Summary
A cultura ex vivo de explantas ósseas pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia óssea e a avaliação potencial de medicamentos na remodelagem óssea e doenças ósseas. O protocolo apresentado descreve a preparação e a cultura de calvarias isoladas de crânios de camundongos recém-nascidos, bem como suas aplicações.
Abstract
Osso é um tecido conjuntivo constituído de osteoblastos, osteócitos e osteoclastos e uma matriz extracelular mineralizada, o que lhe dá sua força e flexibilidade e permite que ele cumpra suas funções. O osso é continuamente exposto a uma variedade de estímulos, que em condições patológicas podem desregulamentar a remodelagem óssea. Para estudar biologia óssea e doenças e avaliar potenciais agentes terapêuticos, é necessário desenvolver modelos in vitro e in vivo.
Este manuscrito descreve o processo de dissecção e as condições de cultura das calvarias isoladas dos camundongos neonatais para estudar a formação óssea e o microambiente do tumor ósseo. Em contraste com os modelos in vitro e in vivo, este modelo ex vivo permite a preservação do ambiente tridimensional do tecido, bem como a diversidade celular do osso enquanto cultura condições definidas para simular o microambiente desejado. Assim, é possível investigar a remodelagem óssea e seus mecanismos, bem como as interações com outros tipos de células, como as interações entre células cancerígenas e osso.
Os ensaios aqui relatados usam calvarias de ratos BALB/C de 5 a 7 dias de idade. As hemi-calvarias obtidas são cultivadas na presença de insulina, células cancerígenas de mama (MDA-MB-231), ou meio condicionado a partir de culturas de células cancerígenas de mama. Após análise, foi estabelecido que a insulina induziu nova formação óssea, enquanto as células cancerosas e sua reabsorção óssea média condicionada. O modelo calvarial tem sido usado com sucesso em pesquisas básicas e aplicadas para estudar o desenvolvimento ósseo e doenças ósseas induzidas pelo câncer. No geral, é uma excelente opção para um ensaio fácil, informativo e de baixo custo.
Introduction
O osso é um tecido conjuntivo dinâmico que possui várias funções, incluindo apoiar os músculos, proteger os órgãos internos e a medula óssea, e armazenar e liberar fatores de cálcio e crescimento1,2. Para manter sua integridade e função adequada, o tecido ósseo está continuamente o processo de remodelação. Em termos gerais, um ciclo de remodelagem óssea pode ser dividido em reabsorção óssea e formação óssea1. Um desequilíbrio entre essas duas fases de remodelagem óssea pode levar ao desenvolvimento de patologias ósseas. Além disso, doenças como o câncer de mama geralmente afetam a integridade óssea; aproximadamente mais de 70% dos pacientes em estágio avançado têm ou terão metástases ósseas. Quando as células cancerígenas de mama entram nos ossos, elas afetam o metabolismo ósseo, resultando em reabsorção excessiva (lesões osteoclásticas) e/ou formação (lesões osteoblásticas)3.
Para entender a biologia das doenças ósseas e desenvolver novos tratamentos, é necessário compreender os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea. Na pesquisa do câncer, é essencial investigar o processo de metástase óssea e sua relação com o microambiente metastático. Em 1889, Stephen Paget supôs que as metástases ocorrem quando há compatibilidade entre as células tumorais e o tecido alvo, e sugeriu que o local metastático depende da afinidade do tumor para o microambiente4. Em 1997, Mundy e Guise introduziram o conceito de "ciclo vicioso de metástases ósseas" para explicar como as células tumorais modificam o microambiente ósseo para alcançar sua sobrevivência e crescimento, e como o microambiente ósseo promove seu crescimento fornecendo cálcio e fatores de crescimento5,6,7.
Para caracterizar os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea e na metástase óssea e avaliar moléculas com potencial terapêutico possível, é necessário desenvolver modelos in vitro e in vivo. No entanto, esses modelos apresentam atualmente muitas limitações, como a representação simplificada do microambiente ósseo, e seu custo8,9. A cultura das explantas ósseas ex vivo tem a vantagem de manter a organização tridimensional, bem como a diversidade de células ósseas. Além disso, as condições experimentais podem ser controladas. Os modelos de explante incluem a cultura de ossos metatarsos, cabeças femorais, calvarias e núcleos mandibulares ou trabeculares10. As vantagens dos modelos ex vivo têm sido demonstradas em diversos estudos. Em 2009, Nordstrand e colaboradores relataram o estabelecimento de um modelo de cocultura baseado nas interações entre células cancerígenas ósseas e de próstata11. Além disso, em 2012, Curtin e colaboradores relataram o desenvolvimento de um modelo tridimensional utilizando coculturas ex vivo 12. O objetivo desses modelos ex vivo é recriar as condições do microambiente ósseo com a maior precisão possível para poder caracterizar os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea normal ou patológica e avaliar a eficácia de novos agentes terapêuticos.
