Summary
Ex vivo-kulturen av benexplantor kan vara ett värdefullt verktyg för studier av benfysiologi och den potentiella utvärderingen av läkemedel vid benombyggnad och bensjukdomar. Det presenterade protokollet beskriver beredningen och kulturen av calvarias isolerade från nyfödda möss skallar, liksom dess tillämpningar.
Abstract
Ben är en bindväv som består av osteoblaster, osteocyter och osteoklaster och en mineraliserad extracellulär matris, vilket ger den dess styrka och flexibilitet och gör det möjligt att uppfylla sina funktioner. Ben utsätts kontinuerligt för en mängd olika stimuli, som under patologiska förhållanden kan avreglera benombyggnad. För att studera benbiologi och sjukdomar och utvärdera potentiella terapeutiska medel har det varit nödvändigt att utveckla in vitro- och in vivo-modeller.
Detta manuskript beskriver dissekeringsprocessen och kulturförhållandena hos calvarias isolerade från neonatalmöss för att studera benbildning och bentumörmikromiljön. I motsats till in vitro- och in vivo-modeller möjliggör denna ex vivo-modell bevarande av vävnadens tredimensionella miljö samt benets cellulära mångfald medan den underdefinierade förhållanden mognar för att simulera önskad mikromiljö. Därför är det möjligt att undersöka benombyggnad och dess mekanismer, samt interaktioner med andra celltyper, såsom interaktioner mellan cancerceller och ben.
De analyser som rapporteras här använder calvarias från 5-7 dagar gamla BALB / C möss. Den hemi-calvarias erhålls odlas i närvaro av insulin, bröstcancerceller (MDA-MB-231), eller konditionerat medium från bröstcancer cellkulturer. Efter analys fastställdes det att insulin inducerade ny benbildning, medan cancerceller och deras konditionerade medium inducerad ben resorption. Calvarial modellen har framgångsrikt använts i grundläggande och tillämpad forskning för att studera benutveckling och cancer-inducerad bensjukdomar. Sammantaget är det ett utmärkt alternativ för en enkel, informativ och låg kostnad analys.
Introduction
Ben är en dynamisk bindväv som har flera funktioner, inklusive stödja musklerna, skydda de inre organen och benmärgen, och lagra och släppa kalcium och tillväxtfaktorer1,2. För att bibehålla sin integritet och korrekta funktion är benvävnaden kontinuerligt under processen att omforma. I allmänna ordalag kan en cykel av ben ombyggnad delas in i benresorption och benbildning1. En obalans mellan dessa två faser av ben ombyggnad kan leda till utveckling av benpatologier. Också, sjukdomar som bröstcancer påverkar ofta ben integritet; cirka mer än 70% av patienterna i avancerade stadier har eller kommer att ha benmetastaser. När bröstcancerceller kommer in i benen påverkar de benmetabolismen, vilket resulterar i överdriven resorption (osteoklastiska lesioner) och/eller bildning (osteoblastiska lesioner)3.
För att förstå skelettsjukdomarnas biologi och utveckla nya behandlingar är det nödvändigt att förstå de mekanismer som är involverade i benombyggnad. Inom cancerforskningen är det viktigt att undersöka benmetastaseringsprocessen och dess relation till den metastaserande mikromiljön. I 1889, Stephen Paget hypotesen att metastaser uppstår när det finns kompatibilitet mellan tumörcellerna och målvävnaden, och föreslog att den ögonbevarande platsen beror på affiniteten av tumören för mikromiljön4. År 1997 introducerade Mundy och Guise begreppet "ond cirkel av benmetastaser" för att förklara hur tumörceller ändra benmikromiljön för att uppnå sin överlevnad och tillväxt, och hur benmikromiljön främjar deras tillväxt genom att tillhandahålla kalcium- och tillväxtfaktorer5,6,7.
För att karakterisera de mekanismer som är involverade i benremodeling och benmetastasering och att utvärdera molekyler med möjlig terapeutisk potential, har det varit nödvändigt att utveckla in vitro- och in vivo-modeller. Dessa modeller har dock för närvarande många begränsningar, såsom den förenklade representationen av benmikromiljön, och deras kostnad8,9. Kulturen av ben explants ex vivo har fördelen av att upprätthålla den tredimensionella organisationen samt mångfalden av benceller. Dessutom kan experimentella förhållanden kontrolleras. Den explant modeller inkluderar kultur av mellanfot ben, femorala huvuden, calvarias, och mandibular eller trabecular kärnor10. Fördelarna med ex vivo-modellerna har visats i olika studier. Under 2009 rapporterade Nordstrand och samarbetspartners att det upprättades en samkulturmodell baserad på samspelet mellan ben- och prostatacancerceller11. Även i 2012, Curtin och medarbetare rapporterade utvecklingen av en tredimensionell modell med ex vivo cocultures12. Syftet med sådana ex vivo-modeller är att återskapa villkoren för benmikromiljön så exakt som möjligt för att kunna karakterisera de mekanismer som är involverade i normal eller patologisk benombyggnad och utvärdera effekten av nya terapeutiska medel.
