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Genetics

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。

Abstract

細菌の病原性遺伝子は多くの場合転写レベルで異なる環境シグナルに応答する複数の要因によって調整されます。いくつかの要因は病原性遺伝子に直接作用します。他の人は下流のレギュレータの式やレギュレータの活動に影響を与える信号の蓄積を調整することによって病態を制御します。規制は、生体外で成長中広く研究されている、しながら比較的感染時に遺伝子発現を調整する方法について少し知られています。そのような情報は、特定の遺伝子産物の治療的介入の候補であるときに重要です。転写のアプローチのように量的なリアルタイム RT-PCR 法と RNA シーケンスは、グローバル レベルでの遺伝子発現を調べるが、ホストの RNA とサンプルと比較して細菌の RNA の低い豊富を含む多くの技術的な課題に苦しむの強力な方法RNases による劣化。蛍光レポーターを使用して規制の評価は比較的簡単とユニークな波長特性を持つ蛍光タンパク質を用いた多重することができます。メソッドは、単一セル、時空間細菌制御ネットワークに影響を与える複雑な三次元アーキテクチャと物理化学的勾配を示す組織における遺伝子発現解析のためことができます。データは一括人口平均化と、このような情報は失われます。ここで、細菌性病原体の場で遺伝子の発現を定量化するための手法について述べる。メソッドは、単純なティッシュの処理と蛍光レポーター蛋白質からの直接観察に基づいています。黄色ブドウ球菌thermonuclease (nuc)、その遺伝子産物は免疫回避と ex vivo および in vivo における病原性に必要な発現を調べることによってこのシステムの有用性を示す.そのnuc gfpは強く腎膿瘍で表され、免疫応答による完全に従事して膿瘍におけるnucプロモーター活性の明白な空間規制の一部による異種遺伝子発現を明らかに示します。このメソッドは、操作可能な遺伝的システムに任意の細菌および前臨床研究と医薬品開発のための貴重な情報を提供する、任意の感染モデルに適用できます。

Introduction

細菌は、適応や生存に必要な遺伝子の差動表現で生理学的な条件と環境の栄養状態の変化の変化に対応します。例えば、日和見病原体には、ボディ表面は比較的低密度で無害なことが多いが植民地化します。ただし、細菌には、物理的・化学的障壁が浸透して、一度、ホスト免疫細胞カウンター防御と栄養アベイラビリティの制限1主張する必要があります。例として、黄色ブドウ球菌性感の人口の約 3 分の 1 の定着が、壊滅的な皮膚および軟部組織感染症、骨髄炎、心内膜炎、菌血症と2の原因でもあります。黄色ブドウ球菌の病原体としての成功は、その代謝の柔軟性だけでなく、細菌を血流を脱出し、末梢組織の複製を有効にする表面関連と分泌の病原因子の武器といわれる3,4,5。ブドウ球菌性疾患によるホスト死は進化の行き止まりと新しいホスト6伝送が制限、病原性因子産生へのコミットメントを慎重に制御する必要があります。

非コーディング RNAs 反応する様々 な環境刺激とタンパク質の複雑な規制のネットワークを含む細胞密度、成長期、好中球関連要因と養分可用性、病原性遺伝子がで表されることを確保するため、正確な時間、ホスト組織7,8,9,10、11,12,13内の場所。例えば、サエル/S の 2 つのコンポーネント システム (TCS) は、センサー キナーゼ (サエス) と応答レギュレータ (サエル)14を介していくつかの病原因子の発現を調節します。サエスはホスト信号 (例,ひと好中球ペプチド [HNPs] カルプロテクチン)8,,1516レスポンスで節約されたヒスチジン残基の自己です。サエル、DNA 結合タンパク質としてそれをアクティブにするのにはアスパラギン酸残基にリン酸化グループ、転送されます (サエル ~ P)17。サエル/S TCS は、フィブロネクチン結合蛋白質 (FnBPs)、leukocidins、コアグラーゼ14,18,,1920など病態に寄与する 20 以上の遺伝子を調節します。サエルのレベルとして誘導の可能性がある高親和性・低親和性遺伝子ターゲットにターゲットを分類できます 〜 P 上昇その手がかり21に露出されたとき。サエル/S の活動は、Agr クォーラム センシング システムなど遺伝子発現の他の規制当局、毒素タンパク質 (Rot) と代替シグマ因子 B (SigB)22,23,24のリプレッサーによって制御されます。

nucの黄色ブドウ球菌の Sae 依存病原性遺伝子、 neutrophilic extracellular trap (ネット) から脱出するため、中に普及のために不可欠である thermonuclease (Nuc) をエンコード、感染25,26のコースです。Nucの式を分岐鎖アミノ酸と GTP27, 存在下でコーディでも強く直接に抑圧し、ブドウ球菌アクセサリー調節蛋白質サラ28,29 によって直接抑圧、その活動は、酸素 (酸化還元状態) と pH30によって影響されます。Sae 、 nucの変異体は、感染症のマウスモデルの減衰は、ことを考える彼らの対応する活動26,31を阻害する化学の介入の開発に関心があります。それにもかかわらず、感染時の規制に関する情報はありません。

蛍光レポーターは、監視し、単一細胞レベルでの遺伝子の発現を定量化する使用されています。ここで、 Sの定量化手法を提案します。黄色ブドウ球菌感染症に発現する遺伝子と組み合わせればin vitro におけるトランスクリプトーム解析と磁気共鳴画像 (MRI) や磁気共鳴分光法 (MRS) のような強力なイメージング技術を明らかにすることができますどのように細菌生理学は、特定のニッチで栄養素の相対的な存在量で規制されています。メソッドは、扱いやすい遺伝的システムと細菌の病原体に適用できます。

ゲノムの統合的なベクトルの概要です。

ゲノム統合のベクトル pRB4 には、各相同組換えを促進する黄色ブドウ球菌usa 300 SAUSA300_0087偽遺伝子の上流と下流地域から 500 の塩基対が含まれています。pRB4 は、耐熱性 β-ガラクトシダーゼ遺伝子ガラクトシダーゼ組み換え32の青/白のスクリーニングのためのエリスロマイシン耐性カセット (ermC) を含む温度敏感な pMAD ベクター バックボーンから派生されます。設計された記者コンストラクトでは、ゲノム統合プラスミド除去と superfolder グリーンに関心の規制地域をヒューズに EcoRI および SmaI サイト後選択のクロラムフェニ コール耐性マーカー (猫) も含まれています蛍光タンパク質 (sGFP) (図 1)。それは、リボソーム結合部位 (RBS) の選択が、レポーターの活動に影響を与える多くの場合経験的最適化33を必要とする知られています。したがって、RBS は付属されていません。ここでは、ネイティブ リボゾームの結合サイトは遺伝子発現のより自然なパターンを提供するために使用されるが、他のサイトを使用することがあります。

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Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージタウン大学によって承認されています。

1. 蛍光レポーター歪みの世代

  1. 制限酵素 EcoRI と SmaI で順番にゲノム統合 pRB4 ベクトルを消化します。次の製造元のプロトコル SmaI 25 ° c、1 μ g の pRB4 を使用して一晩消化を設定、EcoRI を反応混合物に追加することによって 37 ° C で 1 時間 2 番目の消化が進みます。20 分の 65 ° c の孵化によって酵素を不活性化します。
  2. PCR 増幅 (この場合 〜 350 塩基対 DNA フラグメントの thermonuclease [nuc] プロモーター領域を含む)、ゲノム DNA からの興味の規制地域 5' EcoRI 制限サイトと 3' SmaI 制限サイトを組み込みます。SmaI 認識シーケンスする必要がありますフレームで翻訳開始コドン。本研究では、PCR を行ったメーカーの推奨事項に従って忠実度の高い DNA ポリメラーゼを用いた前方プライマー oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') 逆プライマー oRB016 (5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3')。アニーリングの温度 53 ° C であった。製造元の指示に従って PCR クリーン アップ キットを使用して結果のフラグメントを浄化します。
  3. EcoRI と SmaI ステップ 1.1 で実行結果として得られる PCR の製品を消化し、製造元の推奨どおりに T4 DNA リガーゼを使用して統合の構築を生成する pRB4 の同じサイトに消化の DNA のフラグメントを縛る。エシェリヒア属大腸菌に結紮混合物を導入し、構築シーケンスを確認します。
  4. 34と前述したように、Electroporate黄色ブドウ球菌株 RN4220 を構築します。簡単に言えば、電子有能なセルの 70 μ L で 1 μ g のプラスミドを使用 (100 Ω、25 μ F と 2.3 kV) B2 液 (1% [w/v] カゼイン加水分解物、酵母エキス 2.5% [w/v]、2.5% [w/v] NaCl、0.1% [w/v] K2PO40.5% [w/v] 血糖値)。エリスロマイシン (5 μ g mL-1) と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X Gal; 80 μ g mL-1) 補われるトリプシン大豆寒天 (TSA) に寛容な温度 (30 ° C) で抵抗エリスロマイシン (Emr) を選択します。結果として得られる形質転換体、プラスミドでエンコードされた β-ガラクトシダーゼ活性のために青。
    注:臨床分離株に DNA の転送は、強い制限変更バリア35のために非常に困難です。したがって、欠乏および高い変換可能な制限だから、黄色ブドウ球菌RN4220 は融合コンストラクトの中間の受信者として使用されました。
  5. 寛容な温エレクトロポレーションまたはバクテリオファージを介した伝達36を使用して興味の黄色ブドウ球菌の usa 300 株にプラスミドを転送します。簡単に言えば、Φ11バクテリオファージ TSA プレート 5 mM CaCl2ドナー歪に及ぼす粒子 30 ° c、夜間し、0.45 μ M の酢酸セルロース シリンジ フィルターを通して濾過により滅菌を伝達します。ヘッジホッグ Emrには黄色ブドウ球菌菌株ラック lysates を使用します。
    注:ラックは、以前に行われた Em 敏感与える Emr 37,38ネイティブ プラスミド pUSA03 の歪みを治すため TSB 培地で継によって広く使用されている臨床分離株です。
  6. 染色体32を前述のように、2 つの連続した相同組換えイベントによって構造を統合します。組み換え、クロラムフェニ コール耐性 (Cmr) 5 μ g mL-1を含む TSA プレートにクロラムフェニ コール, エリスロマイシン感受性 (Erms), と長いブルーです。
    注: 可能な場合、in vitro におけるひずみ通路39と温度シフトに関連付けられている突然変異の蓄積を避けるためにバクテリオファージを介した伝達を介して usa 300 にマークされた融合を再導入します。

2. 動物感染症: 接種、全身性感染症、およびティッシュの処理の準備

  1. 菌の準備
    1. 冷凍グリセロール ストックから血液寒天培地プレート上の分離のための興味の黄色ブドウ球菌菌株を連勝します。赤い血球 (赤血球) を溶解する能力に基づいて溶血性表現型とフォームをオフに透明なゾーンを確認する 37 ° C 16-24 時間で孵化させなさい。
    2. 一晩培養を開始するには、滅菌ガラス管のトリプシン大豆スープ (TSB) 4 mL にそれぞれのひずみのシングル コロニーを接種します。約 70 ° の角度と 70 回転毎分 [RPM] で設定チューブ ローラー 16-24 h 37 ° C でチューブを回転させます。
    3. 600 の光学濃度を測定する分光光度計を使用してステップ 2.1.2 から文化の nm (外径600)。(空白) 光参照として生殖不能媒体を使用します。0.05 で 25 mL の滅菌トリプシン大豆スープ (TSB) 別での OD600にこれらの細胞を希釈、125 mL フラスコ (容積比 5:1 フラスコ) のデロング、適切な熱に転送するため、文化)、水浴の文化をインキュベート 280 回転で振動し、37 ° C に設定
      メモ: 接種材料の成長は、さまざまな方法で実行できます。指数段階に成長している細胞の 1 つのメソッドが表示されます。関係なく、接種のためセルを準備するため同じ方法を一貫して使用することが重要です。
    4. ~ 1 の600を OD、再開始外径600セル達成指数段階と指数段階レベルに夜通しの孵化中に蓄積する要因を低減していることを確保するため 0.05 の新鮮培地に細胞を希釈します。
    5. 室温で 10 分間 3,000 × gで遠心分離指数段階 (外径600 ~0.6–0.8) でセルを収穫します。
    6. リン酸緩衝食塩水 (PBS; pH 7.4) x 滅菌 1 の同等のボリュームで 2 回ペレットを洗浄します。
    7. 1 × PBS (pH 7.4) 1 x 108コロニー形成単位 (CFUs) mL-1の濃度で細胞をサスペンドまたは目的のために適切な実験します。
      注:セル サイズと形状のひずみ依存性の変化は光散乱特性に影響を及ぼすため外径600と関心の各緊張に CFU mL-1との関係を決定することが重要だと、最終的に、伝染の線量。
  2. 動物や細菌感染の準備
    1. 精製飼料・ アイン 93 7 日間マウスを順応させます。食事は、標準のマウスの食事40植物由来原料の消費に伴う組織自動蛍光を削減しながら十分な栄養を提供するために策定されます。
      注:ここで、女性の C57/BL6 マウス (6-8 週齢) を使用、マウス緊張とセックス研究によって異なります。
    2. 感染する前に、ぬるま湯マウス尾静脈を拡張させます。
    3. 動物に感染して全身感染を引き起こす尾静脈を介して菌の 100 μ L 注入によって。フローサイトメトリーを実行している場合、最初の接種の因数を保存 (セクション 4 を参照)。
    4. 毎日動物を監視し、審査し、承認の制度的動物ケアおよび使用委員会の監視システムを使用して自分の健康状態を評価します。
    5. 希望の期間進行する感染を許可します。実験は、終了 3 日後感染を示します。
      注:これらの条件の下で膿瘍は、細菌、フィブリンの沈殿物によって囲まれ、免疫細胞5,41の同心の層に囲まれてのブドウ球菌性膿瘍コミュニティで構成されます。
  3. 器官およびティッシュの処理を収穫
    1. CO2吸入と二次的な方法として頚部転位によって動物の安楽死し、剖検を実行します。
    2. 腎臓 (右) とその他の臓器 (心臓、肝臓、肺、脾臓) を収穫し、10% [v] ホルマリンを含む 15 mL ポリプロピレン チューブに移します。後述 2.3.4 をステップにこれらの臓器を続行します。
    3. 左の腎臓を 2 mm シリカビーズの 1 mL 滅菌 1 × PBS (pH 7.4) 〜 500 μ L を含む滅菌 2 mL 耐衝撃管に転送します。この器官に 4.2 の手順に進みます。
    4. 2.3.2 穏やかな揺れや回転が少なくとも 24 時間、48 時間室温で暗闇の中を修正するための手順から臓器を許可します。
    5. 明確な組織の凍結中に臓器を埋め込み、-80 ° C で組織を保存
    6. 10 μ m の厚さのスライスに、クライオスタット、セクション組織を使用します。
    7. 暗闇の中で 20 分間事前洗浄、荷電ガラス スライド上のセクションを乾燥, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色でメディアをハード マウントを適用し、coverslip を適用します。室温でマウントされたスライドを一晩で治すし、長期保存のための 4 ° C に転送します。

3. レーザー走査型共焦点顕微鏡と画像処理

  1. 使用されている蛍光レポーターの適切なレーザーを使用して病変を検索するマウント スライドを確認します。この場合、緑 (GFP)、赤 (tdTomato)、ブルー (DAPI) 蛍光信号を使用します。
  2. 個々 の細胞を可視化するための適切な目的を使用して画像を取得 (例えば、通常 20 倍または 40 倍目標が使用されます)。
  3. 共焦点画像の蛍光強度を測定します。
    1. 画像 J の共焦点画像を開き、正しく病変の蛍光信号を視覚化する明るさ/コントラストを調整します。
    2. しきい値オプションを使用して、関心の領域を定義、必要に応じて下限と上限の蛍光制限を設定します。
    3. 重心を選択して定義エリア平均グレー値 → 重心 → 制限のしきい値画像 J. [分析] タブの下で
    4. 重心の蛍光強度の値を抽出または GFP と tdTomato 特定の病変面積 (平均蛍光強度、MFI) あたりの平均蛍光強度を測定します。ここでは、1 つの μ m2の領域が使用されました。
      注:盲検第 2 分析は、サンプルの id がわかっている場合のバイアスを最小化します。
    5. データをプロットし、各比較の適切な統計解析を実行します。

4. 流れフローサイトメトリー解析

  1. (省略可能)(2.2.3 を参照) からの感染の日に接種の融合活性を決定します。
    1. 1 x の 899 μ L 滅菌 PBS (pH 7.4) を追加各菌の 100 μ L と 1 μ L 膜側の透過物の核酸の染色 (材料の表を参照してください)。コントロールに欠けている核酸染色サンプルを含めることです。
    2. すべてのサンプルでフローサイトメトリーを実行します。
      注:非常に最初の実験では、使用する適切な電圧を決定する興味の融合のためのベクトルだけ調節に便利です。正と負のサンプル間の明確な分離は、データ解析に不可欠なバック グラウンド信号をはるかに上回るは記者を示します。
    3. 細菌の人口を識別するために核酸の汚れ (y 軸) を使用して、イベントをプロット、散布図 (x 軸) を転送します。
    4. 両方の核酸染色陽性のイベントと菌 (黄色ブドウ球菌用 0.5 〜 2.0 μ m) の間前方散乱に基づく正しいサイズ周り包含ゲートを描画します。
      注:これらのパラメーターには、明らかにイベントを含めることが重要である、この人口を識別するとき厳密なこと。この門を除くその他の条件の下で否定的なコントロールのすべてのイベントを必ず。本研究では約 70% セル人口を満たして分析これらの要件。
  2. 犠牲の後組織試料の分析:
    1. 安楽死させる動物、(手順 2.3 参照)、左の腎臓を収穫し、ビーズに転送管滅菌 PBS (pH 7.4) x 1 の含有 1 mL とホウケイ酸塩の 2 mm のビードを 250 μ l 添加します。
    2. 細菌細胞を解放する組織を混乱させます。腎臓の細胞を破壊するのに圧力式ホモジナイザーを使用します。ここでは、冷却サイクル間濡れた氷上期間 1 分 6800 rpm で 3 つの 30 s バーストは加熱サンプルを最小限に抑えるために使用されました。
    3. ペレット 4 ° C に冷却卓上遠心機で 3 分間 250 × gで遠心分離によってより大きいティッシュの残骸
      注:通常、チューブの上に浮かんでいる残骸の層下部の細胞ペレットがあります。中間の水層には、細菌のセルが含まれています。
    4. 水層から 989 μ L の PBS の核酸染色の 1 μ L を含むクリーン 1.5 mL 遠心チューブに 10 μ L を転送 (合計量 1 mL)。
    5. フローサイトメトリー同じデータ集録パラメーターを使用して、最初の接種に関してはゲートを実行します。
      注:サンプルは主に組織破片を含んでいるので、細菌の細胞の数は非常に低くなります。「ライブ ゲート」オプションは、データがアプリケーションに読み込まれるとき、核酸染色陽性とサイズ ゲートがあるセルの場合にも使用できます。これは、対象イベントの詳細を分析し、ファイル サイズを減らすにも役立ちます。、サンプルごとにほぼ 100 万のイベントがカウントされますが、より多くのイベント カウント、感染症の重症度と組織のサイズに応じて必要があります。
    6. データ分析: 決定セクション 4.1.4 で決定された包含ゲートを用いた特定のサンプルの各蛍光体の蛍光強度 (MFI) を意味します。イベント カウントする流動解析ソフトのサンプルを正規化します。分析では、通常 10,000 カウントです。
      注:これは膿瘍の形成と感染症の重症度に依存するのでこのイベント数よりも少ないが含まれてサンプルを見つけることは珍しくないです。500 40,000 は、このアプローチを使用してイベントは、通常感染した組織で発見されます。

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Representative Results

任意の記者を届けることができる pMAD32から派生したプラスミドを開発したダブル クロス オーバーの相同組み換え (図 1) による染色体に融合コンストラクト。このコンス トラクターは、GFP タンパク質と背景の上の蛍光信号の生成をサポートする任意の規制領域の定量分析のためことができます。プラスミッドのメンテナンスや大腸菌の繁殖はアンピシリン抵抗 (Apr) 相談には抵抗エリスロマイシン (Emr) 相談球菌。構成も付与クロラムフェニ コール抵抗 (Cmr) で高度な遺伝子分析の様々 な突然変異系統間レポーターの融合の簡単な転送を可能にする球菌。

原則の証拠として、我々 は原子を融合したgfp nucに規制地域が選ばれた理由は、その遺伝子産物は完全病原性に必要、膿瘍42、誘導からs の黄色ブドウ球菌 -マクロファージを制限することが必要。 43。構造体は、染色体のプロトコルの手順 1.4 1.6 で説明されているように統合されました。統合融合し、PsarAP1- tdTomato 融合を含む AH3926 に移されました。サラP1 プロモーター恒常活性44に以前示されている、したがって、すべてのセルのラベルします。

我々 はまず、記者の融合が培養中にアクティブ フラスコ成長トリプシン大豆スープ (TSB; リッチで複雑な媒体) で横に振るし、蛍光のレベルが自動蛍光細胞 (図 2) バック グラウンドの上で確認。体内蛍光レポーターの動作方法を調べるには、変更された腎膿瘍モデルは使用される5。女性の c57bl/6 マウスのグループは、1 x 107 CFU の各記者の融合に欠けている黄色ブドウ球菌ラック セルまたは原子 sGFPとsarAp1 tdTomatoの両方の融合を運ぶラック セルの静脈内に挑戦しました。動物が犠牲にされた 3 日間ポスト感染。その後、収穫器官は 10% [v] 緩衝ホルマリンで固定された、ステップ 2 と 3 (図 3A, B) の低温電子顕微鏡断面および DAPI 染色前述の共焦点顕微鏡によるイメージ。画像イメージ J を使用して分析し、腎病変における単位面積あたりの蛍光を測定しました。図 3Cに示すように、 nuc gfp融合蛍光レポーターの融合を持っていない細胞より融合を運ぶ細胞でほぼ 9-fold より高い平均だった後者の信号検出 (自動蛍光) (比較nuc sGFPラックへ) の制限を構成します。同様に、PsarAP1- tdtomato 融合蛍光だった 〜 6-fold (図 3E、比較sarAP1- tdT 対ラック) なしの記者コントロールよりも高い。フローサイトメトリーを使用して、記者活動のパターンは腎臓ホモジネートを用いて確認されたとフローサイトメトリー手順 4 で説明した、倍の蛍光性の違いがあった (図 3D, F) を下げます。

興味深いことに、記者に欠けているそれらより高い変動を表示する蛍光レポーターの融合を運ぶ細胞によって形成された病変から蛍光データが登場。我々 記者の異種発現による蛍光観察で変化があったかどうか疑問に思いました (つまり、生物学的起源の)。確かに、〜 100 μ m の距離内でいくつかの病変がいずれか 1 つまたは両方の記者 (図 4) を表明したことが分られました。重要なは、空間に関連付けられた可能性が高い強力な DAPI 染色と限局性膿瘍のnuc発現調節を明らかにブドウ球菌性膿瘍コミュニティ (嚢) の単一セルの解像度を持つレポーターの活動を調べること、形成と好中球細胞外トラップ (図 5A ~ C)45。例えば、(図 5B, E) 周辺をくらべると嚢の内部コアの有意に高いnuc sGFP融合の蛍光を測定しました。同じ膿瘍内sarAp1 tdTomato融合蛍光のパターンのように見える (図 5D) を反転します。しかし、パターンは動物 (図 5F) の同じ数を使用して統計的に有意ではなかった。

Figure 1
図 1:ゲノム統合記者プラスミド pRB4 の概略図。プラスミド pRB4 pMAD の黄色ブドウ球菌(博多織 pE194ts) でのレプリケーションの温度の敏感な起源と派生したものです。3 薬剤耐性マーカーがある: (i) bla、大腸菌; アンピシリンに耐性(ii) ermC、エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌。(iii)猫、黄色ブドウ球菌のクロラムフェニ コール耐性します。記者コンストラクトが隣接している 〜 500 bp の各SAUSA300_0087偽遺伝子の上流と下流のシーケンスから (ゲノムを参照: FPR3757) ダブル クロス オーバー相同組換えとゲノムの統合のため。sGFP、緑の蛍光蛋白質遺伝子;CS、クローニング サイト;TT は、強力な双方向転写ターミネーター。図ではないスケール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 私一貫nuc sGFPとsarAp1 tdTomato記者は、生体外で成長中に表現され. 黄色ブドウ球菌ラック細胞 (野生型 [WT])、 nuc -sGFP (A) または (B) sarAp1 tdTomato記者なし) TSB で指数の段階に成長して, 再度同じ媒体に希釈します。光学濃度 (OD) と蛍光は、示された光学密度値を測定しました。バック グラウンド減算蛍光強度値 (励起/蛍光: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT] 535/590 nm) 相対的な蛍光ユニットを生成する光の密度値で分けられました。データは、2 つの独立した実験から SEM の +/-の手段です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 蛍光レポーターが腎組織で表示されます。13 c57bl/6 マウスのグループは、LAC 細胞または原子 sGFPとsarAp1 tdTomato (tdT)、運ぶラック細胞による静脈内に挑戦した、感染症が三日間続行する許されました。マウスを安楽死させ、臓器が手順 2 と 3 のプロトコルで説明されているように処理されました。多発性病変と (A) の関連付けられた蛍光を示す代表的な腎臓セクション 原子 sGFPと (B) sarAp1 tdTomato。スケール バー = 250 μ m (対物レンズ 10 倍)。相対的な蛍光単位面積 (RFU [μ m2]-1) 腎病変に関連付けられている単位ステップ 3.3 で説明したように、画像解析を用いた測定しプロット (C) 原子 sGFPと(E)sarAp1 tdTomato;各ドットがひとつの病変を表し、バーを示す中央;3-5 病変マウスあたりを分析しました。Nuc sGFP (D) と (F) sarAp1 tdTomato融合蛍光感染腎臓ホモジネート 3 日ポスト感染から分離された細菌集団の流れフローサイトメトリー解析。平均蛍光強度 (MFI) は固体バーで示され、各ドットが 1 つの腎臓。ラック、reporterless 野生型株。統計: マンホイットニー検定;p < 0.05。データは、2 つの独立した実験の代表です。励起波長蛍光チャネルは次のとおりです: DAPI、405 nm;GFP、488 nm;tdTomato, 561 nm。波長範囲にわたって放出される蛍光のデータが収集された: DAPI、419-481 nm;sGFP、505 551 nm;tdTomato、575-630 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 膿瘍を示す腎組織の記者の可変式。13 c57bl/6 マウスのグループは、1 x 107尾静脈を介して黄色ブドウ球菌細胞の CFU と挑戦しました。動物は、安楽死させた 3 日間ポスト感染だった。腎臓が収穫された固定、およびプロトコルの手順 2 で説明した蛍光顕微鏡 (40 × 対物) の断面。Nuc sGFP (A) と (B) sarAp1 tdTomato蛍光の変数のレベルの近くで 3 つの病変は、示されています。(C) 核酸ブドウ球菌とホストから細胞は示された DAPI 染色。緑と赤のチャンネルは、(D) にマージされます。同様の結果は、他のセクションで見られました。40 × 対物; を使用して画像を取得しました。スケール バー = 25 μ m。励起波長蛍光チャネルは次のとおりです: DAPI、405 nm;GFP、488 nm;tdTomato, 561 nm。波長範囲にわたって放出される蛍光のデータが収集された: DAPI、419-481 nm;sGFP、505 551 nm;tdTomato、575-630 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5:nuc sGFPブドウ球菌性膿瘍の微小環境における空間的規制されている。共焦点レーザーのスキャン顕微鏡検査 (CLSM)黄色ブドウ球菌のひずみラック運ぶnuc sGFPとsarAp1 tdTomatoの記者の融合によるブドウ球菌性膿瘍コミュニティ (SAC) 病変の画像。(A) が示されているチャンネル原子 sGFPとsarAp1 tdtomato、(B) nuc sGFP蛍光 (緑) を合併 (C) DAPI 染色核酸 (青) と(D)sarAp1 tdTomato蛍光 (赤色)。印は中心 (重心) の細胞と、周囲のセルを示す矢印。(F) と (E)原子 -sGFP の蛍光強度 sarAp1 tdTomatoがコアおよび嚢の周囲のセルに表示されます。励起波長蛍光チャネルは次のとおりです: DAPI、405 nm;GFP、488 nm;tdTomato, 561 nm。波長範囲にわたって放出される蛍光のデータが収集された: DAPI、419-481 nm;sGFP、505 551 nm;tdTomato、575-630 nm。(マウスごとに 1 つ)、8 の腎臓由来のデータと各腎臓から 1-2 病変をイメージしました。バーでは、中央値を示します。破線、検出限界。統計: 正規分布データ、スチューデントの t 検定 (ペア) の * * *p < 0.05。(スケールバー = 20 μ m; すべての画像に適用されます)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

細菌感染症は、抗生の抵抗の決定要因の46の取得により世界的な増加する健康問題です。ホスト環境への適応は成長と感染中の生存に不可欠な病原体のフィットネスを高める遺伝子発現プログラムを見据えた戦略は治療役に立つかもしれない。1 つのようなプログラムは、サエル/S 2 つコンポーネント システム (TCS)、免疫回避47で重要な役割を再生する前に示したによって制御される遺伝子のセットです。サエル/S は、さまざまな要因、好中球8,20に関連付けられている特にそれらによって誘導されます。感染症の中には、黄色ブドウ球菌は好中球や他の食細胞が感染2のサイトに募集して強い炎症反応を引き出します。液化壊死およびフィブリン沈着に従って、さらに48組織の損傷を防ぐために膿瘍を形成します。これらの免疫特権サイト内で黄色ブドウ球菌細胞は容易に細菌の増殖5,48に膿瘍を再プログラムするのに Sae 依存性遺伝子産物の数を使用します。1 つの Sae 依存型遺伝子nucヌクレアーゼのコード、2'-デオキシアデノシン マクロファージ43を殺すために生産する網を代謝します。したがって、Nuc はにおける病原性42に欠かせない、表明した生体内で(図 3図 4、および図 5) 重要な分泌酵素であります。

黄色ブドウ球菌の病原因子は盛んに研究されている、どのように細菌のホストで育つは流領域、感染中にその生理を調整する方法を理解しています。ここで細菌の遺伝子発現と選択の不在でプラスミドの損失についての心配を軽減修正統合のベクトルを用いた単一細胞レベルでの動作を調べるための手法について述べる。我々 の方法論は、細胞壁を permeabilize しなくてと抗体、標識を必要とせず膿瘍における遺伝子発現の直接可視化できます。腎膿瘍が 3 日間野生型細胞によって形成される嚢急性の全身性感染症モデルにおける感染症の記事でsarAp1 tdTomatoの融合と同様、 nuc sGFP融合の強い表現を検出しました。しかし、実験的なデザインは、他のサイトでの遺伝子発現に関する質問にお答えする変更できます。確かに、c57bl/6 マウスを彼らの組織から黄色ブドウ球菌をクリアすることができないため、細菌に侵入する多様な解剖学的サイト (骨・関節) の骨格システム、脳、心臓、脾臓、肝臓などを含むすべての異なる生理学栄養のプロパティ5,49。したがって、多くはホスト組織の性質を調査する黄色ブドウ球菌を使用して学ぶことができます。特定ホストのニッチは本質的に低酸素またはそれ以外の場合強い酸素勾配50を展示を知られているに注意してくださいすることが重要です。蛍光タンパク質アクティビティは、酸素分子を必要とする、いくつかは他より酸素分圧に敏感51。我々 は蛍光を見る間、膿瘍の奥深くに信号の大きさが過小評価をする可能性があります。クロストリジウム ・ ディフィシルの用に開発された蛍光タンパク質のコドン最適化を使用しては、この懸念52を軽減するためにされる可能性があります。注: 2 番目の点は本研究で使用されるレポーター系統によって生成された蛍光タンパク質 (sGFP と tdTomato) が安定しています。したがって、蛍光のデータは、最新の応答ではなく、実験の過程で蓄積を反映します。不安定な sGFP または tdTomato 遺伝子を含む構成要素を生成する大幅動的実験のためシステムの有用性を増加させます。

ここで説明したレポーター システムは、遺伝子調節の in vitroとin vivoの定量的研究の強力なツールを提供します。記者は、染色体上の 1 つのコピーで維持される、システムは強く発現遺伝子 (つまり高プロモーター活性を有するが、) に最適です。生合成遺伝子やその他の卑しい発現遺伝子は可能性がありますの蛍光発現レベルが検出またはバック グラウンド自動蛍光の制限を下回ることができますので表示されません。リボソーム結合部位 (RBS) 記者融合33の活動に影響を与えることが知られています。この問題の潜在的なソリューションは、翻訳開始地域 (TIR)53など強力な RBS を使用するまたは染色体に関心のプロモーターのタンデム コピーを統合します。また、安定した多コピーのプラスミッドは使用される54かもしれない。

説明した方法の制限は、組織から抽出した RNA からの cDNA の準備とは異なり比較的少数の遺伝子が問い合わせを受ける同時に (スペクトル重複なし利用可能な蛍光チャネルによって制限されます)。しかし、何を得ていることが有益であろう可能性がありますより。qRT PCR および一括人口の平均他の読み出しが感染部位に人口の不均一性をキャプチャすることができます。確かに、 nuc sGFPのレベルの不均一性を見ましたし、膿瘍性病変の間sarAp1 tdTomato式近接 (図 4)。これ最近 Cassatらによって報告されたものと同様です。55この時、この不均一性の起源は知られていません。ただし、栄養アベイラビリティ、栄養集録システムの可変吸気または他の宿主因子で、現象を説明することはおそらく可能性があります。また、宿主-病原体相互作用は微小器官または膿瘍、複雑な立体構造と種々 の細胞の内で発生します。これらの構造の内で組織は pH、浸透圧、酸素、栄養アベイラビリティ、代謝帯状56,57として知られる現象に対してかなり変化できます。偶然膿瘍 (図 5) に存在する野生型細胞の空間的制御のパターンが生まれることがわかりました。これは我々 の知る限り感染時にグラム陽性の病原体で、その種の最初の観測です。空間の規制報告・ デイヴィスらが入手できるようです。脾仮性結核58グラム陰性菌の microcolonies を含みます。そのインスタンスでホスト生成一酸化窒素 (NO *)、拡散なし *、インテリアをさかんに最も近いコロニーの周囲に細胞の一酸化窒素ジオキシゲナーゼ (Hmp) の生産細胞の発現を誘導するために必要な刺激hmp 。Nuc式は、ブドウ球菌性膿瘍、嚢の外周に沿って弱いコアで最強。膿瘍は、好中球のカフに囲まれ、好中球由来の手がかりブドウ球菌、形態形成を連想させる 2 つの表現型異なる集団にセルを偏光の行動指針となっていることを推測する誘惑です。高い生活59における分化の調節。このパターンのメカニズムの基盤は知られていると私たちの研究室で強烈な研究の主題であります。

私たちの方法効果的なツールを提供します感染時に個々 の細胞における遺伝子発現の細部を勉強と考えています。メソッドは、観察して不均一性の生理学的な起源と組織における遺伝子発現のパターン形成を最終的に理解するユニークな機会を提供します。新しい治療法を開発する際必要細胞 (すなわち、それらの遺伝子を表現する) の亜種だけは治療に狙われるので、この異種現象を考慮撮影する必要があります。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

フローサイトメトリー解析ヘルプについては PsarAP1- tdTomato 融合とカレン クレスウェルの贈り物ありがとうアレキサンダー Horswill。我々 はまた統計的な分析でアドバイスをアリッサ王をありがちましょう。この作品は、NIH 萌芽/発達研究賞 (グラント AI123708) と SRB 学部スタートアップ資金によって一部で賄われていた。資金提供者には、研究デザイン、データの収集と解釈、または出版物のための仕事を提出する決定の役割はなかった。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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遺伝学、問題 144、遺伝子発現、病原性、蛍光、共焦点顕微鏡、病理、細菌、病原体、空間的制御、Sae 2 成分系、ヌクレアーゼ、腎臓、膿瘍
感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド
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Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz,… More

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

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