O presente protocolo baseia-se nos procedimentos publicados por Garrett13 e Mohammad et al.14. Culturas de calvaria neonatal do rato têm sido utilizadas como modelo experimental, pois mantêm a arquitetura tridimensional do osso em desenvolvimento e células ósseas, incluindo células em todos os estágios de diferenciação (ou seja, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, osteócitos, células estrômicas) que levam a osteoclastos maduros e osteoblastos, bem como a matriz mineralizada14. O modelo ex vivo não representa totalmente o processo patológico das doenças ósseas. No entanto, os efeitos na remodelagem óssea ou na osteólise óssea induzida pelo câncer podem ser medidos com precisão.
Resumidamente, este protocolo consiste nas seguintes etapas: dissecção de calvarias de camundongos de 5 a 7 dias de idade, pré-cultura calvariada, aplicações de cultura calvariada (por exemplo, cultura na presença de insulina, células cancerosas ou meio condicionado, e até mesmo agentes com potencial terapêutico, segundo o objetivo da investigação), fixação óssea e decalcificação da calvaria, processamento de tecidos, análise histológica e interpretação de resultados.
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Protocol
Todos os camundongos utilizados nesses ensaios foram obtidos de cepas de camundongos BALB/C, utilizando camundongos machos e fêmeas indiscriminadamente. Experimentos culturais anteriores também foram realizados utilizando outras cepas, como FVB, camundongos suíços, CD-1 e csA mice11,12,14. Todos os camundongos foram alojados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH), o apêndice Q. Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais (IACUC) do Centro de Pesquisa Científica e Ensino Superior da Ensenada (CICESE).
1. Dissecção calvarial
- Esterilizar instrumentos de dissecção (por exemplo, 1 x 2 fórceps de tecido dentário, tesoura cirúrgica reta, tesoura dissecando, pinças de ponta fina, pinças curvas finas dissecando fórceps, cocendo fórceps, bisturi). Água destilada estéril pode ser usada para limpar as ferramentas cirúrgicas entre cada dissecção, e 1x PBS estéril pode ser usado para limpar cada hemi-calvaria.
- Coloque os instrumentos de dissecção estéreis, água, 1x PBS, e materiais necessários para realizar o procedimento (por exemplo, micropipetas, copos precipitados, placas de Petri estéreis) em uma capa de fluxo laminar.
NOTA: Realize todo o procedimento em condições estéreis. - Adicione 12 mL de 1x PBS estéril em duas placas de Petri de 10 cm.
- Selecione os filhotes e coloque-os perto do capô.
NOTA: Dissecar as calvarias de filhotes de 5 a 7 dias de idade. - Escolha e segure o mouse cuidadosamente usando fórceps de dissecar.
- Decapite o mouse usando uma tesoura de dissecação e coloque a cabeça em uma placa de Petri com PBS.
NOTA: A decapitação não é adequada para ratos mais velhos. Se o experimento deve ser feito com camundongos mais velhos, o método da eutanásia deve ser modificado de acordo com as regras de experimentação animal. - Segure a cabeça firmemente pela área do nariz com 1 x 2 fórceps de tecido dentário e remova a pele sobre o crânio até que a calvaria seja visível.
- Identifique as suturas (ou seja, sagittal, coronal e lambdoide) do crânio na calvária exposta.
- Penetre com a ponta da microtesoura aproximadamente 2 mm atrás da sutura lambdoide e faça um corte reto ao lado.
- Insira a ponta da microtesoura na parte traseira do crânio. Faça um corte reto ao longo do lado distal da sutura lambdoide em direção à sutura coronal. Proceda da mesma forma com a outra sutura lambdoide.
- Faça outro corte (em um ângulo de 45°) para conectar a extremidade do corte feito com o corte do fontanel anterior.
- Repita as etapas 1.10 e 1.11 com a outra sutura lambdoide.
NOTA: É importante identificar as suturas para fazer cortes adequados e ser capaz de realizar a incorporação adequada e a análise dos dados. - Use fórceps de ponta fina para remover a calvaria e coloque-a em uma placa de Petri. Com um bisturi, faça um corte reto do fontanel posterior ao longo da sutura sagital através da sutura coronal e terminando no fontanel anterior para obter duas hemi-calvarias.
