Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pretargeted радиоиммунотерапия, основанный на реакции Дильса Альдера спроса обратной электрона

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Этот протокол описывает синтеза и характеристика транс- cyclooctene (TCO)-изменение антитела и 177Лу меченых тетразина (Tz) лиганд для pretargeted радиоиммунотерапия (ГПРЗ). Кроме того он подробно использование этих двух конструкций в vivo накопление и продольных терапия исследований в мышиных модели развития колоректального рака.

Abstract

В то время как радиоиммунотерапия (RIT) представляет собой перспективный подход для лечения рака, долго фармакокинетические half-life radiolabeled антител может привести к высокие дозы излучения на здоровые ткани. Возможно не удивительно, несколько различные стратегии были разработаны чтобы обойти это ограничение тревожным. Одним из наиболее перспективных подходов является pretargeted радиоиммунотерапия (ГПРЗ). ГПРЗ основывается на развязки радионуклидов от иммуноглобулинов, инъекционных их отдельно и затем позволяет им сочетать в естественных условиях в ткани-мишени. Этот подход использует исключительные свойства Ориентация опухоли антител плинтуса их фармакокинетические недостатки, тем самым снижение дозы облучения непромысловых тканей и облегчения использования радионуклидов с периодом полураспада, которые считается слишком коротким для использования в традиционной radioimmunoconjugates. За последние пять лет наша лаборатория и другие разработали подход к в vivo pretargeting, основанный на реакции Дильса-Альдера (IEDDA) обратная электрон спроса между транс- cyclooctene (TCO) и тетразина (Tz). Эта стратегия успешно применяется для pretargeted позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и Однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) изображений с различных систем антител антигена. В пару последних публикаций мы продемонстрировали эффективность на основе IEDDA ГПРЗ в мышиных моделях протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и рака толстой кишки. В этом протоколе, мы описываем протоколы для использования Lu-DOTA-меченых тетразина лиганд 177ГПРЗ ([177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz) и TCO-модифицированные вариант колоректального рака, ориентация huA33 антител (huA33-TCO). Говоря более конкретно, мы будем описывать строительство huA33-ТКО, синтеза и radiolabeling [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz и производительность в vivo накопление и продольных терапия исследований в мышиных моделях колоректального рака.

Introduction

Радиоиммунотерапия (RIT) — использование антител для доставки терапевтических радионуклидов опухоли — уже давно заманчивые подход к лечению рака1,2. Действительно, это обещание было подчеркнуто Соединенных Штатов еда и администрация снадобья утверждение двух radioimmunoconjugates для лечения неходжкинская лимфома: 90Y-ibritumomab tiuxetan и 131-Тозитумомаб3 , 4. пока даже с первых дней своего существования, клинические перспективы RIT сдерживаются критического осложнение: высоких радиационных доз до здоровых тканей5,6. Вообще говоря, radioimmunoconjugates для RIT помечены долгоживущих радионуклидов (например, 131я [t½ = 8.0 дней] и 90Y [t½ = 2,7 дней]) с физическим полураспада, которые согласуются также с долго фармакокинетические полураспада иммуноглобулинов. Это важно, поскольку это гарантирует, что это достаточно радиоактивности остается после антитела достиг своей оптимальной накопление после нескольких дней циркуляции. Однако эта комбинация длительного проживания раз в крови и долгосрочной физической полураспада неизбежно приводит к облучения здоровых тканей, тем самым снижения терапевтические отношения и ограничения эффективности терапии7. Были изучены несколько стратегий для обхода этой проблемы, включая использование усеченного антитела фрагментов таких Fab, Fab', F(ab')2, minibodies и nanobodies8,9,10. Один из самых перспективных и увлекательный, но несомненно комплекс, альтернативные подходы — в естественных условиях pretargeting11.

В естественных условиях pretargeting является подход к ядерной изображений и терапии, которая стремится использовать изысканный аффинити и избирательности антител при плинтуса их фармакокинетические недостатки по11,12,13. С этой целью radiolabeled антитела, используемые в традиционных радиоиммунотерапия деконструкции на две составляющие: лиганд малые молекулы и immunoconjugate, который можно привязать как опухолевого антигена и вышеупомянутые лиганд. Immunoconjugate вводят сначала и учитывая «старт», часто несколько дней, в течение которых он накапливается в ткани-мишени и очищает от крови. Впоследствии малые молекулы лиганд администрируется и сочетает в себе immunoconjugate на опухоль или быстро очищает от тела. По сути в естественных условиях pretargeting полагается на выполнение радиохимии в пределах самого тела. Путем уменьшения распространения радиоактивности, этот подход одновременно снижает дозы облучения до здоровых тканей и облегчает использование радионуклидов (например, 68Ga,½ t = 68 мин211; Как,½ t = 7.2 h) с периодом полураспада, которые обычно считаются несовместимыми с векторов на основе антител.

Начиная с конца 80-х годов, были разработаны несколько различных подходов к в vivo pretargeting, включая стратегии, основанные на bispecific антител, взаимодействие между стрептавидина и биотин и гибридизации дополнительных олигонуклеотиды14,,1516,17,18. Тем не менее каждый прошла обратно в различной степени осложнений, наиболее лихо сильнодействующих иммуногенность стрептавидина модифицированные антитела19,20. За последние пять лет наша группа и другие разработали подход к в vivo pretargeting на основе быстрого и bioorthogonal обратная электрон спроса Дильса-Альдера перевязка между транс- cyclooctene (TCO) и тетразина (Tz) 21,,2223,24. Самым успешным из этих стратегий использовали TCO-модифицированные антитела и Tz подшипник лиганд, как TCO обычно более стабильной в естественных условиях чем ее Tz партнера (рис. 1)25,26. Как и другие pretargeting методики МАБ TCO immunoconjugate осуществляется впервые и дано время, чтобы очистить от обращения и накапливаются в опухолевой ткани. Впоследствии малые молекулы Tz лиганд вводят, после чего он либо клики с immunoconjugate в ткани-мишени или быстро очищает от тела. Это в vivo pretargeting стратегия оказался весьма эффективным для ПЭТ и ОФЭКТ изображений с несколькими системами различных антитела/antigen, последовательно производит изображения с высоким контрастом и позволяет использовать короткоживущих радионуклидов, такие как 18 F (t½ = 109 мин) и 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Совсем недавно была продемонстрирована эффективность на основе нажмите pretargeted радиоиммунотерапия (ГПРЗ) в мышиных моделях протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и колоректальные карциномы27,28. С этой целью, терапевтические радионуклидов 177Лу (βМакс = 498 кэВ, т1/2 = 6,7 дней) работал в сочетании с двух различных антител: 5B1, которая ориентирована на углеводный антиген 19.9 (CA19.9) повсеместно выражена в PDAC , и huA33, которое пристреливает A33, трансмембранный гликопротеин выражается в > 95% случаев колоректального рака. В обоих случаях такой подход к 177Лу-ГПРЗ принесли концентрации высокой активности в опухолевой ткани, создали терапевтический эффект зависит от дозы и одновременно снижение концентрации деятельности в здоровых тканях, по сравнению с традиционными непосредственно под названием radioimmunoconjugates.

В этой статье мы опишем протоколы для использования Lu-DOTA-меченых тетразина лиганд 177ГПРЗ ([177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz) и TCO-модифицированные вариант huA33 антител (huA33-TCO). Говоря более конкретно, мы описываем строительство huA33-TCO (рис. 2), синтез и radiolabeling [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz (рис. 3 и рис. 4) и производительность в vivo накопление и исследования продольной терапии в мышиных моделях колоректального рака. Кроме того представитель результаты и обсуждения, мы представим образец набора данных, адрес возможных стратегий для оптимизации этого подхода и рассматривать эту стратегию в более широком контексте в vivo pretargeting и ГПРЗ. Наконец, важно отметить, что хотя мы решили сосредоточиться на pretargeting с помощью huA33-TCO и [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz в настоящем Протоколе, эта стратегия является весьма модульной и могут быть адаптированы с учетом широкий спектр антител и радионуклидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все в vivo животных экспериментов описанных в этой работе были выполнены согласно утвержденных протоколов и казнены под этические принципы и Мемориал Слоун Kettering Рак центр, Weill Cornell медицинский центр, Хантер колледж Институционального ухода за животными и использования комитетов (IACUC).

1. Подготовка huA33-TCO

Примечание: Синтез huA33-TCO был ранее сообщалось29. Однако для удобства чтения, он реплицируется здесь с корректировками на оптимальных условиях.

  1. В пробки microcentrifuge 1,7 мл, подготовить 125 мкл раствора (E) - cyclooct - 4-энил 2,5-ди-1-pyrrolidinyl карбонат (TCO-NHS) в сухом диметилформамид (DMF) в концентрации 40 мг/мл (0,15 М). Это решение может быть aliquoted и замороженные при температуре-80 ° C для использования в будущих экспериментах.
  2. В отдельном 1,7 мл microcentrifuge трубку Подготовьте 5 мг/мл раствора huA33 в 1 мл фосфатный буфер (PBS; 2,7 мм хлорид калия, хлорид натрия 137 мм и фосфат калия 11.9 мм, рН 7,4).
  3. Использование малых аликвоты (< 5 мкл) 0,1 М Na2CO3, скорректировать рН раствор антител с шагом 1,2 до 8,8-9.0. Используйте бумага pH или pH метр с микроэлектродные для контроля рН и проявлять осмотрительность, что pH не превышает 9.0.
  4. Чтобы раствор антител, описано в шаге 1.3 медленно добавьте тома соответствует 40 Молярная эквиваленты TCO-NHS относительно количества антител. Например если 5 мг (30 нмоль) huA33 в растворе, добавьте 9.0 мкл (1,20 мкмоль) 40 мг/мл (0,15 М) решения TCO-NHS.
    Примечание: TCO-NHS гидрофобным. При добавлении его в решение антител, добавьте его медленно и с перемешиванием для предотвращения высыпания. Не превышает 10% ДМФ по объему в растворе окончательной реакции.
  5. Разрешить реакции для инкубации при 25 ° C на thermomixer за 1 час с мягким перемешиванием (500 об/мин).
  6. После 1 h очищайте huA33-TCO immunoconjugate с использованием предварительно упакованные одноразовые размер исключения опреснительной столбца.
    1. Сбалансировать размер исключение столбцов, как описано поставщиком для удаления консервантов в столбце во время хранения. Типичная процедура включает в себя мытье столбце 5 x с объемом PBS, что соответствует объему столбца: 5 x 2,5 мл ФСБ.
    2. Добавьте смесь реакции в столбце исключения размер, отмечая объем реакционной смеси.
    3. После того, как реакционную смесь вступил столбца, добавьте соответствующее количество PBS довести общий объем раствора добавляется в столбец до 2,5 мл. Например если спряжение реакция привела к общим объемом 1,3 мл, добавьте 1,2 мл дополнительных PBS в столбец.
    4. Соберите продукт с помощью 2 мл PBS как элюента.
      Примечание: Этот шаг приведет к окончательной конструкции huA33-TCO в 2 мл PBS, рН 7,4.
  7. Измерение концентрации huA33-ТКО, используя Спектрофотометр UV-Vis, мониторинг волны 280 Нм. Коэффициент молярной вымирания для большинства IgGs (ε280) является 210000 M-1см-1.
  8. Если решение с более высокой концентрации immunoconjugate, концентрат huA33-TCO решения с помощью центробежного фильтра с 50000 молекулярный вес отсечения следуя инструкциям производителя.
    Примечание: Многие антитела были известны агрегировать или осадок во время концентрации. При попытке этой процедуры с новой антитела, исследователи следует отложить литературы или их собственный опыт обработки антител в вопросе.
  9. Храните заполненные huA33-TCO immunoconjugate на 4 ° C в темноте, если это необходимо немедленно. Если она будет использоваться более чем на 4 дня в будущем, храните его при температуре-80 ° C в темноте.
    Примечание: Это приемлемым остановочный пункт в процедуре. Завершенных huA33-TCO immunoconjugate должно быть стабильным, по крайней мере 6 месяцев хранения при температуре-80 ° C в темноте.

2. синтез Tz-PEG7- NHBoc

  1. В трубу microcentrifuge 1,7 мл растворяют 5 мг тетразина N- hydroxysuccinimidyl эфира (Tz-NHS; 12,6 мкмоль) 0,15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО).
  2. В трубу microcentrifuge отдельный 1,7 мл растворяют 8 мг БПЦ защищенные амино PEG полимера, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene гликоль (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 мкмоль) 0,15 мл безводного ДМСО.
  3. К решению Tz-NHS добавить 3 мкл (21,3 мкмоль, 1.7 Молярная эквиваленты) триэтиламин (чай) и тщательно перемешать.
  4. Добавить решение розовый тетразина в NHBoc-PEG7-NH2 решение от шаг 2,2 и инкубировать 30 мин при комнатной температуре (RT) с мягким перемешиванием реакционной смеси.
  5. После 30 минут, разбавить реакции 1:1 H2O и очистить реакции, с помощью обратная фаза C18 высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для разделения любых непрореагировавшего Tz-NHS от Tz-PEG7- NHBoc. Используйте растворители без кислоты для предотвращения преждевременного удаления Boc, защищая группы. Контролировать оба Tz-PEG7- NHBoc и Tz-NHS на длине волны 525 Нм.
    Примечание: Время удержания зависят очевидно оборудование ВЭЖХ каждой лаборатории (насосы, колонки, трубы, и т.д.), и соответствующие элементы управления должны выполняться до очистки. Однако представить пример, если градиент 5: 95 MeCN/H2O (оба без каких-либо добавка) 95:5 MeCN/H2O свыше 30 мин, 1 мл/мин скорость потока и столбец18аналитической 4,6 мм x 250 мм C используются , время удержания Tz-NHS и Tz-PEG7- NHBoc, вокруг 16 мин и 18 мин, соответственно.
  6. Заморозить собранных элюента ВЭЖХ, с использованием жидкого азота и оберните трубы теперь замороженные коллекции в алюминиевой фольги. Место замороженных коллекции трубку на лиофилизатор ночь чтобы удалить мобильный этапа ВЭЖХ. Продукт будет характерным ярко розовый твердых.
    Примечание: Если жидкий азот не доступен, заморозить собранных элюента ВЭЖХ в сухой лед или на ночь в холодильнике-80 ° C.

3. синтез Tz-PEG7-NH2

  1. Продукт от шаг 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, добавить 1,5 мл Дихлорметан (DCM) и передать это решение небольшой флакон раунд снизу.
  2. Каплям добавьте 0,25 мл trifluoroacetic кислоты (ТФК) розовый решение от шаг 3.1.
  3. Разрешить реакция Инкубируйте 30 мин на RT с мягким перемешиванием.
  4. После 30 мин испаряются растворителя через Ротари испарения. Не превышайте Ванна температура воды 37 ° c.
  5. Воссоздать розовый вязких продуктов в 0,5 мл воды.
  6. Очищайте продукт с помощью ВЭЖХ обратная фаза C18 отделить Tz-PEG7-NH2 от защищенных Boc прекурсоров. Контролировать оба Tz-PEG7- NHBoc и Tz-PEG7-NH2 на длине волны 525 Нм.
    Примечание: Время удержания зависят очевидно оборудование ВЭЖХ каждой лаборатории (насосы, колонки, трубы, и т.д.), и соответствующие элементы управления должны выполняться до очистки. Однако представить пример, если градиент 5: 95 MeCN/H2O (оба с 0.1% TFA) 95:5 MeCN/H2O свыше 30 мин, 1 мл/мин скорость потока и столбец18аналитической 4,6 мм x 250 мм C используются , время удержания Tz-PEG7- NHBoc и Tz-PEG7-NH2 являются около 18 мин и 13 мин., соответственно.
  7. Заморозить собранных элюента ВЭЖХ, с использованием жидкого азота и оберните трубы теперь замороженные коллекции в алюминиевой фольги. Место замороженных коллекции трубку на лиофилизатор ночь чтобы удалить мобильный этапа ВЭЖХ. Продукт будет прочной ярко розовый.
  8. Воссоздать продукт от шаг 3.7, Tz-PEG7-NH2, с 150 мкл ДМСО и передачи пробки microcentrifuge 1,7 мл.
  9. Измерьте концентрацию Tz-PEG7-NH2 используя Спектрофотометр UV-Vis, мониторинг 525 Нм длины волны. Коэффициент молярной вымирания для Tz-PEG7-NH2 (ε525) составляет 535 М-1см-1.

4. синтез Tz-PEG7- DOTA

  1. Распустить Tz-PEG7-NH2 (4,5 мг, 6,9 мкмоль) 0,15 мл ДМСО (или просто продолжите решение, созданное в шаге 3.8).
  2. Добавьте 22 Молярная эквиваленты чая (21 мкл, 0,15 ммоль) в тетразина содержащих решение от шаг 4.1.
  3. Добавьте 10 мг (14.2 мкмоль) p- СКС-Bn-DOTA как твердых и вихревой решение для около 2 минут или до полного растворения материала.
  4. Разрешить реакция Инкубируйте 30 мин на RT с мягким перемешиванием.
  5. После 30 мин разбавить реакции 1:1 H2O и очистить продукт с помощью ВЭЖХ обратная фаза C18 для удаления непрореагировавшего p- СКС-Bn-DOTA. P- СКС-Bn-DOTA может контролироваться на длине волны 254 Нм, в то время как Tz-PEG7- DOTA лучше контролируется на длине волны 525 Нм.
    Примечание: Время удержания зависят очевидно оборудование ВЭЖХ каждой лаборатории (насосы, колонки, трубы, и т.д.), и соответствующие элементы управления должны выполняться до очистки. Однако представить пример, если градиент 5: 95 MeCN/H2O (оба с 0.1% TFA) 95:5 MeCN/Ч используются2O свыше 30 мин и столбец аналитической 4.6 x 250 мм C18, Tz-PEG7- DOTA и p СКС-Bn-DOTA имеют время удержания около 15,6 мин и 16.1 мин, соответственно.
  6. Заморозить собранных элюента ВЭЖХ, с использованием жидкого азота и оберните трубы теперь замороженные коллекции в алюминиевой фольги. Место замороженных коллекции трубку на лиофилизатор ночь чтобы удалить мобильный этапа ВЭЖХ. Продукт будет ярко розовый порошок.
  7. Воссоздания продукт в 0,15 мл ДМСО и измерять концентрацию, используя Спектрофотометр UV-Vis, мониторинг 525 Нм длины волны. Коэффициент молярной вымирания для Tz-PEG7- DOTA (ε525)-535 М-1см-1.
  8. Анализировать окончательное соединение, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и высоким разрешением масс-спектрометрия (СУЛР) чтобы убедиться, что синтез был успешным. Приведена Таблица 1 экспериментально определенных химических сдвигов и молекулярных масс всех соединений, обсуждается в этой работе.
  9. Хранить очищенный Tz-PEG решение7- DOTA в темноте при температуре-80 ° C.
    Примечание: Это приемлемым остановочный пункт в процедуре. Завершенные Tz-PEG7- DOTA прекурсоров является стабильным для по крайней мере 1 год в этих условиях.

5. 177Лу Radiolabeling от Tz-PEG7- DOTA

Предупреждение: Этот шаг протокола включает обработки и манипуляции радиоактивности. Перед выполнением этих шагов — или выполнения другой работы с радиоактивностью — исследователи должны проконсультироваться с их дома учреждением Департамента радиационной безопасности. Принять все возможные меры для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

Примечание: При работе с небольшим количеством radiometals это рекомендуется, что все буферы быть свободным от микроконцентрации металлов для предотвращения вмешательства в координации привязки сайта.

  1. В 1,7 мл пластиковых пробирок добавьте 200 мкл 0,25 М аммония ацетат буфера скорректирована с аликвоты HCl 1 M до pH 5.5.
    Примечание: При использовании менее 370 MBq деятельности для маркировки, объем буфера следует уменьшить до 100 мкл.
  2. Добавьте необходимое количество [177Лу] LuCl3 буферного раствора. Добавлена сумма будет зависеть количество предметов в эксперимент и радиоактивных доз. Рекомендуется добавить 1-2 дополнительных доз стоит радиоактивности в качестве меры предосторожности, чтобы компенсировать потери радиоактивности во время очистки шагов.
  3. Добавить Tz-PEG7- DOTA в ДМСО в радиоактивных смесь в шаг 5.2. Tz-PEG7- DOTA сумма зависит от количества предметов тестируется. Более подробно на эту тему можно найти в шаге 6.2.2.2.
  4. Дайте раствору для инкубации при 37 ° C в течение 20 мин.
  5. Убедитесь, что radiolabeling является полным, с помощью радио мгновенно тонким слоем хроматографии (Радио налогам) с 50 мм ЭДТА, рН 5,5 как подвижная фаза. Приклеенные этикетку [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz будет оставаться базовой — Rf = 0 — Свободный [177Лу] в то время как Лу3 + будет координироваться ЭДТА и будет путешествовать с растворителя Фронт, Rf = 1.0 (рис. 3B).
  6. Если количественные маркировки не достигается, добавьте дополнительные лигандом для координации бесплатно radiometal. Кроме того, очищают помечены [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz, используя патрон18 C. Следуйте инструкциям производителя для использования. Ниже приводится пример процедуры.
    1. Премьер картриджа, медленно проходя через 5 мл этанола через картридж с большой шприц. Затем проходят через 5 мл ацетонитриле, а затем 5 мл дейонизированной (DI) H2O.
    2. Разработать решение лиганд от шага 5.3 в меньших шприц и вставляют его медленно на патрон18 C. Затем мыть патрон с 10 мл ди H2O для удаления любого присоединенных [177Лу] LuCl3.
    3. Элюировать с 500 мкл этанола. Удалите любые этанола из конечного продукта путем передачи судна с низким расходом сухого азота или аргона для 10-15 мин. Впоследствии Ресуспензируйте лиганд в физиологического раствора в объеме, определенный на шаге 6.2.2.2.

6. в vivo исследования

Предупреждение: Как и в разделе 5, этот шаг протокола включает обработки и манипуляции радиоактивности. Перед выполнением этих шагов, исследователи должны проконсультироваться с их дома учреждением Департамента радиационной безопасности. Принять все возможные меры для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

  1. Подготовка животных
    1. В женской Атинические обнаженной мышей, подкожно имплантата 5 х 106 SW1222 колоректального рака клеток приостановлено в 150 мкл 1:1 смесь клеток СМИ и матрицы (например., Matrigel) и разрешить эти расти в 100-150 мм3 Ксенотрансплантат (14-18 дней после прививки).
    2. Сортировка животных накопление эксперимента
      1. После того, как опухоли достаточного размера, как определено измерение суппорта, сортировка животных, чтобы обеспечить каждого когорты имеет примерно такой же объем средняя опухоли. Животных можно отличить в каждой клетке маркировка на кабеле с несмываемыми чернилами (одна полоса, две полосы и т.д.).
    3. Сортировка животных для изучения продольной терапии
      1. После того как опухоли достаточного размера, как определяется суппорта измерения, приложите ушные бирки к каждому из животных для обеспечения правильного отслеживания на протяжении всего эксперимента.
        Примечание: Численные ушные бирки может упасть в ходе эксперимента. В результате, рекомендуется сопровождать эти физические Теги с насечками уха на систематической основе (т.е., вправо, влево, двусторонние, право x 2, оставил x 2).
      2. Отсортировать животных, так что объем средняя опухоли в каждом когорты примерно одинаковой. Следующий метод для животных сортировка может производиться с использованием программы электронных таблиц.
        1. Список животных идентификационные номера, уха паз шаблона и объем опухоли в трех отдельных колонках.
        2. Сортировка данных от наименьшего к объему опухоли.
        3. В четвертом столбце назначьте каждое животное клетка номер и цикл через клетки в шаблоне седеют. Например, если есть 5 клеток, этот столбец будет заполнен «5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5...», до тех пор, пока все животные назначаются клетке.
        4. После того, как назначаются клетки, отсортировать данные по номеру клетки. Если используются уха вырезами, убедитесь, что каждое животное в клетке данного имеет уникальный уха паз шаблона. При наличии дубликатов (два или более из той же модели) в данной клетке, одной мыши своп с одним из другой клетке с отсутствует шаблон до каждой клетки имеет животных с уникальными уха паз узорами.
  2. Формулировки и инъекции
    Примечание: Последовательность инъекции для накопление и терапии исследование продолжается следующим образом: huA33-TCO вводится впервые, следуют [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz после заранее определенного интервала.
    1. Immunoconjugate
      1. Разбавьте Алиготе huA33-TCO решения от 1.9 шаг к концентрации 0,8 мг/мл в 0,9% стерильного физиологического раствора.
      2. Нарисуйте дозы 150 мкл (100 мкг) huA33-TCO раствора в шприцы, предварительно обработанных с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS и хранить эти шприцы на льду.
        Примечание: BSA лечение уменьшает неспецифической Связывание антитела к стенам шприца.
      3. Теплые животных под тепла лампы 3 минут разбавить хвост вен.
      4. Внедрять решения huA33-TCO в Вену хвост мыши ксенотрансплантата подшипника. HuA33-TCO накапливаться в опухоль мыши позволяют 24 h (или различные заранее определенной временной интервал).
    2. Лиганд
      1. Radiolabel Tz-PEG7- DOTA, как указано в разделе 5.
      2. Нарисуйте дозы 150 мкл 0,9% стерильный физиологический, содержащие 1.1 Молярная эквиваленты Tz-PEG7- DOTA относительно количества huA33-TCO управлением. Например если 100 мкг (0,67 нмоль) huA33-TCO вводили животным и [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz реакционную смесь был сделан с удельной активностью 12.4 ГБК/мкмоль, затем дозы будет рисоваться содержащие 9.14 MBq деятельности каждого. Это соответствует 0,74 нмоль Tz (1.1 Молярная уравнение относительно huA33-TCO).
      3. Теплые животных под тепла лампы 3 мин для расширения вен хвост.
      4. Inject доза лиганд в Вену хвост мыши ксенотрансплантата подшипника. Активности для инъекций определяется исследователь. Опубликованные данные показали дозозависимый лечебное воздействие на размер опухоли в диапазоне 7,4-55,5 MBq.
  3. Накопление
    1. В точке желаемое время, после отправления лиганд, усыпить каждого когорты мышей с использованием 2% O2 / 6% CO2 газовые смеси.
      Примечание: Выполните любые институциональные требования, касающиеся методов для средней физической эвтаназии (например, шейки матки дислокации).
    2. Для каждого животного, удалите все органы интерес, промойте их в ванну с водой, чтобы удалить любой избыток крови и высушите их на бумажное полотенце в открытом воздухе 5 мин образца орган списка в предлагаемый порядок: крови, опухоли, сердца, легких, печени, селезенки, желудка, тонкой кишки , толстой кишки, почек, мышц, костей, кожи, хвост.
    3. После того, как достаточно сушеные, место органов в трубы предварительно взвешенным одноразовые культуры. Вес трубы заполнены теперь еще раз, чтобы получить массу каждого органа или ткани.
    4. Измерения активности в каждой из трубок с помощью гамма-счетчик. Калибровка измеренных деятельность в гамма счетчике детектора используется для измерения дозы обращается. Количество радиоактивных стандартов 177Лу на каждом инструменте и определить калибровочный фактор для взаимное преобразование между активностью и рассчитывает в минуту (cpm).
    5. Участок в накопление данных в виде диаграммы (см. рис. 5) с середины нормированный поглощения для каждого органа, отображается вместе с Бар обозначает одно стандартное отклонение. Статистические различия между группами образца в поглощения могут быть оценены путем непарных t теста, в котором значение достигается при p < 0,05.
  4. Мониторинг терапии
    1. При помощи штангенциркуля, измерьте длинная сторона продолговатые опухоли (длина) а также ширину перпендикулярно длине. Вычислить объем, используя формулу для объем эллипсоида: πL· (4/3) W· H, который упрощает для ½L· W2, при условии, что высота примерно равна ширине.
      Примечание: Это также можно использовать портативный опухоли, измерительный прибор, если он доступен (см. Таблицу материалы).
    2. Вес каждой мыши на баланс, чтобы отслеживать увеличение веса или потери веса с течением времени.
    3. Важно отметить, что контролировать внешний вид каждого животного для признаков бедствия, такие как сгорбившись обратно или разорванные кожных кровеносных сосудов (что может свидетельствовать о haematotoxicity).
      Примечание: Размеры опухоли должны собираться каждые 1-2 дней в ходе исследования продольной терапии.
    4. Отобразить данные из продольных терапии изучения как средним объемам опухоль со временем и нормализовать начиная объем опухоли, при желании. Статистические различия в поглощение в тот же день между группами образца могут быть оценены путем непарных t теста, в котором значение достигается при P < 0,05. Более обширные статистические анализы могут и должны осуществляться как рекомендованный подготовленных биостатистик.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Спряжение TCO для huA33 основывается на сцепное устройство между Амин реактивной TCO-NHS и остатков лизина на поверхности иммуноглобулина. Этот метод является весьма надежной и воспроизводимость и надежно дает степени из маркировки 2-4 TCO/МАБ. В этом случае MALDI-ToF масс-спектрометрии был нанят для подтверждения степени маркировки примерно 4,0 TCO/МАБ; значение же было получено с помощью Флюорофор модифицированные тетразина как репортер24. Синтез тетразина лигандом осуществляется в три этапа: (1 муфта Tz-NHS компоновщик PEG моно БП защищенные (2 deprotection из этой промежуточной доходность Tz-PEG7-NH2и (3) формирование Тиомочевина связь между p- СКС-Bn-DOTA и Tz-PEG7-NH2. Эта процедура является относительно легким и дает Tz-PEG7- DOTA в целом доходность ~ 75%. Каждый из промежуточных продуктов характеризовалась HRMS и 1H ЯМР; Эти данные представлены в таблице 1.

Перейти к radiolabeling, 177Лу3 + обычно получается из коммерческих поставщиков как хлорид соль [177Лу] LuCl3 в 0,5 М HCl. Radiolabeling Tz-PEG7- DOTA с 177Лу приносить Лу-DOTA-PEG лиганд [177Лу]7- Tz очень проста: просто 20 мин, реакция является полным, производить необходимый продукт в > 99% радиохимической чистота, как определено радио налогам. Как правило без дальнейшей очистки необходимо до формулирования. Обзор литературы по на основе Tz/TCO pretargeting предполагает, что Tz:mAb молярное соотношение ~ 1:1 производит лучшие в естественных условиях данных10. В результате не важно получить лиганд в высшей возможной Молярная активности. Например, накопление экспериментов обсуждали здесь работают [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz с молярной активностью ~ 12 ГБК/мкмоль. Для исследования продольной терапии, в отличие от [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz с высшей Молярная деятельности был использован для того, чтобы облегчить администрирование больших доз радиоактивности без изменения количества закачиваемой молей тетразина.

Как будет рассматриваться далее в ходе обсуждения, накопление экспериментов имеют первостепенное значение для понимания и оптимизации любой подход к ГПРЗ. В этом случае накопление эксперименты были проведены для определения оптимального интервала времени между администрацией immunoconjugate и инъекции лиганд. С этой целью мы использовали Атинические обнаженной мышей с учетом подкожной ксенотрасплантатов A33 антиген выражая SW1222 на правом плече. Эти животные получили 100 мкг (0,67 нмоль) huA33-ТШО, 24, 48, 72 или 120 h до инъекции [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz (9,14 MBq, 0.74 нмоль). Рисунок 5 показывает, что все интервалы инъекции производят концентрации высокой активности в опухолевой ткани, а также низкая активность концентрации в здоровых органов. Интервал впрыска 24 h дает высокий опухолевой поглощение на 120 h впрыск: 21.2 ± 2.9%ID/g. Каждый набор условий также производит показателями концентрации впечатляющие активности опухоли орган. Pretargeting с интервалом в 24 часа, например, урожайность опухоли на крови, опухоли в печени и опухоль к мышцы соотношения 20 ± 5, 37 ± 7 и 184 ± 30, соответственно, 120 ч после приема лиганд. Основываясь на этих выводах, с интервалом 24 часа был выбран для последующих продольной терапии исследование (см. ниже).

В естественных условиях продольной терапии исследования когорты (n = 10) Атинические обнаженной мышей с учетом подкожной SW1222 ксенотрасплантатов на правом фланге были administered huA33-TCO (100 мкг, 0,67 нмоль) за 24 часа до введения [177Лу] Лу-DOTA-PEG 7- Tz. Были наняты три различных экспериментальных когорты, 18,7, 37 или 55,5 MBq [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz (соответствующий Молярная деятельности 24, 45 и 70 ГБК/мкмоль). Кроме того, два элемента управления когорты получил одну половину ГПРЗ режима: либо huA33-TCO (100 мкг, 0,67 нмоль) без [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz или [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz (55.5 MBq, 0.74 нмоль) без huA33-TCO. Таковы основные элементы управления для обеспечения что терапевтический ответ не вызвало immunoconjugate или только лиганд. Объемы опухоли были измерены каждые 3 дней для первых трех недель исследования и затем один раз в неделю до завершения эксперимента (70 дней, 10 полураспада 177Lu). Как видно на рисунке 6, существует Старк разница в ответ экспериментальной когорт, по сравнению с контрольными группами. В то время как опухолей у мышей, получают только один из компонентов стратегии ГПРЗ продолжают расти снят, опухоли мышей, получающих полную схему ГПРЗ остановить рост и в конечном счете сократится до тома значительно ниже тех измеряется в начале исследования. Важно отметить, что никаких токсичных побочных эффектов не наблюдалось, и все животные сохранить вес в пределах 20% от их первоначальной массы (рис. 7A). Каплана-Мейера участок данных обеспечивает еще более поразительное визуализация исследования: в то время как все мышей в когортах управления пришлось быть умерщвлены в течение нескольких недель, мышей экспериментальной когорты была идеальный запись выживания в конце исследования ( Рисунок 7B).

Figure 1
Рисунок 1: мультфильм схема pretargeted радиоиммунотерапия на основании реакция спроса Дильса-Альдера обратная электрон. Эта цифра была изменена с помощью ссылки #28. (Адаптированный) Перепечатано с разрешения Membreno, р., повар, б. е., Фунг, K., Льюис, J. S. & Zeglis, б. м. Click-Mediated Pretargeted радиоиммунотерапия колоректального рака. Молекулярная Фармацевтика. 15 (4), 1729-1734 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема строительства huA33-TCO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схема синтеза Tz-PEG7- DOTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: (A) схема radiolabeling [ 177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz; (B) представитель радио налогам Хроматограмма демонстрации > 98% радиохимической чистоту [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Накопление в о в vivo pretargeting с huA33-TCO и [177Лу] PEG - DOTA -7- Tz Атинические обнаженной мышей с учетом подкожной опухоли человека колоректального рака SW1222, с помощью pretargeting интервалы 24 (фиолетовый), 48 (зеленый) , 72 (оранжевый) или 120 (синий) ч. Данные стандартные ошибки из когорты n = 4; Статистический анализ была исполнена качестве непарный студента t теста, **p < 0.01. Эта цифра была изменена с помощью ссылки #28. (Адаптированный) Перепечатано с разрешения Membreno, р., повар, б. е., Фунг, K., Льюис, J. S. & Zeglis, б. м. Click-Mediated Pretargeted радиоиммунотерапия колоректального рака. Молекулярная Фармацевтика. 15 (4), 1729-1734 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: продольной терапии исследование 5 групп мышей (n = 10) подшипник подкожной SW1222 опухоли изображены в среднем опухоли тома как функцию времени (A); и объем опухоли, нормализуется до первоначального объема в зависимости от времени (B). Группы управления получил immunoconjugate без лиганд (синий) либо лиганд без immunoconjugate (красный). Группы получили три лечения huA33-TCO (100 мкг, 0.6 нмоль) следуют 24 h позже 18,5 (зеленый), 37.0 (фиолетовый) или 55,5 MBq (оранжевый) (~0.8 нмоль в каждом конкретном случае) [177Лу] PEG - DOTA -7- Tz. Журнал-ранг (камин-Кокс) тест, выживание было значительным (p < 0.0001) для всех групп лечения. Эта цифра была изменена с помощью ссылки #28. (Адаптированный) Перепечатано с разрешения Membreno, р., повар, б. е., Фунг, K., Льюис, J. S. & Zeglis, б. м. Click-Mediated Pretargeted радиоиммунотерапия колоректального рака. Молекулярная Фармацевтика. 15 (4), 1729-1734 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: вес кривых для животных во время исследования продольной терапии 5 групп мышей (n = 10) подшипник подкожной SW1222 опухоли (A); кривой соответствующего выживания Каплана-Мейера (B). Группы управления получил immunoconjugate без лиганд (синий) либо лиганд без immunoconjugate (красный). Группы получили три лечения huA33-TCO (100 мкг, 0.6 нмоль) следуют 24 h позже 18,5 (зеленый), 37.0 (фиолетовый) или 55,5 MBq (оранжевый) (~0.8 нмоль в каждом конкретном случае) [177Лу] PEG - DOTA -7- Tz. Эта цифра была изменена с помощью ссылки #28. (Адаптированный) Перепечатано с разрешения Membreno, р., повар, б. е., Фунг, K., Льюис, J. S. & Zeglis, б. м. Click-Mediated Pretargeted радиоиммунотерапия колоректального рака. Молекулярная Фармацевтика. 15 (4), 1729-1734 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Соединение 1 H-ЯМР смены HRMS (ESI)
500 МГц, ДМСО
TZ-PEG7- NHBoc 10.52 (s, 1H), 8.50 (m, 3 Ч), 7,82 (t, 1H), 7.46 (d, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3.42 (м, 22H), 3,33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2.99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.70 (q, 2H), 1,29 (s 9 Ч) m/z calcd. для C35H57N7O11Na: 774.4005; Найдено: 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10,58 (s, 1H) 8.46 (м, Ч. 2), 7,87 (t, 1H), 7.75 (d, 2H), 7.52 (d, 1H), 4.40 (d, 2H), 3,60-3.50 (м, 26H), 3.40 (t, 2H), 3.32 (bs, Ч. 2), 3,20 (q, 2H), 2.99 (bs, Ч. 2), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (q, Ч. 2). m/z calcd. C30H50N7O9: 652.3670; Найдено: 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9,63 (bs, Ч. 1), 8.45 (m, 3 Ч), 7,86 (m, 1H), 7.73 (bs, 1H), 7.54 (d, 2H), 7,41 (м, Ч. 2), 7.19 (м, Ч. 2), 6.54 (bs, Ч. 1), 4.40 (d, 2H), 4.00-3.20 (м, 55H), 3,20 (q, 4 Ч), 2,54 (s, 1H), 2.18 (t, 3 Ч), 2.10 (t, 3 Ч), 1,76 (q 2 ЧАСА). m/z calcd. для C50H76N11O15S: 1202.56; Найдено: 1203.5741.

Таблица 1. Характеристика данных для органических соединений, описанных в настоящем Протоколе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Одним из преимуществ этого подхода в vivo pretargeting — особенно в отношении стратегии основывается на bispecific антител и radiolabeled гаптенами — это ее модульность: транс- cyclooctene постановление может быть присоединен к любой антитела, и тетразина radioligands можно radiolabeled с чрезвычайным разнообразием радионуклидов без ущерба для их способности реагировать с их партнерами нажмите. Тем не менее адаптации этого подхода к другим антитела/antigen системы не так просто, как дублирование протокол, описанных здесь. Конечно любая попытка создать новый immunoconjugate МАБ TCO или Роман тетразина подшипник лиганд должно сопровождаться соответствующим химических и биологических характеристик анализов, включая испытания на устойчивость и реакционная способность. Но помимо этого, существуют две переменные, которые особенно важны для изучения и оптимизации: (1) масса МАБ TCO immunoconjugate управлением и (2 интервал времени между инъекции МАБ TCO и отправления лиганд. Оба фактора могут существенно влиять на поведение в vivo pretargeting системы. Например использование чрезмерно высоких доз immunoconjugate или интервала периодов, которые являются слишком короткими может привести к слишком высокой активности концентрации в крови из-за клик реакции между лиганд и immunoconjugate, оставаясь в обращении. И наоборот используя массы immunoconjugate, которые являются слишком низкими или слишком длинный интервал периодов напрасно снижают концентрации деятельности в опухоль из-за неспособности насыщают антиген или неумолимо (хотя медленно) изомеризации транс - cyclooctene для неактивных СНГ- cyclooctene. Вдоль этих линий выполняя накопление экспериментов с использованием целого ряда масс immunoconjugate и pretargeting интервалы могут быть чрезвычайно полезным. Конечно также рекомендуется запускать соответствующие элементы управления в тандеме с любые эксперименты в естественных условиях . К ним относятся — но не ограничиваясь — эксперименты с изображением антигеннегативными клеточных линий, блокирование когорты, которые получают огромное превышение неконъюгированной антитела, администрация только лиганд, инъекции лиганд после TCO- не хватает immunoconjugate и в естественных условиях pretargeting с использованием неспецифической, изотипа управления TCO-подшипник immunoconjugate.

В качестве альтернативы изображений экспериментов может использоваться для оптимизации, если терапевтического радионуклида излучает позитроны или «изображения» фотонов или если «изображения» isotopologue терапевтический радионуклида доступен. В конечном счете для последующих продольной терапия исследований следует выбрать наборы переменных, которые обеспечивают наилучший баланс высокой активности опухолевых концентрации и показателями концентрации опухоли на фоне высокой активности. В случае, представленные здесь, 100 мкг huA33-TCO вводили с интервалом 24 ч. расчётов дозиметрии — особенно те, которые позволяют для расчета доз опухоли и терапевтические отношения — также могут быть полезны в процессе оптимизации.

Важно отметить, что даже перспективных [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz/huA33-TCO системы, которая была разработана могут воспользоваться дополнительной оптимизации. Сравнение между дозиметрических данных из этого подхода к ГПРЗ и традиционных RIT с 177Лу меченых вариант huA33 показывает, что опухоль дозы ГПРЗ лежит ниже, чем в традиционных RIT. Кроме того, эффективная доза ГПРЗ системы (0.054 мЗв/MBq) лишь незначительно ниже, чем у традиционных RIT (0.068 мЗв/MBq).

В настоящее время изучаются два средства по этим вопросам. Во-первых дендритных леску был разработан способен увеличения числа TCOs добавляется каждого антитела30. В контексте pretargeted PET изображений, этот подход значительно повышает концентрации опухолевых активность, и аналогичные эксперименты с [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz ведутся. Во-вторых использование тетразина подшипник расчистки агентов могут быть полезны в контексте ГПРЗ. Администрация очистных агентов до инъекции лиганд эксплуатируется в различных pretargeting методологии как способ уменьшить концентрацию остаточного immunoconjugate в крови и тем самым снизить концентрации деятельности в здоровых органов23,31. Использование очистки агенты это не без его недостатки, хотя; наиболее заметным из которых возрастающей сложности уже правда сложных терапевтические модальности. Тем не менее исследователи Мемориал Слоун Kettering Рак центр недавно опубликовал убедительные доклад о создании Tz меченых декстрана, очистка агент для pretargeted PET изображений и данных об использовании этой конструкции в сочетании с [177Лу] Лу-DOTA-PEG7- Tz и huA33-ТШО являются предстоящей32. Другой подход к максимизации дозиметрические преимущества ГПРЗ является использования радионуклидов с короче физической полураспада. Это оказалось весьма эффективным для отображения; Однако терапевтические радионуклидов с короткой физической полураспада являются немногие и далеко между ними.

Наконец мы бы непростительно, если мы не смогли должным образом решить некоторые из встроенных ограничений pretargeting, основанный на реакции спроса Дильса-Альдера обратная электрона. Первая из этих проблем является неотъемлемым правом всех подходов к в vivo pretargeting: антитела занятых нельзя относить привязки в ткани-мишени. Это, конечно, важно, как антитело должно оставаться доступным для лиганд, а не изолированы в внутриклеточного отсек. Это ограничение является правда трудно обойти, хотя это недавно было показано что антитела с медленно умеренной темпы интернализации может использоваться для в vivo pretargeting33,34. Во-вторых, медленно в vivo изомеризации реактивной транс -cyclooctene для неактивных СНГ -cyclooctene имеет потенциал, чтобы ограничить длину интервала между администрацией TCO-подшипник immunoconjugate и инъекция лиганд. Критически интервалы до 120 h еще предоставили отличные результаты в контексте обоих pretargeted ПЭТ воображения и ГПРЗ. Однако использование этих более длительные интервалы почти всегда сопровождается незначительные сокращения концентраций опухолевых деятельности, результатов, которые могут вытекать из этой изомеризации. Чтобы устранить эту проблему, несколько лабораторий пытались создать более стабильные транс- cyclooctenes без ущерба для реактивности, в то время как другие пытались разработать совершенно новый dienophiles, способные реагировать с тетразина35 . В ближайшие годы это мы надеемся, что эти химические изменения будут использованы для ГПРЗ.

В конце концов ГПРЗ, основанные на перевязки спроса Дильса-Альдера обратная электрона, несомненно, возникающим и несколько незрелых технологий. Однако тем не менее нас обнадеживает доклинические результаты мы получили и возбужденных для клинических обещание этой стратегию. Мы искренне надеемся, что этот Протокол поощряет других, чтобы исследовать и оптимизировать этот подход и таким образом топливо свое путешествие из лаборатории в клинику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-р Джейкоб Houghton за полезные беседы. Авторы хотели бы также поблагодарить низ за их щедрое финансирование (R00CA178205 и U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

Химия выпуск 143 радиоиммунотерапия pretargeted радиоиммунотерапия pretargeting реакция спроса Дильса-Альдера обратная электронов тетразина транс- cyclooctene huA33 A33 антигена Лютеция-177
Pretargeted радиоиммунотерапия, основанный на реакции Дильса Альдера спроса обратной электрона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter