Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

A Real-Time potens analyse for chimeric antigen reseptor T celler målretting solid og hematologiske kreftceller

Published: November 12, 2019 doi: 10.3791/59033
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 1,3, 1, 1, 1, 2
1ACEA Biosciences, Inc, 2ProMab Biotechnologies. Inc, 3ACEA Therapeutics

Summary

Vi beskriver en kvantitativ Real-Time in vitro cytolyse analysen system for å evaluere styrken av chimeric antigen reseptor T-celler rettet mot flytende og solide tumorceller. Denne protokollen kan utvides til å vurdere andre immun Effektor celler, samt kombinasjonsbehandlinger.

Abstract

Chimeric antigen reseptor (CAR) T-celle terapi for kreft har oppnådd betydelig klinisk nytte for resistente og ildfast hematologiske ondartet som barndommen akutt lymfatisk leukemi. Arbeidet er for tiden i gang for å forlenge denne lovende terapi til solide svulster i tillegg til andre hematologiske kreft. Her beskriver vi utvikling og produksjon av potente CAR T-celler målretting antigener med unike eller fortrinnsrett uttrykk på faste og flytende tumorceller. In vitro-styrken til disse CAR T-cellene evalueres deretter i sanntid ved hjelp av den svært følsomme impedans-baserte xCELLigence-analysen. Nærmere bestemt er virkningen av ulike costimulatory signalering domener, slik som glukokortikoid-indusert tumor nekrose faktor reseptor (TNFR)-relatert protein (GITR), på in vitro potens av CAR T-celler undersøkt. Denne rapporten inneholder protokoller for: generere CAR T-celler for prekliniske studier ved hjelp av lentiviral gen Transduction, utvide CAR T-celler, validere CAR uttrykk, og kjører og analysere xCELLigence styrke analyser.

Introduction

I de senere årene, bil T-celle terapi har vært en av de mest fremtredende gjennombrudd i kreft immunterapi for tilbakefall og ildfast blodkreft ondartet. Med den nylige US Food and Drug Administration (FDA) godkjennelse av CD19-regissert bil T celler for akutt lymfatisk leukemi, ikke-Hodgkins lymfom, og diffus stor B-celle lymfom, og betegnelsen på gjennombrudd terapi for b-celle modning antigen (BCMA)-regissert bil T celler for flere myelom, denne teknologien har generert stor spenning i det vitenskapelige samfunnet og har fueled mange grunnleggende, anvendt, og kliniske studier over hele verden1,2,3, 4,5. I januar 2019 ble det registrert mer enn 700 kliniske studier i den kliniske testdatabasen (clinicaltrials.gov). om 450 av disse studiene var enten i ferd med å starte eller var aktivt rekruttere pasienter. De fleste av de kliniske studiene er fokusert på hematologiske ondartet, og kliniske studier utnytte bil T celler rettet mot CD20, CD22, og BCMAs, i tillegg til CD19, er pågående også6,7. Mens de fleste av forsøkene bruker autologous bil T-Cell Therapy, et betydelig antall av dem er også å utforske nytten av allogenic bil T celler8,9,10. Til tross for lovende resultater med hematologiske ondartet, bruk av bil T celler til målet solide svulster har vist seg å være mye vanskeligere i klinikken for en rekke årsaker, inkludert men ikke begrenset til mangelen på gode mål som er utelukkende uttrykt i svulsten, heterogenitet av solide svulster og tumor "Escape", og vanskeligheten at bilen T celler har tilgang til tumor mikromiljøet11,12,13,14, 15. det er et kritisk behov for utvikling av solide tumor-spesifikke Car T-celler som kan overvinne disse barrierene for effekt og problemet med "på målet-off tumor" toksisitet. Mens en rekke in vitro og in vivo tilnærminger er berettiget i design og testing av bil T celler, en robust og prediktiv in vitro potens analysen er av primær betydning16,17.

For å vurdere styrken på CAR T-cellene har ulike in vitro-metoder blitt utviklet. Generelt, disse styrke analysene kan deles inn i to hovedkategorier avhengig av om de (i) direkte måle cytolytisk aktivitet av Car t-celler mot målet tumorceller, eller (II) måle surrogat markører som cytokiner som er utgitt av Car t-cellene som de dreper målcellene. Teknikker som måler cytolytisk aktivitet direkte inkludere Chromium-51 Release analysen (CRA)18, Imaging-baserte analyser som måler apoptose av målceller ved hjelp av fluorescerende sonder19,20, og flyt flowcytometri analyser som oppdager apoptotisk Target celler21. I disse analysene, CAR T-celler er vanligvis co-kultivert med målceller som har vært pre-merket med radioaktive eller fluorescerende sonder, etterfulgt av passende måling. Selv om det har lenge vært betraktet gullstandarden i feltet på grunn av sin følsomhet, har CRA noen ulemper. Først er det et endepunkt analysen og gir ikke kinetisk informasjon. For det andre må målcellene merkes med krom-51 som har en tendens til å lekke ut av cellene og kan signifikant øke bakgrunnsstøyen22. Til slutt, det krever riktig forholdsregler og deponering av radioaktivt avfall. Alternative analyser, som måler biprodukter av bil T-celle interaksjon med målceller som en indikasjon på potens, inkluderer kvantifisering av ulike cytokiner utgitt av CAR T-celler ved hjelp av enten flyte flowcytometri metoder eller enzym-koblet immunosorbentanalyse analyser. Nok en gang er disse ende punkts analysene som måler den kumulative utgivelsen av cytokiner på et gitt tidspunkt, og dermed ikke nødvendigvis gjenspeiler den faktiske cytolytisk aktiviteten til CAR T-cellene.

Når du utvikler en potens analysen, spesielt en som definerer utgivelsen kriteriene for en celle-basert terapi som en bil T-celle, er det avgjørende at analysen innebære minimale manipulasjoner og hands-on tid fordi hver interaksjon er en annen variabel som må regnskapsføres og kan redusere den generelle robusthet og konsistens av analysen. Videre samspillet av CAR T-celler med tumorceller er en dynamisk prosess, og gi informasjon om disse dynamiske interaksjoner, for eksempel frekvensen av cytolyse, er av primær betydning for potens evaluering. Med disse kriteriene i tankene, utviklet vi en etikett-fri kinetisk styrke analysen for CAR T-celler som utnytter xCELLigence sanntids celle analyse (RTCA) plattform. xCELLigence benytter spesialiserte mikrotiterbrønnene plater (E-plater) som inneholder gull biosensors innebygd i bunnen av hver brønn. Arbeide med enten tilhenger solide tumorceller, eller flytende kreftceller som er bundet ved hjelp av spesifikke antistoffer, disse biosensors overvåke i sanntid bil T celle-indusert endringer i målet celle nummer, Cellestørrelse, celle-substrat vedlegg styrke, og celle-celle interaksjoner (dvs. barrierefunksjon)17,23,24,25,26,27,28. Arbeidsflyten er enkel og innebærer bare seeding målet cellene i brønnene av E-plater, etterfulgt av tillegg av CAR T-celler på ulike effektor-til-Target prosenter (figur 1). Deretter, når biosensors kontinuerlig overvåker levedyktigheten til målcellene, vises dataene automatisk i sanntid.

I løpet av de siste 15 årene xCELLigence analysen har blitt validert for å vurdere styrken på Natural Killer (NK) celler, T celler, bil T celler, Checkpoint hemmere, bispecific antistoffer, oncolytic virus, og noen Kombinasjonsbehandling17,29,30,31,32,33,34. Nylig ble xCELLigence styrke analysen evaluert for produksjon T-celle reseptor (TCR)-konstruerte T-celler35. Her rapporterer vi ansette RTCA system for å evaluere in vitro potens av CAR T-celler designet for å målrette solide svulster og flytende svulster i kliniske terapier.

Protocol

1. generering av bil kodings lentivirus

Merk: når den spesifikke CAR T-celle plasmider konstruksjonen er fullført (CD47 og andre), lentiviral biler er generert av standard prosedyre, ved hjelp av 293 FT celler, en lentiviral emballasje mix, og transfeksjoner midler (se tabellen av materialer) som beskrevet29. Deretter bruker du en kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjede reaksjon (RT-PCR) Kit og en termisk cycler (se tabell over materialer) for å fastslå viruset titer ved å måle lentiviral RNA-beløpet i henhold til produsentens protokoll. Det er viktig at alle lentiviral prosedyrer utføres strengt etter sikkerhetskrav.

  1. Seed 15 x 106 HEK293FT celler i Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) og ruge cellene over natten på 37 ° c i 1 150 mm parabolen inne i en fuktet 5% co2 inkubator.
  2. Forbered 2 15 mL rør med transfeksjoner kompleks. Det første røret inneholder lentiviral vektor plasmider DNA (5 μg) og lentiviral emballasje blanding (22,5 μg) i 2,5 mL transfeksjoner fortynnings oppløsning. Det andre røret inneholder 82,5 μL av transfeksjoner reagens i 2,5 mL transfeksjoner fortynnings oppløsning (se tabell over materialer).
  3. Pipet innholdet av rør 1 i rør 2, og ruge blandingen ved romtemperatur i 15 min.
  4. Overfør innholdet i røret dråpevis til fatet av HEK293FT celler og ruge prøven over natten ved 37 ° c i en fuktet 5% CO2 inkubator.
  5. Neste dag, erstatte det eksisterende mediet med 19 mL friskt DMEM kultur medium og fortsette å ruge cellene over natten inne i fuktet 5% CO2 inkubator på 37 ° c.
  6. Overfør mediet fra fatet til et 50 mL sentrifugerør. Hold røret med viruset som inneholder medium i kjøleskapet.
  7. Gjenta fremgangsmåten ovenfor, legge til ferske DMEM og samle det igjen etter 1 dag.
  8. Kombiner to samlinger av mediene til ett sentrifugerør. Centrifugate røret ved 2 000 x g i 30 min ved 4 ° c.
  9. Overfør de fleste av lentivirus som inneholder supernatanten, til et ultraclear sentrifugerør. Legg igjen et minimum volum, ca 1 mL, av supernatanten for å unngå å forstyrre pellet som kan inneholde celler og/eller rusk.
  10. Ultracentrifuge ovenfor avklart supernatanten på 110 000 x g for 100 min ved 4 ° c.
  11. Fjern supernatanten forsiktig og forsiktig Tilsett 100 μL av DMEM medium til viruset pellet på røret bunnen. La røret på isen i 15 min. Bland løsningen forsiktig og alikvot den lentivirus løsningen inn i prechilled sterile rør. Oppbevar disse virus lager rørene i en-80 ° c fryser.
  12. Bruk et kvantitativ RT-PCR-sett for å bestemme titer av lentivirus i henhold til produsentens protokoll, som trekker ut og måler lentiviral RNA.

2. generering og utvidelse av CAR T-celler

  1. Aktiver tidligere frosne menneskelige Pbmc (ca 1 x 106 til 2 x 106 celler) i 1 ml bil T-celle medium med et likt antall CD3/CD28-belagt mikroperler (se tabellen av materialer) og ruge cellene ved 37 ° c i en fuktet 5% co2 inkubator for 24 h.
  2. Tine en alikvot av lentivirus lager på isen.
  3. Tilsett 1 μL av Transduction styrke middel i brønnen med cellene og bland.
  4. Legg lentivirus til cellene på et mangfold av smitte (MOI) av 5:1 og bland forsiktig. På neste dag, Gjenta dette trinnet (24 h etter den første Transduction).
  5. Overvåk T cellevekst hver 2-3 dager. Legg til mer frisk bil T-celle medium for å opprettholde cellene i en tetthet på 1 x 106 til 2 x 106 celler/ml.
  6. Frys ned CAR T-cellene med en standard protokoll ved hjelp av fryse løsning (se tabell over materialer).
  7. Tin CAR T-celler ved hjelp av en standard metode og preculture dem i bilen T-Cell medium for ca ~ 2-4 h med IL-2 (300 enheter/mL) før du bruker dem til analysen.

3. påvisning av CAR-uttrykk ved å strømme flowcytometri

  1. Overfør 3 x 105 bil T celler og nontransduced T-celler til to separate 1,5 ml mikrosentrifugen rør.
  2. Sentrifuger rørene på 300 x g for 2 min og resuspend cellene i 200 μL av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) buffer som inneholder 1% humant serum.
  3. Pipet 100 μL av celle løsning i to 5 mL polystyren FACS rør og holde rørene på isen i 5 min.
  4. Tilsett 1 μL av biotinylated geit anti-Mouse F (AB ')2 til ett rør av hver celle type. Tilsett deretter 2 μL PE-merket anti-tag-antistoff (se tabell over materialer) til det andre røret i hver celle type. Bland godt og ruge dem på isen i 30 min.
  5. Vask cellene med 3 mL FACS buffer i hvert rør og sentrifuger rørene ved 300 x g i 5 min; Kast supernatanter og Vortex svært kort eller rist rørene kort for å resuspend cellene i den resterende væsken.
  6. Tilsett 2 μL av APC anti-CD3 og 2 μL av 7-AAD antistoff løsning (se tabell over materialer) til hvert rør. I rør av celler beiset med anti-F (AB ')2 AB, tilsett 1 ΜL av PE-merket streptavidin. Bland kort og ruge rørene på isen i 30 mer min.
  7. Bruk FACS buffer til å vaske cellene igjen som beskrevet i trinn 3,5 og tilsett ytterligere 200 μL av FACS buffer til hvert rør.
  8. Bruk Flow flowcytometri til å analysere cellene ved først å gating på T-cellene i en frem-punktdiagram kontra side punktdiagram og deretter gating på de aktive cellene (7-AAD-negative) i et CD3 i forhold til 7-AAD. Det siste trinnet er å analysere anti-tag, anti-ScFv eller anti-F (AB ')2 vs CD3.

4. Real-Time cytolyse potens analysen

Merk: Utfør RTCA-analysen i henhold til produsentens anbefalte forhold. Kort sagt, først plate målcellene i brønnene på E-plate, etterfulgt av tilsetning av CAR T-celler på neste dag. Den cytolyse aktiviteten til CAR T-celler mot målceller overvåkes i sanntid. T-celler og mock-transduced T-celler (mock CAR T-celler) brukes som negative effektor celle kontroller. Følgende protokoll beskriver en in vitro sanntids cytolyse styrke analysen for tilhenger tumor cellelinjer.

  1. Tilsett 100 μL av mål cellekultur medium til hver brønn av xCELLigence E-plate, Plasser platen inne i xCELLigence-instrumentet, og ta en bakgrunns avlesning. Deretter overføre E-plate til en vev kultur hette for celle seeding.
  2. Bruk en standard protokoll for å trypsinize mål kreftceller fra kulturen enheten. Deretter overfører du cellene til et 15 mL sentrifugerør og legger til friskt kultur medium, opptil 15 mL. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 200 x g. Kast supernatanten, tilsett 5 mL friskt medium, og bruk en serologisk pipette for å forsiktig resuspend celle pellet. Telle tettheten av levende celler ved hjelp av en hemocytometer og mikroskop.
  3. Juster celle tettheten på riktig måte og legg deretter til 100 L av celle fjæringen til hver brønn på E-platen. Målet celle nummer er vanligvis rundt 10 000 celler/brønn for tilhenger cellelinjer (BxPC3, Hela-CD19, og SKOV3), eller 30 000 celler/brønn for suspensjon celler som Raji (se nedenfor for detaljer om precoating brønner med antistoffer for å feste flytende kreftceller).
  4. Likevekt E-platen ved romtemperatur i 30 min slik at cellene til å bosette seg jevnt på bunnen av brønnen (dette er kritisk; ikke hopp over dette trinnet).
  5. Plasser E-plate i xCELLigence instrumentet inne i cellen kultur inkubator og begynner å måle impedans, vises som Cell index g. tid, automatisk hver 15 min.
  6. Neste dag, forberede effektor CAR T-celler. Sørg for å forberede egnede kontroller (dvs. mock CAR T-celler, ikke-transduced kontroll T-celler, og/eller urelaterte CAR T-celler) på forhånd for å sikre at alle cellene er klare på samme tid. Juster de effektor cellene og kontrollcellene til riktig tetthet, og Forbered serielle fortynninger for å sikre at de ønskede E:T-forholdene oppnås når 100 μL av effektor celle fjæring legges til hver brønn i trinn 9.
  7. Pause xCELLigence datainnsamling og bringe E-plate fra inkubator til en cellekultur hette.
  8. Fjern 100 μL av medium fra hver brønn. Mengden av rest medium i hver brønn er nå 100 μL.
  9. Tilsett 100 μL av serielt fortynnet effektor CAR T-celler eller andre kontroll celler (dvs. mock CAR T-celler) for å oppnå ønsket E:T-forhold.
  10. Likevekt E-platen ved romtemperatur i 30 minutter slik at Effektor celler kan bosette seg, og plasser deretter E-platen tilbake i xCELLigence-instrumentet. Gjenoppta datainnhenting.
  11. Hvis ønskelig, på viktige tidspunkt poeng xCELLigence datainnsamling kan stanses midlertidig og platen fjernet for å samle små prøver som skal analyseres av ortogonale analyser (dvs. måle cytokin produksjon av ELISA eller flyt flowcytometri).
  12. I EGFR-GITR-CD3 CAR T-celle-eksperimentet måler du INFγ avkastning med et ELISA-sett (følg produsentens anvisninger, se tabell over materialer).
    MERKNAD om bruk av flytende kreft: for testing nonadherent hematologiske kreftceller, før du legger celler brønnene på E-platen er først belagt med et antistoff som er spesifikk for et antigen som uttrykkes på overflaten av kreftceller. For Raji B cellelinjen en tethering reagens basert på anti-CD40 brukes (se flytende tumor drap analysen Kit i tabellen av materialer). Nedenfor er prosedyren for belegg platen:
  13. Fortynne tethering reagens (anti-CD40) med tethering buffer til en konsentrasjon av 4 μg/mL.
  14. Arbeid inne i en vev kultur hette, tilsett 50 μL av fortynnet tethering reagens til hver brønn på E-plate. La E-platen ligge i romtemperatur eller i en 37 (på 3 ° c) inkubator for tre timer.
  15. Fjern tethering reagens og vask E-plate minst 2x med vaskebuffer. På dette punktet er E-plate klar for seeding den Raji målcellene (30 000 celler/brønn).
  16. Fortsett med trinn 4,1 (over) for å utføre resten av prosedyren.

Representative Results

BIL lentivirus forberedelse og bil T-celle generasjon og styrke vurdering
Titers av bil lentivirus forberedelser ble bestemt ved hjelp av et kvantitativ RT-PCR-sett (se tabell over materialer) i henhold til produsentens protokoll. Titrering protokollen ekstrahert virus RNA først og deretter målt lentiviral RNA kopi nummer, som indikerte mengden av smittsomme virus partikler. Den titer av virus generert fra 1 150 mm parabolen bruker ovennevnte protokollen vanligvis varierer mellom 109-1010 viral eksemplarer/ml. Figur 2A viser RT-PCR Cycle-nummeret kontra signalstyrken fra et representativt, kvantitativ PCR-resultat. En gang det virus kvalitet var tilfredse, når titer var større enn 1 x 108 PFU/ml, den var frosset ned for etterfølgende T cellen Transduction. Etter at CAR T-cellene var transduced med lentivirus, var T-cellene kultivert for ytterligere 12-14 dager, og opprettholder tettheten rundt 1 x 106 til 2 x 106 celler/ml. The CAR T-celler ble deretter sjekket med anti-ScFv-spesifikke antistoff ved hjelp av en Flow flowcytometer før en nedstrøms søknad eller fryse ned. En god representant batch resultatet er vist i figur 2B. Ved hjelp av en anti-ScFv antistoff, ca 50% av CAR T-cellene beiset positive (Q2 50,6% kontra T celler 1%), noe som indikerer uttrykket av CAR i ca 50% av T-cellene. Deretter ble RTCA styrke analysen utført for cytolyse bestemmelse før hver batch av CAR T-celler ble frosset ned og klar for fremtidig anvendelse. En syklus av bil T-celle design, generasjon, og vurdering prosedyre tok ca 1 måned.

Drapet på Raji lymfom B-celler ved CD22-CAR T-celler
Den anti-CD40 flytende tumor tethering Kit (se tabellen av materialer) ble brukt ved en konsentrasjon av 4 μg/ml til coat en E-plate for 3 h ved 37 ° c. Etter vask av brønner med tethering buffer, B-celle lymfom celler ble lagt til E-plate i en tetthet på 30 000 celler/brønn. Etter at cellene til å bosette seg i 30 min E-plate ble plassert tilbake inne i xCELLigence instrumentet, og impedans målingene ble umiddelbart initiert for å fange celle vedlegg og spredning. Dagen etter ble enten CD22-bil T-celler, mock CAR T-celler, eller untransduced T-celler lagt til. I Figur 3ble et E:T-forhold på 10:1 brukt for alle celletyper. CD22-positive Raji celler, behandlet med CD22-CAR T-celler vist betydelig drap (grønn spor) i forhold til negative kontroller (untransduced T-celler og mock CAR T-celler).

Effektiv drap av kreftceller i bukspyttkjertelen av CD47-CAR T-celler
CD47 er en transmembrane overflate glykoprotein av immunglobulin overfamilie. Som en integrin-assosiert protein, det er svært uttrykt i både hematologiske kreft (leukemi, lymfom, og flere myelom) og solid kreft (for eksempel eggstokkene, liten celle lungekreft, bukspyttkjertel, glioblastom) og andre typer kreft36,37. CD47 er også kjent som en gjør-ikke-Spis-meg signal til makrofager, som har gjort det til en potensiell terapeutisk mål i enkelte kreftformer. CD47-bil T celler ble produsert og testet mot BxPC3 kreftceller i bukspyttkjertelen som uttrykker høye nivåer av CD4738,39. BxPC3 celler ble sådd i E-plate på dag 1 i en tetthet på 10 000 celler/brønn. Sanntids overvåking viste at disse cellene nådde confluency etter 16 h. På dette tidspunktet var bil T celler lagt på E:T forholdet 10:1 (Figur 4A). Kontroll Effektor celler som nontransduced T-celler og mock CAR T-celler ble også lagt til. Resultatene tydelig viser at CD47-bil T-celler selektivt drepe målet BxPC3 cellene29. Også, Figur 4B viser at impedans signal når CD47-bil T celler er lagt til en tom brønn er vesentlig lavere enn impedans signal generert av målet BxPC3 celler. Celle indeksverdien fra brønner med CD47-T-celler var alene nådd maksimalt 0,14, som bare er litt høyere enn signalet fra medium alene (0,02). Dette indikerer at i denne heterogene drapet analysen, er impedans signalet avledet nesten utelukkende fra målet kreftceller.

Costimulation av CAR T-celler av GITR domenet
Når uttrykt i en EGFR-GITR-CD3 bil, GITR costimulatory domenet ble tidligere rapportert å forsterke drapet på EGFR-positive SKOV3 kreftceller, men ikke EGFR-negative MCF-7 kreftceller30. For bedre å klargjøre rollen til GITR-domenet, ble bil konstruksjoner som inneholder GITR-domenet i full lengde, eller slettede eller omorganisert versjoner av domenet, generert og testet for muligheten til å coactivate CAR T-celler (figur 5A). Den xCELLigence data i figur 5B, C viser at GITR costimulatory domenet forbedrer bil T celle drapet på EGFR-positive målceller over hva som er OBSERVERT med den opprinnelige bilen konstruere som mangler GITR domenet. Videre slette 10 aminosyrer fra GITR domenet (aminosyrer 184-193) avskaffet denne stimulerende aktivitet. I kontrast, omorganisere den relative plasseringen av GITR domenet i bilen konstruere viste seg å være mindre skadelig for sine stimulerende evner. Ved hjelp av sluttpunkt data viste IFNγ-produksjon som et surrogat av T-celle aktivering også stimulerende aktiviteten til GITR-domenet (figur 5B). I motsetning til endepunkt data som er bare "snap shot", den kontinuerlige impedans profilen til xCELLigence instrumentet lyser klart subtile forskjeller i drapet Kinetics av ulike behandlinger (figur 5C). Resultatene oppnådd her er i samsvar med de av en in vivo studie30.

Figure 1
Figur 1: xCELLigence sanntids celle analyse (RTCA) systemet oppdager drapet på målceller ved Effektor celler. Det er tre viktigste konseptuell trinn for å måle drapet aktivitet av CAR T Effektor celler mot målet kreftceller. Trinn 1: Seed målcellene (dvs. tumorceller) i brønnen til en E-plate. Cellene feste til gull Biosensor microelectrodes og dette hindrer strømmen av elektrisk strøm mellom elektrodene. Denne impedans verdien måles og tegnes som en unitless parameter kalt Cell index. Verdien for celle indeksen øker etter hvert som cellene vokser og når et platå etter hvert som cellene nærmer seg samløpet. Trinn 2: Effektor celler-nonadherent immunceller-blir senere lagt til. Fordi disse cellene ikke overholder gull microelectrodes, de ikke direkte forårsake en impedans endring. Trinn 3: Hvis de effektor cellene angriper målet kreftceller, blir ødeleggelsen av tumorceller reflektert av en nedgang i Cell index over tid. Dette cytolytisk aktivitet av Effektor celler, eller styrken av de effektor cellene, kan være følsomt og presist overvåket. Kontinuerlig oppkjøp av impedans data fra xCELLigence systemet muliggjør sanntids drepe kinetisk analyse for flere forhold samtidig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: titer bestemmelse av lentivirus og flyt flowcytometri evaluering av Car T-cellene. (A) Lentiviral titer bestemmelse. De forskjellige farge linjene er representative eksempler for syklus nummer kontra delta RN. lav syklus tall indikerer en relativt høy mengde virus RNA mal til stede i prøvene. (B) etter Transduction, var Car T-celler kultivert og opprettholdt ved en tetthet på mindre enn 2 x 106 celler/ml og deretter utsatt for strømnings analyse. Y-aksen reflekterer farging for T-celler, der positive verdier gjenspeiles i områdene Q1 og Q2. Begge prøvene er 100% positive for T-celler. Uttrykket for CAR scFV bestemmes ved hjelp av en scFv-spesifikk AB (x-akse). Resultatet viser at mer enn 50% av T-cellene er scFv positive i CD22-CAR T-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Killing dynamikken i CD22-bil T-celler mot Raji Burkitt ' s lymfom celler. Mens den røde kurven er Raji-cellene alene, er den grønne kurven Raji-cellene behandlet med CD22-CAR T-celler. Den rosa og blå kurver er mock CAR T-celle behandling og nontransduced T-Cell behandling, henholdsvis. E:T-forholdet er 10:1. Feilfelt er standardavvik. Tidsskalaen er satt opp med 2 h intervaller for enkel visning, selv om flere datapunkter er tilgjengelige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: effekt av CD47-bil T-celler mot bukspyttkjertelen solide tumorceller. (A) rosa er målet BxPC3 celler alene, mens rød er BXPC3 med CD47-bil T-celler lagt til. Grønn er BxPC3 med tillegg av nontransduced T-celler, og blå er med mock CAR T-celler. E:T-forholdet er 10:1. (B) i den samme innstillingen, rødt er tomt (mangler målceller) kontroll BRØNNER med CD47-Car T-celler bare og grønt er mediet bare. Feilfelt er standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: GITR domenet øker Car T celle cytotoksisk aktivitet mot EGFR-positive tumor cellelinjer. (A) forskjellige bil konstruksjoner. (B) bar plott av% cytolyse for ulike bil konstruksjoner ved 4 h (venstre) og 24 h (midten). IFNγ produksjon på 24 h er vist til høyre. (C) kontinuerlig drap evaluering for alle konstruksjoner. Den svarte kurven er veksten kurve av BxPC3 eggstokkene kreftceller bare. Den grønne kurven er målcellene behandlet kun med T-celler, den blå kurven er målet cellene behandlet med mock CAR T-celler, den røde kurven er målet cellene behandlet med EGFR-GITR-CD3-bil T celler, den rosa kurven er målet cellene behandlet med EGFR-ΔGITR-CD3-bil T celler, og den brune kurven er målet cellene behandlet med EGFR-CD3-GITR-bil T celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Chimeric antigen reseptorer er replikasjonen proteiner bestående av en ekstracellulære enkelt kjede variabel fragment (scFv region), en hengsel region, en transmembrane region, og et cytoplasmatiske domene sammensatt av TCR signalering domener og ytterligere costimulatory domener fra reseptorer som CD28 og OX4011,40. Å designe trygge, selektive og effektiv biler, er det viktig at de ulike variasjoner i utformingen av bilene er grundig testet med in vitro potens analyser og, til slutt, dyremodeller. I denne studien har vi gitt en protokoll og en arbeidsflyt for hvordan en Real-Time in vitro potens analysen kan informere utformingen av effektiv CARs.

I utformingen av alle typer styrke analysen, spesielt for produksjon formål, er det viktig at analysen være følsom, robust, konsistent, og så nær virkningsmekanismen som mulig16,17,41. Det virkelig-tid styrke analysen beskrevet her over er beregnet på mål det cytolytisk aktivitet av bilen T cellen direkte snarere enn benytter en surrogat Farm land som cytokin løslate. Viktigere, ikke analysen ikke krever noen ekstra komponenter som fargestoffer eller reagenser enn analysen plate (E-plate) og de anbefalte mediene for å opprettholde cellene. I tillegg er analysen utsøkt følsom og gir svært reproduserbar data sammenlignet med andre Label-baserte analyser42,43,44. Videre er xCELLigence-analysen mottagelig for å bruke svært lave effektor-to-Target prosenter som er ideelt for vurdering av spesifikke cytolyse.

For å demonstrere fleksibiliteten og nytten av xCELLigence systemet, har vi fokusert på to tumor typer, nemlig svulster av hematologiske opprinnelse og solide svulster. For å vurdere styrken på CD22-regissert CAR T-celler, ble Raji celler (dvs. en B-celle lymfom cellelinje) bundet til E-platene ved hjelp av et anti-CD40 antistoff. Den tethering av Raji celler til bunnen av E-plater resulterer i en impedans signal som reflekterer levedyktigheten og antall Raji celler i brønnen. Etter tilsetning av CD22-bil T-celler, Raji cellene er selektivt drept i en tid-og effektor-avhengig måte, som kulminerte i en tidsavhengig reduksjon i impedans signalet. Fall i impedans betyr cytolyse eller tap av levedyktighet av Raji cellene17. Denne selektive tethering tilnærming ved hjelp av antistoffer kan utvides til andre flytende tumor cellelinjer. En alternativ strategi for å bruke tumor cellelinjer av hematologiske opprinnelse er å bruke tilhenger kreftceller som er konstruert for å stabilt uttrykke tumor antigener, slik som CD19 uttrykt i HeLa celler. Fordelen med denne tilnærmingen er at foreldre jakten cellene er lett tilgjengelig og kan brukes som en negativ kontroll for spesifisitet. En slik tilnærming har allerede blitt validert med CHO-CD22 vs. CHO celler og CHO-BCMAs vs CHO celler29. Ved hjelp av slike ulike tilnærminger, bil T-celle design og effekt kan lett testes. Den xCELLigence analysen er iboende fleksibel, og analysen forhold kan justeres for å maksimalt omtrentlige fysiologiske forhold.

En stor fordel av styrken analysen vi beskrev her er at det er en enkel funksjonell analysen og kan brukes i forbindelse med genetisk engineering teknikker for å designe optimale og effektiv biler i en høy-gjennomstrømning mote. Som ble vist her for CAR T-celler designet for å målrette EGFR-positive kreftceller, kan analysen brukes til å evaluere den relative aktiviteten til forskjellige bil konstruksjoner/mutanter. For eksempel viste vi at når GITR domenet ligger oppstrøms av CD3 domenet det viser mye mer robust cytolytisk aktivitet enn når det ligger nedstrøms av CD3 domenet.

Selv om det ikke samsvarer perfekt med in vivo CAR T celle aktivitet, in vitro cytokin Release har historisk vært brukt som et mål på CAR T celle potens. Selv om den xCELLigence-baserte styrke analysen som beskrives her, kan brukes til å evaluere cellebasert behandling under produksjon eller før den blir frigitt for klinisk anvendelse, hvor godt disse resultatene samsvarer med in vivo-effekten har ennå ikke blitt Etablert. In vivo-effekt avhenger av en rekke faktorer og variabler som kanskje ikke er sammenfattet innenfor en in vitro-analyse. Slike variabler inkluderer: homing av CAR T-celler til området av svulsten, stimulering og aktivering av CAR T-cellen og dens evne til å vedvare i pasienten, og svulsten mikromiljøet. Med ytterligere raffinement den xCELLigence analysen kan være i stand til å modellere noen av disse komplekse prosesser in vitro.

Protokollen gitt her gjelder for de fleste tilhenger kreftcelle linjer og noen av de flytende tumor cellelinjer. Kliniske prøver som primær kreftceller, men må være ytterligere testet og optimalisert på grunn av kompleksiteten i tumor typer og faser. Det er absolutt verdt å merke seg at in vitro styrke analysen systemet beskrevet her bruker kreftcelle linjer bare for å gjenspeile den potensielle aktiviteten til CAR T-cellene. Den virkelige tumor situasjonen inne i menneskekroppen er mye mer komplisert, spesielt når en solid svulst er målrettet, på grunn av dynamisk tumor miljø og utvikling. Derfor kan styrke evaluerings resultatet ikke oversette veldig godt inn i den kliniske effekten av CAR T-cellene testet.

Oppsummert, den presenterte impedans-baserte xCELLigence plattformen tillater etikett-fri overvåking av celle drap for en lengre periode, nemlig opp til 10 dager. Denne kapasiteten for en så lang Temporal skala for datainnsamling skiller teknologien fra andre analyser som er i bruk, og som krever å sette opp flere eksperimentelle replikerer for time Point samling og møysommelig sample manipulasjon. Videre forenkler det minimale signal bidraget fra de effektor immun cellene dataanalyse. Programvaren kan behandle data automatisk og generere nyttige parametre som prosentandelen av cytolyse, KT50, etc. Teknologien har allerede vist høy følsomhet (med E:T-forhold så lavt som 1:20) og et stort dynamisk område (med E:T-forhold fra 20:1 til 1:20), som ikke er lett å oppnå med andre analyser. Samlet sett bør gjennomføringen av denne teknologien gi en mer nøyaktig dataanalyse på en høyere gjennomstrømming skala som vil forbedre utviklingen av bil T-celle reagenser, fremme feltet på et mye høyere tempo.

Disclosures

Forfatterne utfører forskning i bil T-celle utvikling og tilhørende potens analyser som er forretningsinteresser ProMab bioteknologi og ACEA biovitenskap, henholdsvis. Dette endrer imidlertid ikke forfatternes tilslutning til JoVE misjon om å øke spredningen av vitenskapelig kunnskap. Vilkårene i denne publikasjonen er gjennomgått og godkjent av ProMab bioteknologi og ACEA biovitenskap i samsvar med forsknings politikken.

Acknowledgments

Forfatterne takker ProMab bioteknologi og ACEA biovitenskap for å gi reagenser og instrumenter benyttet i denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD Biolegend 420404
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit ACEA Biosciences 8100005
anti-human F(ab')2 Jackson Immunoresearch laboratories. 109-116-088
APC anti-CD3 Biolegend 317318
Assay medium RPMI1640 life technologies.Corp 11875-093
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 Stemcell technologies #07930
CAR-T cell medium from ProMab AIM-V+300IFU/ml IL-2 12055-091
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads Thermofisher 11131D
DMEM GElifesciences.com SH30243.02
FACS buffer Promab made
FBS Lonza.com 14-503F
HEK293FT Thermo Fisher R70007
INFg ELISA kit Thermo Fisher
Lentiviral Packaging Mix System Biosciences VP100
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) Takara 631235
Promab medium for target cells Varied with cell lines
Real time Cellular Analyer ACEA Biosciences
Thermal cycler Thermo Fisher
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) Transplus, Alstem V020
Transfection dilution solution, Opti-MEM Thermo Fisher
Transfection reagent, NanoFect reagent Alstem NF100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
  2. June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  3. FDA. FDA approval brings first gene therapy to the United States. , Available from: https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm (2017).
  4. FDA. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma. , Available from: https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm (2017).
  5. Celgene. Celgene Corporation and bluebird bio Announce bb2121 Anti-BCMA CAR-T Cell Therapy Has Been Granted Breakthrough Therapy Designation from FDA and Prime Eligibility from EMA for Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. , Available from: http://ir.celgene.com/releasedetail.cfm?releaseid=1049014 (2017).
  6. Liu, B., Song, Y., Liu, D. Clinical trials of CAR-T cells in China. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 166 (2017).
  7. Fry, T. J., et al. CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy. Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).
  8. Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells. Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).
  9. Celyad. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate. , Available from: https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate (2017).
  10. Sheridan, C. Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf. Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).
  11. D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  12. Xu, J., et al. Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).
  13. Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities. Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).
  14. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
  15. Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. CAR T Cell Therapy for Solid Tumors. Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).
  16. de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy. Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).
  17. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLOS ONE. , (2018).
  18. Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells. Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).
  19. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).
  20. Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  22. Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).
  23. Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
  24. Glamann, J., Hansen, A. J. Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements. Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).
  25. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).
  26. Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).
  27. Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).
  28. Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels. Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).
  29. Golubovskaya, V., et al. CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth. Cancers. 9 (10), (2017).
  30. Golubovskaya, V. M., et al. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).
  31. Guedan, S., et al. Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 3 (1), (2018).
  32. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system. Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).
  33. Davenport, A. J., et al. CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells. Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).
  34. Hegde, M., et al. Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).
  35. Jin, J., et al. Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).
  36. Weiskopf, K. Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis. European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).
  37. Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy. Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).
  38. Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455). The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).
  39. Yamamoto, K., et al. Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer. Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).
  40. Xu, D., et al. The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy. Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).
  41. FDA. Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).
  42. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).
  43. Chiu, C. H., et al. Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).
  44. Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine. Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon chimeric antigen reseptor adoptiv celle terapi lentiviral genoverføring T-celler kreft immunterapi RTCA in vitro funksjonell analysen cytotoksisitet potens
A Real-Time potens analyse for chimeric antigen reseptor T celler målretting solid og hematologiske kreftceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xi, B., Berahovich, R., Zhou, H.,… More

Xi, B., Berahovich, R., Zhou, H., Xu, S., Wei, Y., Guan, J., Harto, H., Guan, J., Wu, L., Santa Ana, D., Cerignoil, F., Lamarche, B., Abassi, Y. A., Golubovskaya, V. A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells. J. Vis. Exp. (153), e59033, doi:10.3791/59033 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter