Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Radioimmunotherapy pretargeted התגובה תגובת דילס-אלדר דרישה אלקטרון הופכי

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה של אפיון טרנס- cyclooctene (TCO)-שונה נוגדן, radioligand tetrazine התווית על-ידי Lu (ט ז) 177עבור pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). בנוסף, זה מפרט את השימוש אלה בונה שני עבור ויוו biodistribution ומחקרים טיפול האורך במודל מאתר של סרטן המעי הגס.

Abstract

בעוד radioimmunotherapy (המדהימה) היא גישה מבטיחה לטיפול בסרטן, זמן מחצית החיים ארוכה פרמוקוקינטיים של נוגדנים radiolabeled יכול לגרום במנות קרינה גבוהה לרקמות בריאות. אולי לא מפתיע, מספר אסטרטגיות שונות פותחו כדי לעקוף מגבלה זו מטרידה. אחד המבטיח גישות אלה הוא pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT מותנה בהשלמת decoupling של רדיונוקלידים מ אימונוגלובולינים מזריק אותם בנפרד, ואז ומאפשר להם לשלב ויוו -רקמת המטרה. גישה זו רתמות המאפיינים פילוח גידול יוצא דופן של נוגדנים תוך עוקפת את החסרונות פרמוקוקינטיים שלהם, ובכך הפחתת קרינה במינון הלא-יעד רקמות והקלה על השימוש radionuclides עם מחצית החיים כי הם נחשב שימוש קצר מדי עבור radioimmunoconjugates המסורתי. במהלך חמש השנים האחרונות, המעבדה שלנו ואחרים פיתחו גישה ויוו pretargeting התגובה תגובת דילס-אלדר (IEDDA) דרישה אלקטרון הופכי בין טרנס- cyclooctene (TCO) tetrazine (ט ז). אסטרטגיה זו הוחלה בהצלחה pretargeted טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), פליטת פוטון בודד טומוגרפיה ממוחשבת (SPECT) הדמיה עם מגוון רחב של מערכות נוגדן-אנטיגן. עם זוג פרסומים אחרונים הראו את היעילות של מבוססי IEDDA PRIT מאתר דגמים של אדנוקרצינומה ductal הלבלב, סרטן המעי הגס. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים פרוטוקולים עבור PRIT באמצעות radioligand tetrazine Lu דוטה-עם התווית של 177(Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז), גרסה שונה-TCO של סרטן המעי הגס מיקוד נוגדן huA33 (huA33-TCO). ליתר דיוק, נתאר את בניית huA33-TCO, סינתזה, Lu-DOTA-יתד radiolabeling של [177Lu]7- ט ז, ואת הביצועים של ויוו biodistribution ומחקרים טיפול האורך במודלים מאתר של סרטן המעי הגס.

Introduction

Radioimmunotherapy (המדהימה) – השימוש של נוגדנים עבור מסירת radionuclides טיפולית גידולים — כבר זמן רב בגישה מפתה לטיפול בסרטן1,2. אכן, הבטחה זו יש כבר שרווחים על-ידי האישור של מינהל התרופות והמזון ארה של שני radioimmunoconjugates לטיפול לימפומה של מחלת הודג'קין: 90Y-ibritumomab tiuxetan, 131-tositumomab3 , 4. עדיין אפילו החל מראשית ימיה, הסיכויים קליני של אירית יש כבר הקשו על ידי סיבוך קריטי: המחירים מינון קרינה גבוהה רקמות בריאה5,6. באופן כללי, radioimmunoconjugates עבור המדהימה מסומנות עם חיים ארוכים radionuclides (למשל, 131אני [t½ = 8.0 ימים] 90Y [t½ = 2.7 ימים]) עם חצי-החיים הגשמיים זה משתלב היטב עם ארוכה פרמוקוקינטיים מחצית החיים של immunoglobulins. זה חיוני, שהיא מבטיחה שאת הרדיואקטיביות מספיק נשאר ברגע הנוגדן הגיעה biodistribution האופטימלי שלה לאחר מספר ימים של מחזור הדם. עם זאת, שילוב זה של מגורים רב פעמים בדם וב פיזי זמן מחצית החיים תוצאות באופן בלתי נמנע ההקרנות של רקמות בריאה, ובכך להפחית את יחסי טיפולית והגבלת את היעילות של טיפול7. מספר אסטרטגיות נחקרו כדי לעקוף בעיה זו, כולל השימוש של נוגדן שנחתכו קטעים כגון Fab, Fab', F(ab')2, minibodies ו- nanobodies8,9,10. אחד של המבטיח ומרתק, עדיין גישות מורכבות ללא ספק, אלטרנטיבית היא ויוו pretargeting11.

In vivo pretargeting היא גישה הדמיה גרעינית וטיפול המבקשת לרתום את הזיקה מעולה ואת סלקטיביות של נוגדנים תוך עוקפת את החסרונות פרמוקוקינטיים11,12,13. למטרה זו, הוא הנוגדן radiolabeled בשימוש מסורתי radioimmunotherapy לשעשוע שני רכיבים: radioligand מולקולה קטנה, של immunoconjugate ניתן לאגד הן אנטיגן הגידול ולא את radioligand הנ ל. Immunoconjugate מוזרק ראשון, בהתחשב 'התחלה', לעיתים מספר ימים, במהלכם הוא מצטבר ברקמות היעד, מנקה מהדם. לאחר מכן, radioligand מולקולה קטנה מנוהל, משלב immunoconjugate בבית הגידול או מנקה במהירות מהגוף. בעיקרו של דבר, אין ויוו pretargeting מסתמך על ביצוע radiochemistry בתוך הגוף עצמו. על-ידי הפחתת זרימת הדם הרדיואקטיביות, גישה זו בו זמנית מפחית את מינון הקרינה לרקמות בריא ומקל את השימוש radionuclides (למשל, 68Ga, t½ = 68 דקות211; כ, t½ = 7.2 h) עם מחצית החיים נחשבים בדרך כלל בקנה אחד עם נוגדן מבוססי וקטורים.

