفاريا، تم احتضان الأنسجة مع أعداد مختلفة من خلايا سرطان الثدي. بشكل عام، 5 × 105 الخلايا السرطانية تعمل بشكل جيد ل7 يوم فحص. أيضا، أثناء التثبيت، تم استخدام ورق الأنسجة بدلا من الإسفنج لحماية الكالفاريات. الأنسجة كانت محفوظة جيداً داخل الورقة
النموذج الموصوف له بعض القيود. تفتقر الكالفاريات من الفئران الوليدية إلى بعض مكونات العظام التي تتلقى الانبثاث ، سواء كانت هيكلية (أي عظم ترابيكلار) أو مكونات خلوية مثل الخلايا المناعية أو الخلايا الأخرى لنخاع العظام ، بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تتفاعل معها الخلايا السرطانية. ثقافة الكالفاريات في المختبر لا يمكن محاكاة علم الأمراض الفيزيولوجية الكامل. أيضا، عندما يتعلق الأمر الانبثاث العظام، خلايا سرطان الثدي نادرا ما تنتشر إلى كالفاريا، وتميل إلى تفضيل العظام مع إعادة عرض العظام أكثر نشاطا، مثل الفقرات، الورك، أو العظام الطويلة من الذراعين والساقين. الى جانب ذلك ، فإن الثقافة المشتركة للهيمي كالفاريا مع الخلايا السرطانية لا تمثل سوى أحدث خطوات التعاقب النقيلي: استعمار العظام ونمو الانبثاث. وعلاوة على ذلك، فإن عدد العينات محدود بعدد الجراء لكل فضلات. من المستحسن استخدام القمامة واحدة لكل تجربة وليس خلط القمامة لتجنب الاختلافات داخل النتائج. حصلنا على نتائج مماثلة في إعادة عرض العظام عند استخدام الكلفاريا من فئران BALB /c أو FVB ، ولكن ما إذا كانت السلالة تؤثر على استجابة الوقت لإعادة عرض العظام في هذا المقتفي يبقى تحديدًا.
المزايا الرئيسية لنموذج الجسم الحي السابق calvari مقارنة مع في نماذج الجسم الحي تشمل انخفاض التكلفة, بساطة من تحليل, وأقصر وقت تجريبي للحصول على استجابة إعادة عرض العظام. يسمح الاستزراع المشترك للخلايا السرطانية والكالفاريات بدراسة التفاعلات التابعة للاتصال بالخلايا بالإضافة إلى تأثير العوامل السرى على إعادة عرض العظام ، في حين أن استخدام الوسائط المكيفة يسمح بالتركيز على تأثير العوامل القابلة للذوبان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لنموذج الاتصال المباشر تسهيل توصيف التفاعلات بين الخلايا والآليات الجزيئية للبيئة الدقيقة للانبثاث العظمي ، وكذلك دراسة وتقييم الأدوية الجديدة لعلاج مضاعفات الهيكل العظمي للأورام الخبيثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون ماريو نومورا، دكتوراه في الطب ورودولفو دياز لمساعدتهم في علم الأنسجة، وبييرك فورنييه، دكتوراه لتعليقاته القيمة لتحسين نوعية الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