Detta protokoll bygger på de förfaranden som offentliggjorts av Garrett13 och Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer har använts som en experimentell modell, eftersom de behåller den tredimensionella arkitekturen i benet under utveckling och benceller, inklusive celler i alla stadier av differentiering (dvs osteoblaster, osteoklaster, osteocyter, stromalceller) som leder till mogna osteoklaster och osteoblaster, samt den mineraliseradematrisen 14. Ex vivo-modellen representerar inte den patologiska processen av bensjukdomar helt. Emellertid, effekter på ben remodeling eller cancer-inducerad ben osteolys kan mätas noggrant.
Kortfattat består detta protokoll av följande steg: dissekering av calvarias från 5-7 dagar gamla möss, calvaria förkultur, calvaria kultur applikationer (t.ex. kultur i närvaro av insulin, cancerceller eller konditionerade medium, och även medel med terapeutisk potential, enligt syftet med undersökningen), benfixering och calvaria avkalkning, vävnadsbearbetning, histologisk analys och resultattolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss som används i dessa analyser erhölls från BALB/c möss stammar, med hjälp av manliga och kvinnliga möss urskillningslöst. Tidigare kulturexperiment har också utförts med andra stammar, såsom FVB, schweiziska möss, CD-1 och CsA möss11,12,14. Alla möss inhysts enligt National Institutes of Health (NIH) riktlinjer, bilaga Q. Förfaranden med djurämnen har godkänts av institutionella djur Care and Use Committee (IACUC) vid Centrum för vetenskaplig forskning och högre utbildning vid Ensenada (CICESE).
1. Calvarial dissekering
- Sterilisera dissekeringsinstrument (t.ex. 1 x 2 tandvävnadspinps, rak kirurgisk sax, dissekerande sax, fintippade pincett, fina böjda spetsdissekeringspinpar, dissekerande pincett, skalpell). Sterilt destillerat vatten kan användas för att rengöra de kirurgiska verktygen mellan varje dissekering, och steril 1x PBS kan användas för rengöring av varje hemi-calvaria.
- Placera de sterila dissekeringsinstrumenten, vatten, 1x PBS och nödvändiga material för att utföra proceduren (t.ex. mikropipetter, fällningsglasögon, sterila petriskålar) i en laminär flödeshuva.
OBS: Utför hela proceduren under sterila förhållanden. - Tillsätt 12 ml sterila 1x PBS i två 10 cm Petri-rätter.
- Markera valparna och placera dem nära huven.
OBS: Dissekera calvariorna från 5-7 dagar gamla valpar. - Välj och håll musen försiktigt med dissekera pincett.
- Halshugg musen med dissekerande sax och placera huvudet i en Petri skål med PBS.
OBS: Halshuggning är inte lämplig för äldre möss. Om experimentet måste göras med äldre möss bör metoden för dödshjälp ändras enligt reglerna för djurförsök. - Håll huvudet stadigt vid näsområdet med 1 x 2 tänder vävnadpinps och ta bort huden över skallen tills calvaria är synlig.
- Identifiera suturerna (dvs. sagittal, koronal och lambdoid) av skallen på den exponerade calvaria.
- Penetrera med mikrosaxens spets ca 2 mm bakom lambdoidsuturen och gör ett rakt snitt bredvid den.
- Sätt in mikrosaxens spets på skallens baksida. Gör ett rakt snitt längs den distala sidan av lambdoid sutur mot koronala suturen. Fortsätt på samma sätt med den andra lambdoid suturen.
- Gör ett nytt snitt (i 45° vinkel) för att ansluta änden av snittet som gjorts med snittet av den främre fontanel.
- Upprepa steg 1.10 och 1.11 med den andra lambdoid suturen.
OBS: Det är viktigt att identifiera suturer för att göra lämpliga nedskärningar och för att kunna utföra adekvat inbäddning och dataanalys. - Använd finspetspinpar för att ta bort calvarian och placera den i en Petri-skål. Med en skalpell, gör ett rakt snitt från den bakre fontanel längs den sagittal suturen genom koronalssuturen och slutar i den främre fontanel att få två hemi-calvarias.
- Plocka upp var och en av hemi-calvarias med fintippade pincett och placera dem i en ny Petri maträtt som innehåller PBS.
2. Calvaria kultur
- Tillsätt 1 ml högglukos DMEM medium kompletterat med 0,1% bovin serum albumin (BSA) och 1% antibiotika/antimykotiska (dvs. penicillin och streptomycin) i brunnarna i en 24 brunnsplatta. Med fina pincett, plocka upp varje hemi-calvaria och placera den i en brunn.
OBS: Lägg hemi-calvarias konkava sidan nedåt. - Inkubera hemi-calvarias för 24 h vid 37 °C med 5% CO2.
- Ta bort odlingsmediet från varje brunn och tillsätt 1 ml färskt medium som innehåller föreningen för att testa eller konditionerat media från andra celler.
OBS: Använd minst tre hemi-calvarias för varje behandlingsgrupp och använd negativa och positiva kontroller. - Inkubera hemi-calvarias i 7 dagar, ändra media var 2-3 dagar.
3. Kultur med cancerceller
- Välj en Petri-skål med cancerceller på 80-90% sammanflödet och trypsinize dem. För att trypsinize, tvätta cancercellerna 1x med PBS (5 ml per 75 cm2 kolv) följt av inkubation i en HBSS-lösning som innehåller 0,05% trypsin och 0,53 mM EDTA (2 ml per 75 cm2 kolv).
- Överför cellfjädringen till ett 15 mL koniskt rör och centrifug er vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort och kassera supernatanten.
- Återsuspend pelleten i 2 ml DMEM som innehåller 2% fetalt nötkreatur serum (FBS) och 1% antibiotika/antimykotiska. Räkna levande celler.
- Tilldela hemi-calvarias till varje studiegrupp (dvs. den negativa kontroll- och samkulturgruppen för RNA- eller histologianalys).
- Ta bort kulturmedia från hemi-calvarias och tillsätt 1 ml DMEM som innehåller 2% FBS och 1% antibiotika/antimykotiska kompletteras eller inte kompletteras med cancerceller.
Obs: Mängden celler som ska läggas till kan ändras beroende på vilken celllinje som testas. Med cancerceller som MDA-MB-231 eller PC-3, 500.000 celler per bra arbete på lämpligt sätt. - Inkubera i 24 h vid 37 °C med 5% CO2. Passera varje hemi-calvaria till en ny brunn för att behålla endast cancerceller som följde benvävnaden.
- Inkubera i 7 dagar vid 37 °C med 5% CO2 och byt media var 2-3 dag.
4. Fixering
- Skär rutor av mjukpapper för att linda hemi-calvarias.
OBS: Biopsi skum kuddar eller stål kapslar för små tarmbiopsier kan också användas. - Använd raka finspetspinpar för att plocka upp varje hemi-calvaria från den sagittal suturen, placera på ett mjukpapper och linda.
- Placera den inslagna hemi-calvaria inuti en märkt inbäddningkassett.
- Placera kassetten i en behållare med 10% fosfatbuffrad formalin.
- Fix för 24 h vid 4 °C.
5. Avkalkning
- Ta bort formalin, tillsätt 1x PBS och agitera vävnaderna i 30 min för att skölja hemi-calvarias.
- Ta bort PBS och tillsätt 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M).
OBS: Kontrollera att lösningen täcker vävnaderna helt. - Avkalka vävnaderna i 48 timmar vid 4 °C.
- Kassera EDTA-lösningen och tillsätt 1x PBS för att skölja vävnaden.
- Förvara hemi-calvarias i 70% etanol tills histologi bearbetning.
6. Vävnadsbearbetning
- Torka vävnaderna med rundor av 96% etanol, 60 min (3x), följt av 100% etanol, 60 min (3x).
- Byt ut etanolen med 100% xylen, 60 min (3x).
- Inkubera kassetterna i paraffinvax, 60 min (2x).
7. Inbäddning
- Öppna kassetterna, ta försiktigt bort vävnadspapperet och packa upp calvarian.
- Plocka upp varje calvaria noggrant och stapla alla hemi-calvarias från samma grupp i samma riktning.
- Lägg lite paraffin i en form.
- Plocka upp alla hemi-calvarias med pincett och placera dem inuti formen med skytten sutur ner mot basen av formen.
OBS: Orientering av hemi-calvarias i formen under införandet är avgörande för att få konsekventa histologiska sektioner och reproducerbara resultat eftersom denna orientering kommer att tillåta bakre identifiering av fram-och parietal ben från calvarias och koronalssuturen som underlättar den kvantitativa bedömningen. - Släpp pincetten och kontrollera att hemi-calvarias stannar på plats.
- Placera den märkta kassetten ovanpå formen och fyll den med mer paraffin för att täcka hemi-calvarias.
- Flytta formar till den kalla ytan.
8. Snittning
- Trimma 500-600 μm av den sagittala suturen med mikrotomen.
- Skär 4 μm tjocka sektioner och samla in de sektioner som behövs.
- Trimma ytterligare 300 μm.
- Skär och samla ytterligare sex 4 μm tjocka sektioner.
- Trimma blocket 300 μm ytterligare och samla in fler sektioner.
- Montera sektionerna på glasmikroskopdiabilder.
- Torka rutschkanorna på RT.
9. Färgning
- Sänk ned sektionerna i 100% xylen i 3 min.
- Doppa i 100% etanol i 1 min.
- Slå samman i 96% etanol i 1 min.
- Sänk ned i 80% etanol i 1 min.
- Doppa i 70% etanol i 1 min.
- Skölj i vatten i 3 min.
- Doppa i hematoxylin i 3 min.
- Skölj i vatten tills sektionen är klar.
- Doppa i en mättad litiumkarbonatlösning i 10 sek.
- Skölj i vatten i 3 min.
- Doppa i 96% etanol i 1 min.
- Doppa i eosin i 3 min.
- Sänk ned i 96% etanol i 1 min.
- Doppa i 100% etanol i 1 min.
- Doppa i 100% xylen i 3 min.
- Tillsätt några per monteringsmedium i bilden och skydda den med ett täckslip.
OBS: Du kan komplettera hematoxyline och eosin (H & E) färgning med syrlig-resistentsyra fosfatas (TRAP) färgning för att utvärdera osteoklast och osteolys.
10. Kvantitativ bedömning: fastställande av analysområde
- Undersök sektionerna under låg effekt (dvs. 4x) för att identifiera orienteringen och suturer.
- Definiera koronalssuturen och identifiera den långa benytan på ena sidan och den korta ytan på den andra.
- Identifiera koronalssuturen under 40x förstoring och flytta två eller tre optiska fält bort från suturen längs den långa ytan. Ta bilder av det här området för analys.
- Definiera det gamla benområdet och det nya benområdet. Eosin Y med orange G fläckar det gamla benet mörkare och den nya benljusare.
- Mät det totala benområdet för det gamla och nya benet med bild J-programvara med hjälp av färgtröskelverktyget. Uttryck resultaten som μm2.
11. Dataanalys
- Analysera resultaten med hjälp av statistisk programvara. Betydande skillnader mellan grupper kan bestämmas med hjälp av lämpliga tester (t.ex. nonparametric Mann-Whitney U test som görs herel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera benbildning i calvarialmodellen odlade vi hemi-calvarias i media med eller utan 50 μg/ml insulin. Vävnadssektioner na har förberetts och färgats med H&E. Under dessa förhållanden visade histologiatt den strukturella integriteten hos calvarialbenet bibehölls, vilket gjorde det möjligt att identifiera dess olika komponenter (figur 1). De calvarior som behandlades med insulin gav en ökning av mängden benvävnad jämfört med kontrollen (figur 2A). Kvantitativ histomorfometrisk analys för tjocklek och benområde av hemi-calvaria bekräftade en signifikant ökning för båda parametrarna i de insulinbehandlade vävnaderna jämfört med kontrollen (figur 2B). Dessa data anger att ex vivo-modellprotokollet är genomförbart att återge benbildningsförhållanden.
Dessutom kan calvarial ex vivo-modellen användas för att reproducera cancer och benmikromiljövillkor. Protokollet användes för att utvärdera effekten av bröstcancercellerna MDA-MB-231 på murine calvarior. För att utföra detta var calvarial ben direkt samodlas med cancerceller eller odlade endast med de betingade medierna i cancercellerna. Efter 7 dagar av kultur, calvarias var inbäddade i paraffin, och H & E färgning utfördes. Samkulturen med MDA-MB-231 bröstcancerceller tycktes öka osteolys, vilket framgår av minskningen av ben och skador på calvarial struktur jämfört med kontroll calvarias odlas endast med media(figur 2A). Benområdet kvantifiering av calvarias visade en betydande minskning av den totala benytan av calvarias odlade med MDA-MB-231 cancerceller jämfört med kontrollen(figur 2B). Dessa resultat visade att kokulturer av cancerceller med calvarial vävnad kan återskapa cancer och ben mikromiljö och kan användas för att undersöka mekanismerna för osteolytisk ben metastasering eller för att utvärdera möjliga hämmare av denna process.
Figur 1: Histologisk struktur av calvarial benet. Representativ vävnad smitta av hemi-calvaria efter H & E färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Insulin ökade benområdet och tjockleken på hemi-calvarias ex vivo medan coculture av hemi-calvarias med MDA-MB-231 bröstcancerceller inducerad osteolys. För benbildningsmodellen odlades hemi-calvarias i närvaro eller frånvaro av insulin (50 μg/ml), medan hemi-calvarias för samkulturen med cancerceller odlades i närvaro eller frånvaro av 5 x 105 MDA-MB-231 celler i 7 dagar och histomorfometrisk analys utfördes på H&E-färgade sektioner. (A)Representativa vävnadssektioner. (B)Histomorfometrisk analys av benområdet. Resultaten representeras som genomsnittet ± SEM (n = 3). *P < 0,05, nonparametric Mann-Whitney U test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi protokollet för en calvarial ex vivo modell för att utvärdera benbildning eller resorption och att studera interaktioner av cancerceller med calvarial mus ben. De kritiska stegen i denna teknik är dissekering, kultur, inbäddning och histomorphommetrical analys av calvarias. Under dissekeringen av calvarias, är det viktigt att skära hemi-calvarias i en trapetsoid, eftersom det kommer starkt att underlätta orienteringen under paraffin integration. När du studerar interaktioner cancercell med calvarias, Det är viktigt att använda multiwell plattor som inte behandlas för cellkultur för att förhindra cancerceller från att följa och växa på plast i stället för benet. Under vävnadsinkluderingen är det viktigt att noggrant orientera varje hemi-calvaria. De måste placeras på ett vertikalt sätt med den sagittala gränsen på utsidan av paraffinblocket. Benorienteringen är nödvändig för att få konsekventa histologiska sektioner och reproducerbara resultat. På samma sätt är det viktigt för konsekvens under histomorfometrisk analys för att definiera en viss region i calvaria att mäta ben ombyggnad. Här identifierade vi först koronalssuturen och sedan den långa benytan där bilderna togs och mätningarna gjordes.
För att uppnå standardiseringoch utveckla de protokoll som beskrivs ändrade vi några etablerade metoder något. Under dissekeringen av hemi-calvarias användes PBS för att skölja mushuvudena istället för odlingsmedia. För att bestämma antalet celler som krävs för att producera en effekt på calvarias, vävnaden inkuberades med olika antal bröstcancerceller. I allmänhet, 5 x 105 cancerceller fungerar bra för en 7 dagars analys. Även under fixering, vävnadspapper användes i stället för svampar för att skydda calvarias. Vävnaden var välbevarad i papperet.
Den modell som beskrivs har vissa begränsningar. Calvarias från neonatal möss saknar några av de komponenter i benen som är mottagare av metastaser, oavsett om strukturella (dvs trabecular ben) eller cellulära komponenter såsom immunceller eller andra celler i benmärgen, inklusive hematopoietic stamceller som cancerceller interagerar med. Kulturen i calvarias in vitro kan inte simulera hela fysiopatologi. Också, när det gäller ben metastaser, bröstcancerceller metastasering till calvaria, och tenderar att gynna ben med mer aktiva ben remodeling, såsom kotorna, höften, eller långa ben i armar och ben. Dessutom representerar coculture av hemi-calvarias med cancerceller bara de senaste stegen i den ögonbevarande kaskad: kolonisering av benet och tillväxten av metastasering. Dessutom begränsas antalet prover av antalet valpar per strö. Det rekommenderas att använda en kull per experiment och inte blanda kullar för att undvika variationer i resultaten. Vi fick liknande resultat i ben remodeling när du använder calvarias från BALB / c eller FVB möss, men om stammen påverkar tidssvaret av ben ombyggnad i denna analys återstår att bestämma.
De främsta fördelarna med calvarial ex vivo-modellen jämfört med in vivo-modeller inkluderar lägre kostnad, enkelhet i analysen och kortare experimentell tid för att få ett ben remodeling svar. Samkulturen av cancerceller och calvarias gör det möjligt att studera cell-kontakt beroende interaktioner samt effekten av utsöndrade faktorer på ben ombyggnad, medan användningen av konditionerade medier gör att fokusera på effekten av lösliga faktorer. Dessutom kan direktkontaktmodellen underlätta karakteriseringen av intercellulära interaktioner och molekylära mekanismer i benmetastasering mikromiljö, samt studie och utvärdering av nya läkemedel för behandling av skelettkomplikationer av maligniteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Mario Nomura, MD och Rodolfo Díaz för deras hjälp med histologi, och Pierrick Fournier, Ph.D. för hans värdefulla kommentarer för att förbättra kvaliteten på papperet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