החל בסוף שנות השמונים, קומץ של גישות שונות ל ויוו pretargeting פותחו, כולל אסטרטגיות בהתבסס על bispecific נוגדנים, האינטראקציה בין streptavidin לבין ביוטין, והכלאה משלימים oligonucleotides14,15,16,17,18. עוד אחד מוחזקת בחזרה בדרגות מאת סיבוכים, immunogenicity חזק ביותר של נוגדנים streptavidin-לאחרונה19,20. במהלך חמש השנים האחרונות, הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו גישה ויוו pretargeting מבוסס על ראפיד, bioorthogonal אלקטרון הופכי דרישה תגובת דילס-אלדר מצדו בין טרנס- cyclooctene (TCO) tetrazine (ט ז) 21,22,23,24. המצליחה ביותר של אסטרטגיות אלו המועסקים של נוגדן TCO-לאחרונה, radioligand ט ז-מיסב, כמו TCO הוא בדרך כלל יותר יציב ויוו שלה צ' שותף (איור 1)25,26. כמו אחרים מתודולוגיות pretargeting, immunoconjugate mAb-TCO מנוהל קודם, זמן לנקות מהמחזור ולצבור ברקמת הגידול. לאחר מכן, radioligand ט ז מולקולה קטנה מוזרק, לאחר מכן הוא לוחץ עם immunoconjugate בתוך רקמת המטרה או מנקה במהירות מהגוף. זה ויוו pretargeting אסטרטגיה הוכיחה יעילים עבור חיית המחמד, SPECT הדמיה עם מספר נוגדנים שונים/אנטיגן מערכות באופן עקבי בהפקת תמונות עם ניגודיות גבוהה, ומאפשר שימוש radionuclides קצרת ימים כגון 18 F (t½ = 109 דקות) ו- 64Cu (t1/2 = 12.7 h)22,21,24. לאחרונה, היעילות של מבוסס-לחץ על radioimmunotherapy pretargeted (PRIT) הוכח במודלים מאתר של אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) ו קרצינומה של המעי הגס27,28. למטרה זו, רדיונוקלידים טיפולית 177Lu (βמקסימום = 498 קוו, t1/2 = יום 6.7) הועסק בשיתוף עם שני נוגדנים שונים: 5B1, אשר מטרות אנטיגן פחמימות 19.9 (CA19.9) ubiquitously לידי ביטוי PDAC , huA33, אשר מטרות A33, ביטוי גליקופרוטאין transmembrane > 95% ממקרי סרטן המעי הגס. בשני המקרים, גישה זו ל 177Lu-PRIT הניבו פעילות גבוהה ריכוזים ברקמת הגידול יצרו אפקט למינון הטיפולי, בו זמנית מופחת ריכוז פעילות ברקמות בריא לעומת המסורתי ישירות עם התווית radioimmunoconjugates.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים עבור PRIT באמצעות radioligand tetrazine Lu דוטה-עם התווית של 177(Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז), גרסה שונה-TCO של הנוגדן huA33 (huA33-TCO). ליתר דיוק, אנו מתארים את בניית huA33-TCO (איור 2), סינתזה, Lu-DOTA-יתד radiolabeling של [177Lu]7- צ' (איור 3 ו- 4 באיור), ואת הביצועים של vivo ב biodistribution, טיפול האורך מחקרים במודלים מאתר של סרטן המעי הגס. יתר על כן, נציג תוצאות, דיון, אנחנו להציג ערכת נתונים לדוגמה, כתובת אסטרטגיות אפשריות עבור אופטימיזציה של גישה זו, ולשקול את האסטרטגיה הזאת בהקשר רחב יותר של ויוו pretargeting ו- PRIT. לבסוף, חשוב לשים לב כי בעוד בחרנו להתמקד pretargeting באמצעות huA33-TCO [177Lu] Lu-DOTA-יתד7- Tz ב פרוטוקול זה, אסטרטגיה זו היא מאוד מודולרית, ניתן להתאים כדי להתאים מגוון רחב של נוגדנים, radionuclides.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ויוו הניסויים המתוארים בעבודה זו היו שבוצעה על פי פרוטוקולים שאושרו והוצא להורג תחת ההנחיות האתית של ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center, מרכז רפואי וייל קורנל, מכללת האנטר טיפול בבעלי חיים מוסדיים, שימוש ועדות (IACUC).

1. הכנת huA33-TCO

הערה: הסינתזה של huA33-TCO כבר שדווחה בעבר29. עם זאת, כדי להקל על הקורא, שכפולו כאן עם התאמות תנאים אופטימליים.

  1. צינור microcentrifuge 1.7 mL, להכין פתרון 125 μL של (E) - cyclooct - 4-enyl 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl קרבונט (TCO-NHS) ביבש דימתיל formamide (DMF)-ריכוז של 40 מ"ג/מ"ל (0.15 מ'). פתרון זה ניתן aliquoted קפוא ב- 80 ° C לשימוש בניסויים בעתיד.
  2. צינור microcentrifuge mL 1.7 נפרדים, להכין פתרון 5 מ"ג/מ"ל של huA33 ב 1 מ"ל תמיסת פוספט buffered (PBS; מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 137 מ מ נתרן כלורי, אשלגן פוספט 11.9 מ מ, pH 7.4).
  3. שימוש aliquots קטן (< 5 μL) של 0.1 M נה2CO3, להתאים את רמת החומציות של הפתרון נוגדן מ 1.2 שלב 8.8-9.0. להשתמש נייר pH או מד pH עם microelectrode צג ה-pH ופעילות גופנית טיפול ה-pH לא תחרוג 9.0.
  4. הפיתרון נוגדן המתוארים שלב 1.3, לאט להוסיף אמצעי אחסון המתאים 40 שן טוחנת מקבילות TCO-NHS ביחס לכמות הנוגדן. לדוגמה, אם 5 מ"ג (30 nmol) של huA33 נמצא הפתרון, להוסיף μL 9.0 (1.20 μmol) של הפתרון 40 מ"ג/מ"ל (0.15 מ') של TCO-NHS.
    הערה: TCO-NHS היא הידרופובי. בעת הוספת זה הפתרון של נוגדנים, הוסף אותו לאט ובזהירות, עצבנות למניעת משקעים. לא יעלה על 10% DMF ידי נפח הפתרון הסופי התגובה.
  5. לאפשר התגובה דגירה 25 ° c-thermomixer לשעה עם עצבנות קלה (500 סל ד).
  6. לאחר 1 h, לטהר את immunoconjugate huA33-עלות הבעלות הכוללת באמצעות עמודה desalting של הדרה מראש ארז גודל חד פעמיות.
    1. Equilibrate את גודל אי-הכללה של העמודה כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל מוצר קיים בעמודה במהלך האחסון. הליך טיפוסי כולל שטיפת העמודה 5 x עם נפח של PBS המתאים לנפח של העמודה: 5 x 2.5 מ של PBS.
    2. להוסיף את תערובת התגובה העמודה אי-הכללה של גודל וציין את עוצמת הקול של תערובת התגובה.
    3. לאחר תערובת התגובה נכנס העמודה, להוסיף כמות מספקת של PBS להביא את הנפח הכולל של פתרון להוסיף את העמודה עד 2.5 מ ל. לדוגמה, אם התגובה ההטיה, גרמו הנפח הכולל של 1.3 מ ל, להוסיף 1.2 מ של PBS נוספים על העמודה.
    4. לאסוף את המוצר באמצעות 2 מ של PBS כמו eluent.
      הערה: שלב זה תניב את המבנה הסופי huA33-TCO ב 2 מ"ל ל- PBS, pH 7.4.
  7. מודדים את ריכוז huA33-עלות הבעלות הכוללת באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis ניטור הגל 280 ננומטר. המקדם הכחדה טוחנת עבור רוב IgGs (חדוה280) הוא 210,000 מ-1ס מ-1.
  8. אם פתרון עם ריכוז גבוה של immunoconjugate רצוי, לרכז את הפתרון huA33-עלות הבעלות הכוללת באמצעות יחידת צנטריפוגלי מסנן עם ניתוק משקל מולקולרי 50,000 בעקבות הוראות יצרן.
    הערה: נוגדנים רבים ידועים צבירה או לזרז לריכוז. בעת ניסיון הליך זה עם נוגדן חדש, חוקרים צריכים לעכב בספרות או משלהם ניסיון בטיפול המדובר הנוגדן.
  9. אחסן את immunoconjugate huA33-TCO הושלמה ב 4 ° C בחושך אם הוא נחוץ באופן מיידי. אם הוא רוצה לשמש יותר מ-4 ימים בעתיד, לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס בחושך.
    הערה: זה מהווה נקודת עצירה מקובלת במסגרת ההליך. Immunoconjugate huA33 הושלמה-TCO צריך להיות יציב לאחסון לפחות 6 חודשים ב-80 מעלות צלזיוס בחושך.

2. הסינתזה של Tz-יתד7- NHBoc

  1. צינור microcentrifuge 1.7 mL, להמיס 5 מ"ג של tetrazine N- hydroxysuccinimidyl אסתר (ט ז-NHS; 12.6 μmol) ב- 0.15 מ של נטול מים דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
  2. צינור microcentrifuge mL 1.7 נפרדים, להמיס 8 מ ג של המוגנים מפחיד אמינו פג הפולימר גליקול O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol) ב- 0.15 מ של דימתיל סולפוקסיד נטול מים.
  3. הפיתרון של Tz-NHS, מוסיפים μL 3 (נמצא 21.3 μmol, המקבילים טוחנת 1.7) של triethylamine (תה) ומערבבים היטב.
  4. להוסיף את הפתרון tetrazine ורוד הפתרון2 NHBoc-יתד - NH7מתוך שלב 2.2, דגירה תערובת התגובה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם עצבנות קלה.
  5. לאחר 30 דקות, לדלל את התגובה 1:1 H2O ולטהר את התגובה באמצעות הפוך-שלב ג18 ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) כדי להפריד כל unreacted ט ז-NHS Tz-יתד7- NHBoc. השתמש ממיסים ללא חומצה כדי למנוע הסרה מוקדמת של מפחיד מגן על קבוצה. לפקח על שני ט ז-יתד7- NHBoc וט ז-NHS באורך-גל של 525 ננומטר.
    הערה: שמירה פעמים הם מאוד תלויים בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, אבובים, וכו '.), הפקדים המתאימים צריכה לפעול לפני טיהור. עם זאת, להציג דוגמה, אם שיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם ללא תוסף כלשהו) כדי 95:5 MeCN/H2O מעל 30 דקות, משמשים קצב זרימה של 1 מ"ל/min, ועמודה18אנליטי 4.6 מ מ x 250 מ ג , הזמנים השמירה של NHS-ט ז, ט ז-יתד7- NHBoc הם סביב 16 min ו- 18 דקות, בהתאמה.
  6. להקפיא את eluent HPLC שנאספו באמצעות חנקן נוזלי, לעטוף את הצינור אוסף עתה מוקפאים בנייר אלומיניום. המקום הצינור אוסף קפוא על איזה שהוא לופילייזר לילה כדי להסיר שלב ניידים HPLC. המוצר יהיה מוצק ורוד בהיר אופייני.
    הערה: אם חנקן נוזלי אינה זמינה, להקפיא את eluent HPLC שנאספו בתוך קרח יבש או לילה במקפיא-80 ° C.

3. הסינתזה של Tz-יתד7-NH2

  1. למוצר של שלב 2.6, ט ז-יתד7- NHBoc, להוסיף 1.5 מיליליטר דיכלורומתאן (DCM) ולהעביר פתרון זה בקבוקון קטן עגול-התחתון.
  2. להוסיף 0.25 mL של חומצה trifluoroacetic (TFA) dropwise הפתרון ורוד מ 3.1 שלב.
  3. לאפשר התגובה תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT עם עצבנות קלה.
  4. לאחר 30 דקות, להתנדף הממס דרך אידוי רוטרי. אל תחרוג אמבט מים לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. לשקם את המוצר צמיגה ורוד 0.5 מ ל מים.
  6. לטהר את המוצר באמצעות הפוך-שלב ג18 HPLC להפריד Tz-יתד7-NH2 למבשר מוגן מפחיד. לפקח על שני ט ז-יתד7- NHBoc וט ז-יתד7-NH2 באורך-גל של 525 ננומטר.
    הערה: שמירה פעמים הם מאוד תלויים בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, אבובים, וכו '.), הפקדים המתאימים צריכה לפעול לפני טיהור. עם זאת, להציג דוגמה, אם שיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם עם 0.1% TFA) כדי 95:5 MeCN/H2O מעל 30 דקות, משמשים קצב זרימה של 1 מ"ל/min, ועמודה18אנליטי 4.6 מ מ x 250 מ ג , הזמנים השמירה של Tz-יתד7- NHBoc וט ז-יתד7-NH2 הם בסביבות 18 min ו- 13 דקות, בהתאמה.
  7. להקפיא את eluent HPLC שנאספו באמצעות חנקן נוזלי, לעטוף את הצינור אוסף עתה מוקפאים בנייר אלומיניום. המקום הצינור אוסף קפוא על איזה שהוא לופילייזר לילה כדי להסיר שלב ניידים HPLC. המוצר יהיה מוצק ורוד בהיר.
  8. לשקם המוצר כבר שלב 3.7, ט ז-יתד7-NH2, עם 150 μL של דימתיל סולפוקסיד, העברת צינור microcentrifuge 1.7 מ.
  9. מודדים את ריכוז Tz-יתד7-NH2 באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis ניטור הגל nm 525. המקדם הכחדה טוחנת Tz-יתד7-NH2 (חדוה525) הוא 535 מ-1ס מ-1.