- Pegue cada uma das hemi-calvarias com as pinças de ponta fina e coloque-as em uma nova placa de Petri contendo PBS.
2. Cultura calvariada
- Adicione 1 mL de médio DMEM de alta glicose suplementado com albumina de soro bovino de 0,1% (BSA) e 1% antibiótico/antimicótico (ou seja, penicilina e estreptomicina) nos poços de uma placa de 24 poços. Com fórceps finos, pegue cada hemi-calvaria e coloque-o em um poço.
NOTA: Coloque o lado côncavo hemi-calvarias para baixo. - Incubar as hemi-calvarias por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
- Remova o meio de cultura de cada poço e adicione 1 mL de mídia fresca contendo o composto para testar ou condicionar a mídia de outras células.
NOTA: Use pelo menos três hemi-calvarias para cada grupo de tratamento e use controles negativos e positivos. - Incubar as hemi-calvarias por 7 dias, mudando a mídia a cada 2-3 dias.
3. Cultura com células cancerígenas
- Selecione uma placa de Petri com células cancerígenas a 80-90% de confluência e tente-as. Para trippsinizar, lave as células cancerígenas 1x usando PBS (5 mL por 75 cm2 frasco) seguida de incubação em uma solução HBSS contendo 0,05% de tripsina e 0,53 mM EDTA (2 mL por 75 cm2 frasco).
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Remova e descarte o sobrenadante.
- Resuspender a pelota em 2 mL de DMEM contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico/antimicótico. Conte células vivas.
- Atribuir hemi-calvarias a cada grupo de estudo (ou seja, o grupo de controle negativo e cocultura para análise de RNA ou histologia).
- Remova a mídia cultural das hemi-calvarias e adicione 1 mL de DMEM contendo 2% de FBS e 1% de antibiótico/antimicótico suplementado ou não com células cancerosas.
NOTA: A quantidade de células a serem adicionadas pode mudar dependendo da linha celular testada. Com células cancerígenas como MDA-MB-231 ou PC-3, 500.000 células por poço funcionam adequadamente. - Incubar por 24 h a 37 °C com 5% de CO2. Passe cada hemi-calvaria para um novo poço para reter apenas células cancerígenas que aderiram ao tecido ósseo.
- Incubar por 7 dias a 37 °C com 5% de CO2 e mudar a mídia a cada 2-3 dias.
4. Fixação
- Corte quadrados de papel de tecido para embrulhar as hemi-calvarias.
NOTA: Também podem ser utilizadas pastilhas de espuma de biópsia ou cápsulas de aço para pequenas biópsias. - Use pinças de ponta fina reta para pegar cada hemi-calvaria da sutura sagital, coloque em um papel de tecido e enrole.
- Coloque a hemi-calvaria embrulhada dentro de um de incorporação rotulado.
- Coloque o em um recipiente com 10% de formalina tamponada com fosfato.
- Fixe para 24 horas a 4 °C.
5. Decalcificação
- Retire a formalina, adicione 1x PBS e agite os tecidos por 30 min para enxaguar as hemi-calvarias.
- Remova o PBS e adicione 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M).
NOTA: Verifique se a solução cobre completamente os tecidos. - Descalcificar os tecidos por 48 h a 4 °C.
- Descarte a solução EDTA e adicione 1x PBS para enxaguar o tecido.
- Guarde as hemi-calvarias em 70% de etanol até o processamento da histologia.
6. Processamento de tecidos
- Desidratar os tecidos com rodadas de 96% de etanol, 60 min (3x), seguido por 100% etanol, 60 min (3x).
- Substitua o etanol por 100% de xileno, 60 min (3x).
- Incubar os em cera de parafina, 60 min (2x).
7. Incorporação
- Abra as fitas, remova cuidadosamente o papel de tecido e desembrulhe a calvaria.
- Pegue cada calvaria cuidadosamente e empilhe todas as hemi-calvarias do mesmo grupo na mesma orientação.
- Coloque um pouco de parafina em um molde.
- Pegue todas as hemi-calvarias com os fórceps e coloque-os dentro do molde com a sutura sagital para baixo em direção à base do molde.
NOTA: A orientação das hemi-calvarias no molde durante a inclusão é crucial para obter seções histológicas consistentes e resultados reprodutíveis, pois essa orientação permitirá a identificação posterior dos ossos dianteiros e parietais das calvarias e a sutura coronal facilitando a avaliação quantitativa. - Solte os fórceps e verifique se as hemi-calvarias permanecem no lugar.
- Coloque o rotulado em cima do molde e encha-o com mais parafina para cobrir as hemi-calvarias.
- Mova os moldes para a superfície fria.
8. Secção
- Corte 500-600 μm da sutura sagital com o microtome.
- Corte seções de 4 μm de espessura e colete as seções necessárias.
- Apare mais 300 μm.
- Corte e colete outras seis seções de 4 μm de espessura.
- Corte o bloco 300 μm mais e colete mais seções.
- Monte as seções em lâminas de microscópio de vidro.
- Seque os slides no RT.
9. Coloração
- Mergulhe as seções em 100% de xileno por 3 min.
- Submergir em 100% de etanol por 1 min.
- Mesclar 96% de etanol por 1 min.
- Mergulhe em 80% de etanol por 1 min.
- Submergir em 70% de etanol por 1 min.
- Enxágüe na água por 3 min.
- Submergir em hematoxilina por 3 min.
- Enxágüe na água até que a seção esteja limpa.
- Mergulhe em uma solução saturada de carbonato de lítio por 10 segundos.
- Enxágüe na água por 3 min.
- Submergir em 96% de etanol por 1 min.
- Submergir em eosinpor por 3 min.
- Imersão em 96% de etanol por 1 min.
- Submergir em 100% de etanol por 1 min.
- Mergulhe em 100% de xileno por 3 min.
- Adicione um pouco por meio de montagem ao slide e proteja-o com um deslizamento de cobertura.
NOTA: Você pode complementar a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) com coloração de fosfatase ácida resistente à tartê (TRAP) para avaliar osteoclasto e osteólise.
10. Avaliação quantitativa: definição de área para análise
- Examine as seções baixa potência (ou seja, 4x) para identificar a orientação e as suturas.
- Defina a sutura coronal e identifique a superfície óssea longa de um lado e a superfície curta do outro.
- Identifique a sutura coronal ampliação de 40x e mova dois ou três campos ópticos para longe da sutura ao longo da superfície longa. Capture imagens desta área para análise.
- Defina a área óssea antiga e a nova área óssea. O eosinY com G laranja mancha o osso mais escuro e o novo isqueiro ósseo.
- Meça a área óssea total do osso antigo e novo com o software Image J usando a ferramenta limiar de cor. Expresse os resultados como μm2.
11. Análise de dados
- Analise os resultados usando software estatístico. Diferenças significativas entre os grupos podem ser determinadas usando testes apropriados (por exemplo, teste não paramétrico de Mann-Whitney U como é feito aqui).
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Representative Results
Para avaliar a formação óssea no modelo calvarial, cultivamos as hemi-calvarias em mídia com ou sem 50 μg/mL de insulina. As seções teciduais foram preparadas e manchadas com H&E. Nessas condições, a histologia mostrou que a integridade estrutural do osso calvarial foi mantida, permitindo a identificação de seus diferentes componentes (Figura 1). As calvarias tratadas com insulina apresentaram aumento na quantidade de tecido ósseo em relação ao controle (Figura 2A). A análise fitomorfométrica quantitativa para a espessura e a área óssea da hemi-calvaria confirmou um aumento significativo para ambos os parâmetros nos tecidos tratados com insulina em comparação com o controle(Figura 2B). Esses dados indicam a viabilidade do protocolo do modelo ex vivo para reproduzir condições de formação óssea.
Além disso, o modelo calvarial ex vivo pode ser usado para reproduzir condições de câncer e microambiente ósseo. O protocolo foi utilizado para avaliar o efeito das células cancerígenas de mama MDA-MB-231 nas calvarias murinas. Para isso, os ossos calvariais foram diretamente cocultos com as células cancerosas ou cultivados apenas com a mídia condicionada das células cancerosas. Após 7 dias de cultura, as calvarias foram incorporadas na parafina, e a coloração de H&E foi realizada. A cocultura com células cancerígenas de mama MDA-MB-231 parecia aumentar a osteólise, como mostra a diminuição do osso e os danos à estrutura calvarial quando comparados com as calvarias de controle cultivadas apenas com mídia(Figura 2A). A quantificação da área óssea das calvarias mostrou uma diminuição significativa na área óssea total das calvarias cultivadas com células cancerígenas MDA-MB-231 em comparação com o controle(Figura 2B). Esses resultados demonstraram que as coculturas das células cancerígenas com tecido calvarial podem recriar o câncer e o microambiente ósseo e podem ser usadas para investigar os mecanismos de metástase óssea osteolítica ou para avaliar possíveis inibidores desse processo.
Figura 1: Estrutura histológica do osso calvarial. Seção de tecido representativa da hemi-calvaria após a coloração de H&E. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A insulina aumentou a área óssea e a espessura da hemi-calvarias ex vivo, enquanto a cocultura de hemi-calvarias com células cancerígenas de mama MDA-MB-231 induziu a osteólise. Para o modelo de formação óssea, as hemi-calvarias foram cultivadas na presença ou ausência de insulina (50 μg/mL), enquanto para a cocultura com células cancerígenas, as hemi-calvarias foram cultivadas na presença ou ausência de 5 x 105 células MDA-MB-231 durante 7 dias e a análise histomorfométrica foi realizada em seções manchadas de H&E. (A)Seções de tecido representativas. (B) Análise histomorfométrica da área óssea. Os resultados são representados como a média ± SEM (n = 3). *P < 0,05, teste não paramétrico de Mann-Whitney U. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos o protocolo para um modelo calvarial ex vivo para avaliar a formação ou reabsorção óssea e estudar as interações das células cancerígenas com osso do rato calvarial. Os passos críticos dessa técnica são a dissecção, cultura, incorporação e análise histomorfométrica das calvarias. Durante a dissecção das calvarias, é crucial cortar a hemi-calvarias em um trapézio, pois facilitará fortemente a orientação durante a inclusão da parafina. Ao estudar as interações das células cancerígenas com as calvarias, é importante usar placas multibem que não são tratadas para a cultura celular para evitar que as células cancerígenas aderem e cresçam no plástico em vez do osso. Durante a inclusão tecidual, é importante orientar cuidadosamente cada hemi-calvaria. Eles precisam ser colocados de forma vertical com a borda sagital no lado externo do bloco de parafina. A orientação do osso é essencial para obter seções histológicas consistentes e resultados reprodutíveis. Da mesma forma, é fundamental que a consistência durante a análise histomorfométrica defina uma região específica na calvaria para medir a remodelagem óssea. Aqui, identificamos primeiro a sutura coronal e, em seguida, a longa superfície óssea onde as fotos foram tiradas e as medidas feitas.
Para alcançar a padronização e desenvolver os protocolos descritos, modificamos algumas metodologias estabelecidas ligeiramente. Durante a dissecção das hemi-calvarias, a PBS foi usada para enxaguar as cabeças de rato em vez da mídia cultural. Para determinar o número de células necessárias para produzir um efeito sobre as calvarias, o tecido foi incubado com diferentes números de células cancerígenas de mama. Em geral, 5 x105 células cancerígenas funcionam bem para um ensaio de 7 dias. Além disso, durante a fixação, o papel de tecido foi usado em vez de esponjas para proteger as calvarias. O tecido estava bem preservado dentro do papel.
O modelo descrito tem algumas limitações. As calvarias dos camundongos neonatais não possuem alguns dos componentes dos ossos que são receptores de metástases, sejam estruturais (ou seja, ossos trabeculares) ou componentes celulares, como células imunes ou outras células da medula óssea, incluindo células-tronco hematopoiéticas com as quais as células cancerígenas interagem. A cultura das calvarias in vitro não pode simular a fisiopatologia completa. Além disso, quando se trata de metástases ósseas, as células cancerígenas de mama raramente se metástase à calvaria, e tendem a favorecer ossos com remodelação óssea mais ativa, como as vértebras, o quadril ou os ossos longos dos braços e pernas. Além disso, a cocultura das hemi-calvarias com células cancerosas representa apenas os últimos passos da cascata metastática: a colonização do osso e o crescimento da metástase. Além disso, o número de amostras é limitado pelo número de filhotes por ninhada. Recomenda-se usar uma ninhada por experimento e não misturar ninhadas para evitar variações dentro dos resultados. Obtivemos resultados semelhantes na remodelagem óssea ao usar calvarias de ratos BALB/c ou FVB, mas ainda não se sabe se a tensão afeta a resposta temporal da remodelagem óssea neste ensaio.
As principais vantagens do modelo calvarial ex vivo em relação aos modelos in vivo incluem menor custo, simplicidade do ensaio e menor tempo experimental para obter uma resposta de remodelação óssea. A cocultura de células cancerígenas e calvarias permite estudar as interações dependentes de contato celular, bem como o efeito de fatores secretos na remodelagem óssea, enquanto o uso de mídia condicionada permite focar no efeito de fatores solúveis. Além disso, o modelo de contato direto pode facilitar a caracterização de interações intercelulares e mecanismos moleculares do microambiente de metástase óssea, bem como o estudo e avaliação de novos fármacos para o tratamento de complicações esqueléticas de malignidades.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Mario Nomura, M.D. e Rodolfo Díaz pela ajuda com a histologia, e Pierrick Fournier, Ph.D. por seus valiosos comentários para melhorar a qualidade do artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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