4. הסינתזה של Tz-יתד7- דוטה

  1. להמיס Tz-יתד7-NH2 (4.5 מ"ג, 6.9 μmol) ב- 0.15 מ של דימתיל סולפוקסיד (או פשוט להמשיך עם הפתרון שנוצרו בשלב 3.8).
  2. להוסיף 22 טוחנת במקבילות של תה (21 μL, 0.15 mmol) לתמיסה המכילה tetrazine שלב 4.1.
  3. להוסיף 10 מ ג (14.2 μmol) של p- SCN-בסון-DOTA מוצק ו מערבולת הפתרון למשך כ- 2 דקות, או עד התפרקה לחלוטין החומר.
  4. לאפשר התגובה תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT עם עצבנות קלה.
  5. לאחר 30 דקות, לדלל את התגובה 1:1 H2O ולטהר את המוצר באמצעות הפוך-שלב ג18 HPLC להסיר את unreacted p- SCN-בסון-דוטה. ניתן לנטר את p- SCN-בסון-DOTA באורך-גל של 254 ננומטר, תוך Tz-יתד7- DOTA מנוטר בצורה הטובה ביותר על אורך גל של 525 ננומטר.
    הערה: שמירה פעמים הם מאוד תלויים בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, אבובים, וכו '.), הפקדים המתאימים צריכה לפעול לפני טיהור. עם זאת, להציג דוגמה, אם שיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם עם 0.1% TFA) כדי 95:5 MeCN/H משמשים2O מעל 30 דקות ועמודה18אנליטי 4.6 x 250 מ מ ג, ט ז-יתד7- דוטה, p-SCN-בסון-DOTA יש פעמים השמירה של בסביבות 15.6 min ו- 16.1 מין, בהתאמה.
  6. להקפיא את eluent HPLC שנאספו באמצעות חנקן נוזלי, לעטוף את הצינור אוסף עתה מוקפאים בנייר אלומיניום. המקום הצינור אוסף קפוא על איזה שהוא לופילייזר לילה כדי להסיר שלב ניידים HPLC. המוצר יהיה אבקה ורוד בהיר.
  7. לשקם את המוצר ב- 0.15 מ של דימתיל סולפוקסיד ומדידת הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis ניטור הגל nm 525. המקדם הכחדה טוחנת Tz-יתד7- DOTA (חדוה525) הוא 535 מ-1ס מ-1.
  8. לנתח את המתחם הסופי על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR), ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS) כדי לוודא סינתזה הזה היה מוצלח. ראה טבלה 1 עבור משמרות כימית נחוש השפעול ומשקולות מולקולרית של כל תרכובות שנדונו בעבודה זו.
  9. חנות הפתרון - DOTA7ט ז-יתד מטוהרים בחושך ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: זה מהווה נקודת עצירה מקובלת במסגרת ההליך. Tz-יתד שהושלמו7- DOTA למבשר יציב לפחות 1 שנה בתנאים אלה.

5. 177Lu Radiolabeling של Tz-יתד7- דוטה

התראה: שלב זה של הפרוטוקול כרוך את הטיפול מניפולציה לרדיואקטיביות. לפני ביצוע שלבים אלה — או ביצוע כל עבודה אחרת עם רדיואקטיביות — חוקרים כדאי להתייעץ עם מחלקת בטיחות קרינה של המוסד בבית שלהם. לקחת את כל הצעדים האפשריים כדי למזער את החשיפה לקרינה מייננת.

הערה: בעת עבודה עם כמויות קטנות של radiometals מומלץ כי כל מאגרי להשתחרר מן במתכות כדי למנוע הפרעה באיגוד באתר תיאום.

  1. בשפופרת צנטרפוגה 1.7 mL, להוסיף μL 200 מ' 0.25 אמוניום אצטט מאגר מותאם עם aliquots של 1 מ' ב- HCl pH 5.5.
    הערה: אם אתה משתמש MBq 370 פחות פעילות לצורך תיוג, היקף המאגר משמש צריך לצמצם 100 µL.
  2. להוסיף את הכמות הרצויה של LuCl [177Lu]3 בופר. הסכום הוסיף יהיו תלויים על מספר נושאים את הניסוי ואת המנות רדיואקטיבי המנוהל. מומלץ כי 1-2 מנות נוספות שווה של רדיואקטיביות, ניתן להוסיף אמצעי זהירות כדי לפצות על אובדן פוטנציאלי של רדיואקטיביות במהלך שלבי טיהור.
  3. להוסיף Tz-יתד7- דוטה, דימתיל סולפוקסיד לתערובת רדיואקטיבי ב- 5.2 שלב. כמות צ'-יתד7- DOTA תלויה מספר נושאים הנבדקת. ביתר פירוט בנושא זה ניתן למצוא בשלב 6.2.2.2.
  4. לאפשר את הפתרון דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. ודא ש-radiolabeling הושלמה באמצעות רדיו כרומטוגרפיה מיידית שכבה דקה (רדיו-iTLC) עם 50 מ"מ EDTA, pH 5.5 בתור שלב ניידים. שכותרתו Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- Tz יישאר על הבסיס – Rf = 0 — בזמן חופשי [177Lu] Lu3 + יותאם על ידי EDTA, יעברו עם חזית הממס, Rf = 1.0 (איור 3B).
  6. אם לא מושגת תיוג כמותית, להוסיף ליגנד נוסף כדי לתאם את radiometal ללא תשלום. לחלופין, לטהר את שכותרתו Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- צ' באמצעות מחסנית18 C. בצע את הוראות היצרן לשימוש. הליך הדגימה היא כדלקמן.
    1. ראש הדיו על ידי לאט עובר דרך 5 מ"ל אתנול דרך הדיו עם מזרק גדול. לאחר מכן, עוברים 5 מ של acetonitrile, ולאחר מכן 5 מ של יונים (DI) H2O.
    2. לצייר את הפתרון radioligand מ 5.3 שלב מזרק קטן יותר, תזריק את זה לאט לתוך הדיו18 C. לאחר מכן, לשטוף המחסנית עם 10 מ"ל של DI H2O להסיר כל לא מאוגדים [177Lu] LuCl3.
    3. Elute עם µL 500 של אתנול. הסר כל אתנול המוצר הסופי על ידי שהעביר את הכלי עם קצב זרימה נמוכה של חנקן יבש או ארגון למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, resuspend את radioligand בתוך תמיסת מלח באמצעי אחסון שנקבע בשלב 6.2.2.2.

6. מחקרים in vivo

התראה: כמו בסעיף 5, שלב זה של הפרוטוקול כרוך את הטיפול מניפולציה לרדיואקטיביות. לפני ביצוע שלבים אלה, חוקרים כדאי להתייעץ עם מחלקת בטיחות קרינה של המוסד בבית שלהם. לקחת את כל הצעדים האפשריים כדי למזער את החשיפה לקרינה מייננת.

  1. הכנת חיות
    1. בעכברים עירום נשי athymic, subcutaneously שתל 5 x 106 SW1222 סרטן המעי הגס תאים הושעו ב 150 μL של תערובת 1:1 של תא מדיה מטריקס (למשל., Matrigel) ולאפשר אלה לגדול לתוך xenograft3 100-150 מ"מ (14-18 ימים לאחר חיסון).
    2. מיון בעלי חיים לצורך ניסוי biodistribution
      1. לאחר הגידולים בגודל מתאים כפי שנקבע על ידי מדידה caliper, למיין את בעלי החיים כדי להבטיח שכל קוהורטה מכילה כ האחסון הגידול הממוצע באותו. בעלי החיים ניתן מכובד בכלוב כל על ידי סימונים על הזנב עם דיו בלתי מחיק (להקת אחת, שתי להקות, וכו ').
    3. מיון בעלי חיים לצורך מחקר טיפול האורך
      1. לאחר הגידולים בגודל מתאים כפי שנקבע על ידי מדידה caliper, לצרף תגיות אוזן לכל אחד מבעלי החיים כדי להבטיח מעקב נכונה לאורך כל הניסוי.
        הערה: מספרי האוזן תגיות עשויים ליפול במהלך הניסוי. כתוצאה מכך, מומלץ ללוות תגים אלה פיזי עם חריצים האוזן בצורה שיטתית (כלומר-, נכון, שמאל, דו-צדדי, נכון x 2, שמאל x 2).
      2. מיון בעלי החיים כך האחסון הגידול הממוצע במדגם כל אחד שווה בערך. השיטה הבאה לצורך מיון בעלי חיים יכול להתבצע באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
        1. רשימה של מספרי זיהוי בעלי חיים אוזן חריץ דפוס, נפח הגידול שלוש עמודות נפרדות.
        2. למיין את הנתונים מן הקטן ביותר לאמצעי הגידול הגדול ביותר.
        3. בעמודה הרביעית, להקצות כל חיה של הכלוב ומספר במחזוריות הכלובים בדפוס לסנטרי. לדוגמה, אם קיימים כלובים 5, עמודה זו יהיה מלא "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." עד כל החיות מוקצים כלוב.
        4. ברגע הכלובים מוקצים, למיין את הנתונים לפי מספר הכלוב. אם האוזן חריצים משמשות, ודא כי כל חיה בתוך כלוב נתון יש דפוס חריץ האוזן ייחודי. אם ישנן כפילויות (שתיים או יותר של אותו דפוס) בתוך כלוב נתון, עכבר אחד להחליף עם אחד מהכלוב אחר עם התבנית החסרים עד בכל כלוב יש חיות עם דפוסי חריץ האוזן ייחודי.
  2. ניסוחים וזריקות
    הערה: הרצף של הזרקת למחקר גם biodistribution וגם טיפול מתקדם כדלקמן: huA33-TCO מוזרק ראשון, ואחריו Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז לאחר פרק זמן שנקבע מראש.
    1. Immunoconjugate
      1. לדלל עם aliquot של הפתרון huA33-TCO של שלב 1.9 ריכוז של 0.8 מ"ג/מ"ל ב- 0.9% מלח סטרילית.
      2. לצייר במינון של 150 µL (100 µg) של huA33-TCO פתרון במזרקים pretreated עם 1% אלבומין שור (BSA) ב- PBS ולאחסן אלה מזרקים על קרח.
        הערה: BSA טיפול מפחית הכריכה לא ספציפית של הנוגדן לקירות של המזרק.
      3. חממו את החיות תחת מנורת חימום במשך 3 דקות להתרחב את הווריד הזנב.
      4. להזריק את הפתרון huA33-TCO לתוך וריד הזנב xenograft מניבי העכבר. לאפשר 24 שעות (או מרווח זמן שנקבע מראש שונים) huA33-TCO לצבור הגידול של העכבר.
    2. Radioligand
      1. Radiolabel ט ז-יתד7- DOTA כפי שמתואר בסעיף 5.
      2. לצייר מנות ב- 150 μL של 0.9% סטרילי מלוחים המכילים 1.1 טוחנת מקבילות Tz-יתד7- DOTA ביחס לכמות huA33-TCO מנוהל. לדוגמה, אם μg 100 (0.67 nmol) של huA33-TCO היה מוזרק החיה ואת התערובת התגובה [177Lu] ט ז -7Lu-DOTA-יתד נעשתה עם פעילות ספציפית של 12.4 GBq/μmol, ואז מינונים יצוייר המכיל 9.14 MBq של כל פעילות. זה מקביל nmol 0.74 של צ' (1.1 הציוד טוחנת יחסית huA33-TCO).
      3. חממו את החיות תחת מנורת חימום למשך 3 דקות להתרחב את הווריד הזנב.
      4. להזריק את המינון של radioligand לתוך וריד הזנב xenograft מניבי העכבר. כמות הפעילות כדי להיות מוזרק נקבעת על-ידי החוקר. נתונים שפורסמו הראו השפעות טיפוליות למינון על גודל הגידול בטווח של 7.4-55.5 MBq.
  3. Biodistribution
    1. בנקודת הזמן הרצויים לאחר הממשל של radioligand, המתת חסד כל קוהורטה של עכברים באמצעות 2% O2 / 6% CO2 גז תערובת.
      הערה: בצע את כל דרישות המוסדיים לגבי שיטות המתת חסד פיזית משני (למשל, נקע בצוואר הרחם).
    2. עבור כל חיה, להסיר את כל האיברים עניין וקינ באמבט מים כדי להסיר את עודף דם, ומניחים אותן על מגבת נייר באוויר הפתוח 5 דק מדגם איבר ברשימה סדר המוצע: דם, גידול, לב, ריאות, כבד, טחול, קיבה, המעי הדק , המעי הגס, הכליות, שריר, עצם, עור, הזנב.
    3. ברגע מספיק מיובש, מקום האיברים צינורות תרבות חד פעמיות שנשקל מראש. שוקלים הצינורות מלא עכשיו שוב להשיג את המסה של כל איבר או רקמה.
    4. מודדים את הפעילות בכל הצינורות באמצעות מונה גמא. כיילו את הפעילות נמדד הדלפק גמא את הגלאי למדידת המינון מצוירות. סופרים סטנדרטים רדיואקטיבי של 177Lu בכל מכשיר, יקבע מקדם כיול עבור interconversion בין פעילות ספירות-לפי-דקה (cpm).
    5. להתוות את הנתונים biodistribution כמו גרף עמודות (ראה איור 5) עם הממוצע מנורמל ספיגת עבור כל איבר ואיבר יוצגו יחד עם בר ציון סטיית תקן אחת. הבדלים סטטיסטיים ספיגת בין קבוצות המדגם עשוי להיות מוערך על ידי אינטראקצית-t-test, בו משמעות מושגת כאשר p < 0.05.
  4. טיפול ניטור
    1. באמצעות מחוגה, למדוד את הצד הארוך של הגידול מלבני (אורך) כמו גם הרוחב, הניצב האורך. חישוב נפח באמצעות הנוסחה לחישוב הנפח של אליפסואיד: πL· (4/3) W· . ה', אשר מפשט את ½L· W2, בהנחה הגובה הוא כ שווה לרוחב.
      הערה: זה גם ניתן להשתמש גידול כף יד מכשיר למדידת אם אחד זמין (ראה טבלה של חומרים).
    2. שוקלים כל עכבר על איזון כדי לעקוב אחר לעליה במשקל או ירידה במשקל לאורך זמן.
    3. חשוב לפקח על המראה החיצוני של כל בעל חיים סימנים של מצוקה, כגון שפופות בחזרה או קרע בכלי דם עורית (אשר עשוי להצביע על haematotoxicity).
      הערה: מדידות הגידול צריך לאסוף כל 1-2 ימים במהלך המחקר טיפול האורך.
    4. נתוני ההתוויה מהטיפול האורך מחקר כמו ממוצע הגידול כרכים לאורך זמן ואני לנרמל מתחיל נפח הגידול, אם רצונך בכך. סטטיסטית ההבדלים ספיגת באותו יום בין קבוצות המדגם עשוי להיות מוערך על ידי אינטראקצית-t-test, בו מושגת משמעות כאשר P < 0.05. ניתוחים סטטיסטיים מקיפה יותר ניתן, צריך להתבצע כפי שהומלץ על ידי biostatistician מיומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבניין של TCO כדי huA33 מותנה בהשלמת של צימוד בין עלות הבעלות הכוללת אמין-תגובתי-בקופת חולים משקעי ליזין על פני השטח של אימונוגלובולינים. שיטה זו לשחזור ועמיד מאוד, אמינה התשואות של מעלות-של-תיוג של 2-4 TCO/mAb. במקרה זה, הועסק ספקטרומטר מסה MALDI-תוף כדי לאשר מידה מסוימת של תיוג של עלות הבעלות הכוללת כ 4.0/mAb; ערך דומה הושג באמצעות tetrazine של fluorophore-השתנה כמו כתב24. הסינתזה של ליגנד tetrazine מתבצעת בשלושה שלבים: (1) צימוד של Tz-NHS ל מונו-מפחיד-מוגן ' פג מקשר (2) deprotection של זה ביניים התשואה Tz-יתד7-NH2, ו- (3) היווצרות thiourea חיבור אמיתי בין p- SCN-בסון-DOTA וט ז-יתד7-NH2. הליך זה הוא יחסית נתיישב, ונותנת לו ט ז-יתד7- DOTA ב התשואה הכוללת של ~ 75%. כל אחד intermediates התאפיין HRMS ו- 1H-NMR; הנתונים מוצגים בטבלה1.

עוברים radiolabeling, 177Lu3 + בדרך כלל מתקבל מספקים מסחריים כמו כלוריד מלח [177Lu] LuCl3 ב 0.5 M HCl. Radiolabeling של Tz-יתד7- DOTA עם 177Lu להניב את Lu-DOTA-יתד radioligand [177Lu]7- צ' היא פשוטה מאוד: רק 20 דקות, התגובה היא מלאה, לייצר את המוצר הרצוי > 99% רדיוכימי טוהר כפי שנקבע על ידי רדיו-iTLC. בדרך כלל, אין טיהור נוסף הכרחי לפני ניסוח. סקר של הספרות על מבוססת על ט ז/TCO pretargeting עולה כי יחס טוחנת Tz:mAb של ~ 1:1 מייצרת את הטוב ויוו נתונים10. כתוצאה מכך, זה לא חיוני כדי להשיג את radioligand בפעילות טוחנת אפשרי הגבוהה ביותר. לדוגמה, ניסויים biodistribution שנדונו כאן Lu-DOTA-יתד להעסיק [177Lu]7- ט ז עם פעילות טוחנת של GBq ~ 12/µmol. ללימודי טיפול האורך, לעומת זאת, Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז עם פעילות טוחנת גבוה יותר היה כדי להקל את הניהול של מנות גדולות יותר של קרינה רדיואקטיבית מבלי לשנות את מספר שומות מוזרק tetrazine.

כמו יטופלו יותר בדיון, biodistribution הניסויים הם ערך עליון הבנה ומיטוב של כל גישה PRIT. במקרה זה, biodistribution הניסויים נערכו כדי לקבוע את זמן מרווח זמן אופטימלי בין הממשל של immunoconjugate ההזרקה של radioligand. לשם כך, אנחנו מועסקים athymic עכברים עירום הנושאת A33 תת עורית לבטא אנטיגן xenografts SW1222 על הכתף הימנית שלהם. בעלי חיים אלה קיבלו 100 µg (0.67 nmol) של huA33-TCO, 24, 48, 72 או 120 h לפני הזריקה של Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- צ' (9.14 MBq, 0.74 nmol). איור 5 מראה כי כל הזרקה מרווחי לייצר פעילות גבוהה ריכוזים בתוך רקמת הגידול, כמו גם ריכוז פעילות נמוכה באיברים בריאים. המרווח הזרקת 24 שעות מעניקה את ספיגת tumoral הגבוהה ביותר ב 120 h שלאחר הזרקת: 21.2 ± 2.9%ID/g. כל קבוצה של תנאים מייצרת גם יחסי ריכוז פעילות גידול-כדי-איבר מרשים. Pretargeting עם מרווח 24 שעות ביממה, למשל, התשואות יחסי גודל הגידול-כדי-דם, גידול-כדי-הכבד, הגידול-כדי-שריר של 20 ± 5, 37 ± 7, 184 ± 30, בהתאמה, 120 h לאחר הממשל של radioligand. על סמך ממצאים אלה, מרווח 24 שעות נבחרה לצורך המחקר טיפול האורך הבאים (ראה להלן).

לחקר ויוו טיפול האורך, גדודים (n = 10) של עכברים עירום athymic הנושאת תת עורית SW1222 xenografts על האגף הימני שלהם היו huA33 מנוהל-TCO (100 ug, 0.67 nmol) 24 שעות לפני הזרקת [177Lu] Lu-DOTA-יתד 7- ט ז. שלושה גדודים ניסיוני שונים היו מועסקים, קבלה 18.7, 37, או MBq 55.5 של Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז (המתאימים לפעילות טוחנת של 24, 45 ו- GBq 70/µmol). בנוסף, שני גדודים הבקרה קיבלו חצי של משטר PRIT: גם huA33-TCO (100 ug, 0.67 nmol) ללא [177Lu] Lu-DOTA-יתד7- צ' או [177Lu] Lu-DOTA-יתד7- ט ז (55.5 MBq, 0.74 nmol) ללא huA33-TCO. אלו הן בקרות חיוני כדי להבטיח כי התגובה הטיפולית לא שהפיק ' immunoconjugate ' או ' radioligand לבד. אמצעי האחסון של הגידולים נמדדו כל 3 ימים עבור שלושת השבועות הראשונים של המחקר, אז פעם בשבוע עד לסיכום הניסוי (70 יום, 10 מחצית החיים של 177Lu). כפי שניתן לראות באיור 6, ישנו הבדל סטארק בתגובתו של גדודים ניסיוני לעומת קבוצות שליטה. בעוד הגידולים בעכברים שקיבלו רק מרכיב אחד של האסטרטגיה PRIT ממשיכים לגדול לא מסומן, הגידולים של העכברים שקיבלו את משטר PRIT מלא מפסיקים לגדול ולכווץ בסופו של דבר על אמצעי אחסון מתחת אלה נמדדו בתחילת המחקר. חשוב, ללא תופעות לוואי רעילים נצפו, ומתוחזק כל בעלי משקל בתוך 20% מסת הראשונית (איור 7 א). מגרש קפלן-מאייר הנתונים מספק של ויזואליזציה אפילו יותר מרשים של המחקר: בעוד עכברים כל בתוך גדודים שליטה היה צורך להרדימם בתוך כמה שבועות, העכברים של גדודים ניסיוני היה רקורד מושלם של הישרדות בסוף (החקירה איור 7 ב).

Figure 1
איור 1: קריקטורה סכמטית pretargeted radioimmunotherapy בהתבסס על התגובה דרישה תגובת דילס-אלדר האלקטרון הפוך. דמות זו שונתה מהפניית #28. הודפס מחדש (מותאם) באישור Membreno, רבי, קוק, נולד ב. א, פונג, ק', לואיס, י. ס, & Zeglis, נולד ב- מ Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy של המעי הגס קרצינומה. רוקחות מולקולרית. 15 (4), 1729-1734 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סכימטי של הבנייה של huA33-TCO. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: סכימטי של הסינתזה של Tz-יתד7- דוטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: (א) סכמטית radiolabeling של Lu-DOTA-יתד [ 177Lu]7- ט ז; (ב) רדיו-iTLC נציג chromatogram הממחיש > טוהר רדיוכימי 98% Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Biodistribution של ויוו pretargeting עם huA33-TCO, [177Lu] פג - DOTA -7- Tz בעכברים עירום athymic הנושאת תת עורית SW1222 סרטן המעי הגס האנושי גידולים באמצעות pretargeting במרווחי זמן של 48 (סגול), 24 (ירוק) , 72 (כתום), או 120 שעות (כחול). נתונים עם תקן שגיאות של גדודים של n = 4; ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי מבחן t של סטודנט אינטראקצית, * *p < 0.01. דמות זו שונתה מהפניית #28. הודפס מחדש (מותאם) באישור Membreno, רבי, קוק, נולד ב. א, פונג, ק', לואיס, י. ס, & Zeglis, נולד ב- מ Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy של המעי הגס קרצינומה. רוקחות מולקולרית. 15 (4), 1729-1734 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: לימוד טיפול האורך של 5 קבוצות של עכברים (n = 10) גידולים SW1222 תת עורית מיסב מתואר בהיקף הגידול הממוצע כפונקציה של הזמן (א); נפח הגידול מנורמל לנפח ההתחלתי כפונקציה של הזמן (ב). הקבוצות שליטה קיבל את immunoconjugate בלי radioligand (כחול) או את radioligand בלי immunoconjugate (אדום). הטיפול שלוש קבוצות קיבלו huA33-TCO (100 µg, 0.6 nmol) ואחריו 24 שעות מאוחר יותר 18.5 (ירוק), 37.0 (סגול) או MBq (כתום) 55.5 (~0.8 nmol בכל מקרה) של [177Lu] פג - DOTA -7- ט ז. יומן-דרגה (האח-קוקס) מבחן, הישרדות היה משמעותי (p < 0.0001) עבור כל קבוצות הטיפול. דמות זו שונתה מהפניית #28. הודפס מחדש (מותאם) באישור Membreno, רבי, קוק, נולד ב. א, פונג, ק', לואיס, י. ס, & Zeglis, נולד ב- מ Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy של המעי הגס קרצינומה. רוקחות מולקולרית. 15 (4), 1729-1734 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: משקל עקומות לבעלי במהלך המחקר טיפול האורך של 5 קבוצות של עכברים (n = 10) עקומת הישרדות קפלן-מאייר המתאימים הנושאת תת עורית SW1222 גידולים (א); (ב). הקבוצות שליטה קיבל את immunoconjugate בלי radioligand (כחול) או את radioligand בלי immunoconjugate (אדום). הטיפול שלוש קבוצות קיבלו huA33-TCO (100 µg, 0.6 nmol) ואחריו 24 שעות מאוחר יותר 18.5 (ירוק), 37.0 (סגול) או MBq (כתום) 55.5 (~0.8 nmol בכל מקרה) של [177Lu] פג - DOTA -7- ט ז. דמות זו שונתה מהפניית #28. הודפס מחדש (מותאם) באישור Membreno, רבי, קוק, נולד ב. א, פונג, ק', לואיס, י. ס, & Zeglis, נולד ב- מ Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy של המעי הגס קרצינומה. רוקחות מולקולרית. 15 (4), 1729-1734 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תרכובת 1 H-NMR משמרות HRMS (ESI)
500 MHz, דימתיל סולפוקסיד
ט ז-יתד7- NHBoc 10.52 (s, 1H), 8.50 (מ', 3H), 7.82 (t, 1H), 7.46 (ד, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (ד, 2H), 3.42 (ז, ח 22), 3.33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2.99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.70 (q, 2H), 1.29 (s ח 9) ז/ז calcd. עבור C35H57N7או11נה: 774.4005; נמצאו: 774.4014.
ט ז-יתד7-NH2 10.58 (s, 1H) 8.46 (מ', 2H), 7.87 (t, 1H), 7.75 (ד, 2H), 7.52 (יח, 1H), 4.40 (ד, 2H), 3.60-3.50 (ז, ח 26), 3.40 (t, 2H), 3:32 אם כן (bs, 2H), 3.20 (q, 2H), 2.99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.79 (q, 2H). ז/ז calcd. C30H50N7או9: 652.3670; נמצאו: 652.3676.
ט ז-יתד7- דוטה 10.57 (s, 1H), 9.63 (bs, 1H), 8.45 (מ', 3H), 7.86 (ז, ח 1), 7.73 (bs, 1H), 7.54 (ד, 2H), 7.41 (מ', 2H), 7.19 (מ', 2H), 6.54 (bs, 1H), 4.40 (ד, 2H), 4.00-3.20 (ז, ח 55), 3.20 (q, 4 שעות), 2.54 (s, 1H), 2.18 (t, 3H), 2.10 (t, 3H), 1.76 (q 2 H). ז/ז calcd. C50H76N11או15s: 1202.56; נמצאו: 1203.5741.

טבלה 1- אפיון נתוני עבור תרכובות אורגניות שמתואר פרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחד היתרונות של גישה זו כדי ויוו pretargeting — במיוחד בקשר אסטרטגיות שהתבססו על נוגדנים bispecific, radiolabeled haptens — הוא המודולריות שלו: טרנס- cyclooctene moieties ניתן לצרף את כל נוגדן, tetrazine radioligands יכול להיות radiolabeled עם מגוון יוצא דופן של radionuclides בלי ופוגע ביכולתם להגיב עם שותפיהם לחץ. עדיין העיבוד של גישה זו למערכת נוגדן/אנטיגן אחרים אינה פשוטה כמו שכפול הפרוטוקול המתואר כאן. כמובן, כל ניסיון ליצור immunoconjugate mAb-TCO חדש או של radioligand tetrazine מניבי הרומן צריכה להיות מלווה את מבחני אפיון כימי וביולוגי מתאים, כולל בדיקות יציבות תגובתיות. אבל מעבר לכך, ישנם שני משתנים חשובים במיוחד לחקור ולמטב את: (1) המסה של immunoconjugate mAb-TCO מנוהל ו- (2) של מרווח הזמן בין ההזרקה של mAb-TCO הממשל של radioligand. שני גורמים יכולים להשפיע באופן דרמטי ויוו ההתנהגות של מערכת pretargeting. לדוגמה, השימוש של מינונים גבוהים מדי של immunoconjugate או מרווח תקופות קצרות מדי עלולה לגרום בריכוזים פעילות לא רצויות גבוהה בדם עקב לחץ על תגובות בין radioligand לבין immunoconjugate שנותרו במחזור. לעומת זאת, העסקת המוני immunoconjugate כי הם נמוכים מדי או תקופות מרווח ארוך יכול ללא צורך להפחית פעילות ריכוזים בתוך הגידול בשל כשל עיתוני אנטיגן או את isomerization הנחרץ (אם כי איטי) של טרנס - cyclooctene כדי לא פעיל cis- cyclooctene. לאורך שורות אלה, ביצוע ניסויים biodistribution באמצעות מגוון של המוני immunoconjugate ומרווחי pretargeting יכול להיות מועיל בצורה יוצאת דופן. כמובן, מומלץ גם כך הפקדים המתאימים לפעול במשולב עם כל הניסויים ויוו . אלה כוללים — אך אינם מוגבלים – ניסויים ובו שורות תאים אנטיגן-שלילי, חסימת גדודים המקבלים עודף עצום של נוגדן unconjugated, הממשל של radioligand לבד, ההזרקה של radioligand בעקבות TCO- חסר immunoconjugate, וויוו pretargeting באמצעות a שאינם ספציפיים, isotype שליטה TCO מניבי immunoconjugate.

לחלופין, ניתן להשתמש ניסויים הדמיה עבור מיטוב אם רדיונוקלידים טיפולית פולט פוזיטרונים או פוטונים 'הניתן להדפסה' או אם איזוטופולוג 'הניתן להדפסה' של רדיונוקלידים טיפולית זמינה. בסופו של דבר, יש לבחור ערכות של משתני המספקים את האיזון הטוב ביותר של ריכוזים גבוהים פעילות tumoral, יחסי ריכוז פעילות גידול-על-רקע גבוה ללימודי טיפול האורך עוקבות. במקרה המוצג כאן, 100 µg של huA33-TCO הוזרק עם מרווח של חישובים קרינה ה 24 – במיוחד אלה המאפשרים החישוב של הגידול מינונים ושל יחסי טיפולית — גם יכול להיות מועיל במהלך התהליך של אופטימיזציה.

חשוב לציין כי אפילו מבטיח [177Lu] Lu-DOTA-יתד7- ט ז/huA33-TCO המערכת אשר פותחה יכול להפיק תועלת מיטוב נוספות. השוואה בין נתוני קרינה בגישה זו כדי PRIT אירית מסורתית עם התווית על-ידי Lu 177וריאציה של huA33 מגלה כי המינון הגידול של PRIT נמצא מתחת לזה של מסורתי RIT. יתר על כן, המינון יעיל של מערכת PRIT (0.054 mSv/MBq) הוא רק מעט נמוך יותר מזה של אירית מסורתית (0.068 mSv/MBq).

שתי תרופות לנושאים הללו כרגע להיות נידונות. ראשית, לפיגום דנדריטים פותחה מסוגל להגדיל את מספר TCOs למספרי כל נוגדן30. בהקשר של דימות PET pretargeted, גישה זו באופן דרמטי מגביר ריכוז פעילות tumoral, ואת הניסויים מקבילה עם Lu-DOTA-יתד [177Lu]7- ט ז נמצאות בעיצומן. שנית, השימוש של סוכנים tetrazine מניבי סליקה עשויה להועיל בהקשר של PRIT. הממשל של סוכני לפני ההזרקה של radioligand נוצלה במגוון pretargeting מתודולוגיות כדרך לצמצם את הריכוז של משקעי immunoconjugate בדם, וכך להפחית פעילות ריכוזים ב לאיברים בריאים23,31. השימוש של סוכני הוא לא בלי החסרונות, אבל; הבולטות אשר היא הגדלת את המורכבות מודאליות טיפולית אמנם כבר מסובך. למרות זאת, חוקרים ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center שפורסם לאחרונה דו ח משכנעת על יצירת לתוספי התווית על-ידי צ' ניקוי סוכן עבור pretargeted מחמד הדמיה, נתונים על השימוש של המבנה הזה, בשילוב עם [177Lu] Lu-DOTA-יתד7ט ז - ו huA33-TCO הם הקרובה32. גישה אחרת כדי למקסם את היתרונות דוזומטריות של PRIT הוא השימוש של radionuclides עם קצר יותר פיזית מחצית החיים. זה הוכח כיעיל מאוד עבור הדמיה; עם זאת, radionuclides טיפולית עם קצר פיזית מחצית החיים הם מועטים מאוד.

לבסוף, אנו יהיה אדיש שנכשלנו בו כראוי להתמודד עם המגבלות מהותי של pretargeting התגובה דרישה תגובת דילס-אלדר אלקטרון ההופכי. הראשון של בעיות אלה שהוא חלק כל הגישות ויוו pretargeting: לא הפנימו הנוגדן המועסקים על מחייב רקמת המטרה. זה, כמובן, הוא חיוני, כמו הנוגדן חייבים להישאר נגיש radioligand יותר מאשר רע תא תאיים. מגבלה זו היא ללא ספק שקשה לעקוף, אך הוכח לאחרונה כי נוגדנים במחירים איטית עד בינונית של הפנמת יכול לשמש עבור ויוו pretargeting33,34. שנית, isomerization איטי ויוו של תגובתי טרנס -cyclooctene כדי לא פעיל cis -cyclooctene יש פוטנציאל להגביל את משך מרווח הזמן בין הממשל של immunoconjugate עלות הבעלות הכוללת מניבי ו הזרקה של radioligand. אנושות, במרווחי זמן של עד 120 שעות עדיין סיפקו תוצאות מצוינות בהקשר של שתי חיות מחמד pretargeted הדמיה ו- PRIT. עם זאת, השימוש של אלה מרווחי כמעט תמיד מלווה הפחתה קלה בריכוזים פעילות tumoral, תוצאה אשר עשויה לנבוע isomerization הזה. כדי לטפל בבעיה זו, מספר מעבדות ניסו ליצור יותר יציב טרנס- cyclooctenes מבלי להתפשר על תגובתיות, בעוד אחרים כבר ניסו לפתח מסוגל להגיב עם tetrazine35 חדשה לגמרי dienophiles . בשנים הקרובות, תקוותנו היא כי התפתחויות אלה כימי ניתן למנף עבור PRIT.

בסופו של דבר, PRIT מבוסס על מצדו דרישה תגובת דילס-אלדר האלקטרונים ההופכי הוא ללא ספק טכנולוגיה מתהווים וילדותי במידה מסוימת. עם זאת, אנחנו בכל זאת מעודד מהתוצאות פרה יש להשיג ואנו מתרגשים לקראת ההבטחה קליני של אסטרטגיה זו. אנחנו בחיפושפוטנציאלהרכש באירופה פרוטוקול זה מעודד אחרים כדי לחקור, למטב גישה זו, ובכך דלק המסע שלה מהמעבדה למרפאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה ד ר יעקב הוגטאון לשיחות מועיל. המחברים רוצה גם להודות NIH שלהם מימון נדיב (R00CA178205 ו- U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

כימיה גיליון 143 radioimmunotherapy pretargeted radioimmunotherapy pretargeting התגובה דרישה תגובת דילס-אלדר האלקטרון הפוך tetrazine טרנס- cyclooctene huA33 אנטיגן A33 לוטציום-177
Radioimmunotherapy pretargeted התגובה תגובת דילס-אלדר דרישה אלקטרון הופכי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter