Summary
Beskrevet her er en metode til at analysere bakteriel genekspression i animalsk væv på et cellulært niveau. Denne metode giver en ressource for at studere fænotypiske mangfoldigheden indtræffer inden for en bakteriel befolkning i svar til væv miljø under en infektion.
Abstract
Bakteriel virulens gener er ofte reguleret på transkriptionel niveau af flere faktorer, der reagerer på forskellige miljømæssige signaler. Nogle faktorer handle direkte på virulens gener; andre styre patogenesen ved at justere udtryk for downstream tilsynsmyndigheder eller ophobning af signaler, der påvirker regulator aktivitet. Mens forordningen er blevet undersøgt udførligt under in vitro- vækst, er relativt lidt kendt om hvordan genekspression reguleres under infektion. Sådanne oplysninger er vigtige, når et bestemt gen produkt er en kandidat til terapeutisk intervention. Transkriptionel tilgange som kvantitative, real-time RT-PCR og RNA-Seq er effektive måder at undersøge Gen-ekspression på globalt plan, men lider af mange tekniske udfordringer, herunder lav overflod af bakterielle RNA sammenlignet med værten RNA, og prøven nedbrydning af RNases. Evaluering af forordningen ved hjælp af fluorescerende journalister er relativt let og kan være multipleksede med fluorescerende proteiner med unikke spektrale egenskaber. Metoden giver mulighed for enkelt-celle, spatiotemporelle analyse af genekspression i væv, der udviser komplekse tredimensionale arkitektur og lægemiddels gradienter, der påvirker bakteriel regulerende net. Sådanne oplysninger går tabt, når data er gennemsnit over befolkningens bulk. Heri, beskriver vi en metode til kvantificering af genekspression i bakterielle patogener in situ. Metoden er baseret på enkle væv forarbejdning og direkte observation af fluorescens fra reporter proteiner. Vi påvise nytten af dette system ved at undersøge udtryk for Staphylococcus aureus thermonuclease (NUK), hvis genet produkt er nødvendig for immun unddragelse og fuld virulens ex vivo og in vivo. Vi viser at nuc-normal god landbrugspraksis er stærkt udtrykt i nyre bylder og afsløre heterogene genekspression skyldes delvis tilsyneladende rumlige regulering af nuc promotor aktivitet i bylder fuldt engageret med immunrespons. Metoden kan anvendes på enhver bakterie med et manipulatable genetiske system og enhver infektion model, at give værdifulde oplysninger til prækliniske undersøgelser og udvikling af lægemidler.
Introduction
Bakterier reagere på ændrede fysiologiske forhold og ændringer i deres miljø ernæringsmæssige tilstand af varierende udtrykker gener kræves for tilpasning og overlevelse. For eksempel, kolonisere opportunistiske patogener krop overflader på relativt lav tæthed, og er ofte uskadelig. Men når bakterien har trængt fysiske og kemiske barrierer, skal det slås med værten immun celle Counter forsvar og kun næringsstoftilgængelighed1. Som et eksempel, Staphylococcus aureus koloniserer ca. en tredjedel af befolkningen asymptomatically, men er også årsag til ødelæggende hud og bløddele infektioner, osteomyelitis, endocarditis og bakteriæmi2. Succesen med S. aureus som en patogen ofte tillægges dets metaboliske fleksibilitet samt et arsenal af overflade-associerede og udskilles virulens faktorer, der aktiverer bakterie kan slippe ud i blodbanen og replikere i perifert væv 3,4,5. Da værten dødsfald som følge af stafylokok sygdom er en evolutionær blindgyde og grænser transmission til nye værter6, skal forpligtelse til virulens faktor produktion kontrolleres omhyggeligt.
En komplekse regulerende netværk af proteiner og ikke-kodende RNA'er svarer til en lang række miljømæssige stimuli, herunder celle tæthed, vækstfase, neutrofile-associerede faktorer og næringsstoftilgængelighed, at sikre at virulens gener er udtrykt ved den præcise tidspunkt og sted inden for værten væv7,8,9,10,11,12,13. For eksempel, regulerer SaeR/S to komponent system (TCS) udtryk for flere virulens faktorer via sensor kinase (SLV) og svar regulator (SaeR)14. SLV er autophosphorylated på en bevaret histidin rester i svar til værten signaler (f.eks., menneskelige neutrofile peptider [HNPs], calprotectin)8,15,16. Gruppen phosphoryl overføres derefter til en aspartat rester på SaeR, aktivere det som en DNA-bindende protein (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS regulerer over 20 gener, at bidrager til patogenesen herunder fibronektin bindende proteiner (FnBPs), leukocidins og coagulase14,18,19,20. Mål kan inddeles i høj-affinitet og lav-affinitet gen mål, som sandsynligvis induceret som niveauet for SaeR ~ P stiger når de udsættes for dens stikord21. SaeR/S aktivitet er kontrolleret af andre regulatorer af genekspression såsom Agr quorum sensing system, repressor toksiner protein (Rot), og alternative sigma faktor B (SigB)22,23,24.
NUK er en Sae-afhængige virulens gen i Staphylococcus aureus og koder thermonuclease (NUK), som er afgørende for flygter fra neutrophilic extracellular trapper (net) og formidling under den løbet af infektion25,26. Udtryk for NUK er også stærkt indirekte undertrykt af CodY forgrenede aminosyrer og GTP27, og direkte undertrykt af stafylokokker tilbehør regulator protein SarA28,29 , hvis aktiviteter er påvirket af ilt (redox stat) og pH30. I betragtning af at sæ og nuc mutanter er svækket i musemodeller af infektion, er der interesse i at udvikle kemiske interventioner, der hæmmer deres tilsvarende aktiviteter26,31. Trods dette er der ingen oplysninger om deres forordning under infektion.
Fluorescerende journalister har været brugt til at overvåge og kvantificere genekspression på enkelt celle-niveau. Heri, præsenterer vi en metode til kvantificering af S. aureus genekspression under infektion, når parret med in vitro-transkriptom analyse og kraftfulde Billeddannende teknikker som magnetisk resonans imaging (MR) og magnetisk resonans-spektroskopi (MRS), kan afsløre hvordan bakteriel fysiologi er reguleret i vivo og de relative mængder af næringsstoffer i visse nicher. Metoden kan anvendes på enhver bakteriel patogen med en tractable genetiske system.
Oversigt over genom Integrativ vektor.
Genom Integrativ vektor pRB4 indeholder 500 basepar hver fra de opstrøms og nedstrøms regioner af S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene lette homologe rekombination. pRB4 er afledt af den temperatur-følsomme pMAD vektor rygraden indeholdende erythromycin modstand kassette (ermC) og termostabil beta-galactosidase gen bgaB for blå/hvid screening af recombinants32. Manipuleret reporter konstruktion indeholder også en chloramphenicol modstand markør (kat) for udvælgelse efter genom integration og plasmid elimination, samt EcoRI og SmaI steder at sammensmelte de regulerende region af interesse for superfolder grøn fluorescerende proteiner (sGFP) (figur 1). Det er kendt, at valget af ribosomet bindingssted (RBS) påvirker aktiviteten af journalisten, og ofte kræver empiriske optimering33. En RBS leveres således ikke. Her, native ribosomet bindingssted bruges til at give en mere naturlig mønster af genekspression, men andre websteder kan anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Georgetown University.
1. generation af fluorescerende Reporter stamme
- Fordøje genom Integrativ pRB4 vektor sekventielt med EcoRI og SmaI-restriktionsenzymer. Efter fabrikantens protokol, oprette en overnight fordøjelse med SmaI ved hjælp af 1 µg for pRB4 ved 25 ° C, og derefter fortsætte med den anden fordøjelse i 1 timer ved 37 ° C ved at føje EcoRI til reaktionsblandingen. Inaktivere enzymerne ved at inkubere ved 65 ° C i 20 min.
- PCR forstærke den regulerende region af interesse fra genomisk DNA (i dette tilfælde, en ~ 350 basepar DNA fragment indeholdende thermonuclease [nuc] promotor-regionen), indlemmede en 5' EcoRI begrænsning site og en 3' SmaI begrænsning site. SmaI anerkendelse sekvens skal blive i-frame med translationel start codon. I denne undersøgelse, PCR blev udført ved hjælp af en high-fidelity DNA Polymerase efter fabrikantens anvisninger med fremad primer oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') og vende primer () oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Den udgloedning temperatur var 53 ° C. Rense den resulterende fragment ved hjælp af en PCR oprydning kit efter fabrikantens anvisninger.
- Fordøje det resulterende PCR produkt med EcoRI og SmaI som udført i trin 1.1 og ligate fordøjet DNA fragmentet til de samme steder i pRB4 ved hjælp af T4 DNA ligase som anbefalet af fabrikanten til at generere den integrative konstruktion. Indføre ligatur blandingen i E. coli og bekræfte konstruere sekvens.
- Electroporate konstruktion i S. aureus stamme RN4220 som tidligere beskrevet34. Kort sagt, brug 1 µg af plasmid med 70 µL af electro-kompetente celler (100 Ω, 25 µF, og 2,3 kV) i B2 bouillon (1% [w/v] kasein hydrolysat, 2,5% [w/v] gærekstrakt, 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0,5% [w/v] glukose). Vælg erythromycinresistens (Emr) ved den permissive temperatur (30 ° C) på tryptic soja agar (TSA) suppleret med erythromycin (5 µg mL-1) og 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µg mL-1). De resulterende transformants er blå på grund af plasmid-kodede β-galactosidase aktivitet.
Bemærk: Overførsel af DNA i kliniske isolater er yderst vanskelig på grund af en stærk begrænsning-modifikation barriere35. Således blev S. aureus RN4220 brugt som et mellemliggende modtageren af fusion konstruktion fordi det er begrænsning mangelfuld og meget udklappelige. - Overføre plasmid til S. aureus USA300 stamme af interesse ved hjælp af elektroporation eller phage-medieret transduktion36 ved den permissive temperatur. Kort sagt, udbrede Φ11 bacteriophage partikler på donor stamme ved hjælp af TSA plader der indeholder 5 mM CaCl2 natten over ved 30 ° C, og derefter sterilisere ved filtrering gennem et 0,45 µM celluloseacetat sprøjte filter. Brug lysates til at transduce S. aureus stamme LAC til EmRasmussen.
Bemærk: LAC er en meget anvendt klinisk isolat, der blev tidligere gjort Em følsomme af serielle passage i TSB medium til at helbrede stammen af indfødte plasmidet pUSA03, der giver Emr 37,38. - Integrere konstruktionen af to, successive homologe rekombination begivenheder i kromosom som tidligere beskrevet32. Recombinants er chloramphenicol-resistente (Cmr) på TSA plader der indeholder 5 μg mL-1 chloramphenicol, erythromycin-modtagelige (Erms) og ingen længere blå.
Bemærk: Når det er muligt, genindføre den markerede fusion i USA300 via phage-medieret transduktion at undgå akkumulering af mutationer i forbindelse med in vitro-stamme passage39 og temperatur Skift.
2. animalske infektion: Forberedelse af inokulum, systemisk infektion og væv behandling
-
Forberedelse af bakteriel inokulum
- Streak S. aureus stammer af interesse for isolation på blod agar plader fra en frossen glycerol bestand. Der inkuberes ved 37 ° C i 16-24 h at bekræfte hæmolytisk fænotyper baserede på deres evne til at lyse røde blodlegemer (RBC) og form klare gennemsigtige zoner.
- Indlede overnight kulturer ved at vaccinere enkelt kolonier af hver stamme til 4 mL af tryptic soja bouillon (TSB) i sterilt glasrør. Rotere rørene ved 37 ° C i 16-24 h i en tube roller på ca en 70° vinkel og 70 rotationer pr. minut [RPM].
- Bruger et spektrofotometer til måling af ekstinktionen på 600 nm (OD600) af kulturer fra trin 2.1.2. Brug steril medium som en optisk reference (tom). Fortynde disse celler til en OD600 0,05 i 25 ml i sterile Tryptic soja bouillon (TSB) i separat, 125 mL DeLong kolber (5:1 kolbe til volumen-forholdet) og inkuberes kulturer i et vandbad (for ordentlig varmeoverførsel til kulturer), ryste på 280 RPM og sat til 37 ° C.
Bemærk: Væksten i inokulat kan udføres på forskellige måder; en metode til dyrkning af celler til eksponentiel fase er præsenteret. Uanset, er det vigtigt at konsekvent bruger samme metode til forberedelse af celler til podning. - På en OD600 ~ 1, re fortyndes cellerne i frisk medium til en start OD600 på 0,05 at sikre cellerne opnå eksponentiel fase og at faktorer, der ophobes i natten inkubation er blevet reduceret til eksponentiel fase niveauer.
- Høste cellerne i eksponentiel fase (OD600 ~0.6–0.8) ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
- Vask piller to gange i svarer til mængden af sterile 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4).
- Suspendere celler i 1 x PBS (pH 7,4) til en koncentration af 1 x 108 kolonidannende enheder (CFUs) mL-1 eller som passende for den ønskede eksperimentere.
Bemærk: er det vigtigt at bestemme forholdet mellem OD600 og CFU mL-1 for hver stamme af interesse, fordi stamme-afhængige ændringer i Cellestørrelse og form kan påvirke lysspredning egenskaber og i sidste ende, de infektion dosis.
-
Forberedelse af dyr og bakteriel infektion
- Acclimate mus i 7 dage på renset kost AIN-93. Kosten er formuleret til at give tilstrækkelig ernæring samtidig reducere væv auto-fluorescens forbundet med indtagelse af plante-baserede ingredienser, der anvendes i standard mus chow40.
Bemærk: Kvindelige C57/BL6 mus (6-8 uger gamle) er brugt her, men musen stamme og sex vil afhænge af undersøgelsen. - Før infektionen, spile mus hale vener med lunkent vand.
- Inficere dyr ved at indsprøjte 100 µL af den bakterielle inokulum via hale-vener til at producere en systemisk infektion. Gemme en alikvot del af den oprindelige inokulum hvis udfører flowcytometri (Se afsnit 4).
- Overvåge dyr dagligt og evaluere deres helbred status ved hjælp af et system til overvågning gennemgås og godkendes af ens institutionelle Animal Care og brug udvalget.
- Tillad infektion til fremskridt for den ønskede varighed. Her, er eksperimenterne afsluttet 3 dage efter infektionen.
Bemærk: Under disse betingelser består bylder af et stafylokokker absces bakterier, omsluttet af fibrin aflejringer, og omgivet af koncentriske lag af immunceller5,41.
- Acclimate mus i 7 dage på renset kost AIN-93. Kosten er formuleret til at give tilstrækkelig ernæring samtidig reducere væv auto-fluorescens forbundet med indtagelse af plante-baserede ingredienser, der anvendes i standard mus chow40.
-
Høst af organer og væv behandling
- Aflive dyr af CO2 indånding og cervikal dislokation som en sekundær metode og foretage obduktion.
- Høste nyre (højre) og andre vitale organer (hjerte, lever, lunger, milt) og overføre til 15 mL polypropylen rør indeholdende 10% [v/v] buffered formalin. Gå videre med disse organer til at træde 2.3.4 nedenfor.
- Overføre den venstre nyre til en steril 2 mL slagfast rør indeholdende ~ 500 µL af 2 mm silica perler og 1 mL sterilt 1 x PBS (pH 7,4). Fortsæt med dette organ til trin 4.2.
- Tillad organer fra trin 2.3.2 at fastsætte i mørke ved stuetemperatur med blid ryster eller rotation i mindst 24 timer men ikke mere end 48 timer.
- Integrere organer i klare væv frysning medium og gemme væv ved-80 ° C.
- Ved hjælp af en kryostaten, afsnit væv i skiver 10 µm tykkelse.
- Tørre sektioner på forhånd renset, ladede glas dias i 20 min. i mørke, anvende hård montering medium med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pletten, og anvende coverslip. Helbrede monterede dias ved rumtemperatur natten over, og overføre til 4 ° C til langtidsopbevaring.
3. laser Scanning Konfokal mikroskopi og billedbehandling
- Undersøge monterede dias for at finde læsioner ved hjælp af lasere passende for fluorescerende reporter bliver brugt. I dette tilfælde, grøn (NGL), rød (tdTomato) og blå (DAPI) Fluorescens bruges signaler.
- Erhverve den billed benytter den passende mål til at visualisere individuelle celler (f.eks. typisk 20 x eller 40 x mål bruges).
-
Måle fluorescens intensiteter i Konfokal billeder.
- Åbn Konfokal billedet i Image Jørgensen og justere lysstyrke og kontrast for at korrekt visualisere fluorescens signal af læsion.
- Definere området af interesse, og ved hjælp af indstillingen tærskel , sætte de nedre og øvre fluorescens grænser som nødvendigt.
- Definere barycentrum ved at vælge område → grå middelværdien → barycentrum → begrænse til tærskel under fanen analyser i billedet J.
- Uddrag barycentrum fluorescens intensitetsværdien eller måle den gennemsnitlige fluorescens intensitet i en given læsion pr. arealenhed (gennemsnitlig fluorescens intensitet, MFI) for normal god landbrugspraksis og tdTomato. Her, blev områder af én µm2 brugt.
Bemærk: En blindet anden analyse minimerer bias, når prøven identitet er kendt. - Plotte data og udføre de relevante statistiske analyser for hver sammenligning.
4. flow flowcytometri analyse
-
(Valgfrit) Bestemme fusion aktivitet af inokulat på dagen for infektion (fra afsnit 2.2.3)
- Til 899 µL 1 x steril PBS (pH 7,4) tilsættes 100 µL af hver inokulum og 1 µL af membran permeant nukleinsyre pletten (Se Tabel af materialer). Som kontrol, være sikker på at inkludere en prøve mangler nukleinsyre pletten.
- Udføre flowcytometri på alle prøver.
Bemærk: For det første eksperiment er det nyttigt at medtage en vektor eneste kontrol for fusion af interesse til at bestemme den korrekte spænding til at bruge. En klar adskillelse mellem positive og negative prøver er afgørende for dataanalyse, med angivelse af journalisten er langt over baggrunden signal. - For at identificere den bakterielle befolkning, plot begivenheder ved hjælp af nukleinsyre pletten (y-aksen) og videresende scatter (x-akse).
- Tegne en optagelse gate omkring hændelser, der er både nukleinsyre pletten positive og den korrekte størrelse af bakterien baseret på den forward scatter (mellem 0,5 til 2,0 µm af S. aureus).
Bemærk: Være streng at identificere denne befolkning, som det er afgørende at omfatte begivenheder, der er klart inden for disse parametre. Sørg for denne gate udelukker alle begivenheder for de negative kontroller under andre betingelser. I denne undersøgelse, ca 70% befolkningens celle opfyldt disse krav i analysen.
-
Analyse af vævsprøver efter ofre:
- Aflive dyrene, høste venstre nyrerne (Se trin 2.3) og overførsel til perle-slå rør indeholdende 1 mL af 1 x steril PBS (pH 7,4) og 250 µL af 2 mm borosilicate perler.
- Forstyrre væv for at frigive bakterieceller. For nyrer, skal du bruge en homogeniseringsapparat til at forstyrre celler. Her blev tre 30 s brister ved 6800 omdr. / min. med 1 min. køling perioder på våde is mellem cyklusser brugt til at minimere varme prøver.
- Pellet større væv resterne af centrifugering ved 250 x g i 3 min. i en bordplade microcentrifuge nedkøles til 4 ° C.
Bemærk: Der er typisk en celle pellet i bunden af røret og et lag af flydende snavs på toppen. Den midterste vandige lag indeholder de bakterieceller. - Overføre 10 µL af den vandige lag ind i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende 1 µL af nukleinsyre pletten i 989 µL af PBS (total volume 1 mL).
- Udføre flowcytometri ved hjælp af de samme data erhvervelse parametre og gating som for de oprindelige inocula.
Bemærk: Bakteriel celletal vil være meget lav, fordi prøven hovedsagelig indeholder væv debris. Indstillingen "Live gate" kan også bruges, hvis cellerne nukleinsyre pletten positive og størrelse-gated, når data indlæses i programmet. Dette vil også bidrage til at analysere flere af hændelserne mål og reducere filstørrelsen. Næsten en million begivenheder pr. sample tælles, men mere begivenhed tæller kan være nødvendige afhængigt af sværhedsgraden af infektionen og størrelse af væv analyseres. - Dataanalyse: Bestemme, betyde fluorescerende intensitet (MFI) for hver fluorophore i en given prøve ved hjælp af integration porte bestemt i afsnit 4.1.4. Normalisere prøver i flow analyse software til begivenheden tæller. 10.000 tæller er normalt tilstrækkelig i analysen.
Bemærk: Det er ikke ualmindeligt at finde eksempler, der indeholder mindre end dette antal hændelser, da dette er afhængig af absces dannelse og infektion sværhedsgrad. Brug denne fremgangsmåde, 500-40.000 findes begivenheder typisk i inficeret væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udviklede et plasmid, afledt af pMAD32 , der kan levere en reporter fusion konstruktion i kromosom af dobbelt crossover homologe rekombination (figur 1). Denne konstruktion giver mulighed for kvantitativ analyse af enhver regulerende region, der understøtter produktionen af normal god landbrugspraksis protein og fluorescerende signal over baggrunden. Plasmidet giver ampicillin-resistens (Apr) for vedligeholdelse og formering i E. coli og giver erythromycinresistens (EmRasmussen) i S. aureus. Konstruktionen giver også chloramphenicol modstand (Cmr), som giver mulighed for nem overførsel af integrerede reporter fusion mellem forskellige mutantstammen for avancerede genetiske analyser i S. aureus.
Som bevis for princip, vi smeltet nuc regulerende region til normal god landbrugspraksis. nuc blev valgt fordi dens gen produkt er nødvendige for fuld virulens og er nødvendige for at begrænse makrofager fra S. aureus -induceret bylder42, 43. Konstruktionen var integreret i kromosomet som beskrevet i trin 1,4 1,6 i protokollen. Den integrerede fusion blev derefter overført til AH3926, der indeholder en PsarAP1- tdTomato fusion. SarA P1 promotor har vist tidligere at være constitutively aktive44 og således etiketter alle celler.
Først har vi bekræftet, at reporter fusions var aktiv under in vitro ryste kolben vækst i Tryptic soja bouillon (TSB, et rige, komplekse medium) og at fluorescens var over den cellulære auto-fluorescerende baggrund (figur 2). For at bestemme, hvordan de fluorescerende journalister opfører sig in vivo, var en modificeret renal absces model brugte5. Grupper af C57BL/6 hunmus blev udfordret intravenøst med 1 x 107 CFU af S. aureus LAC celler mangler reporter fusioner eller LAC celler transporterer både nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato fusioner. Dyrene blev ofret tre dage efter infektion. Derefter, høstet organer blev fastsat i 10% [v/v] buffered formalin, cryo-snit, og afbildet af Konfokal mikroskopi efter DAPI farvning som beskrevet i trin 2 og 3 (fig. 3A, B). Billederne blev analyseret ved hjælp af billede Jørgensen og fluorescens pr. arealenhed i de renale læsioner blev målt. Som vist i figur 3C, var NUK-normal god landbrugspraksis fusion fluorescens i gennemsnit næsten 9-fold højere i celler transporterer fusion end i celler ikke transporterer reporter fusion; den sidstnævnte signal udgør detektionsgrænsen (auto-fluorescens) (Sammenlign nuc-sGFP til LAC). Ligeledes PsarAP1- tdtomato fusion fluorescens var ~ 6-fold højere end ingen reporter kontrol (figur 3E, sammenligne sarAP1- tdT vs LAC). Brug flowcytometri, mønster af reporter aktiviteter blev bekræftet ved hjælp af nyre homogeniseret og flow flowcytometri som beskrevet i trin 4, selvom folden forskelle i fluorescens var lavere (figur 3D, F).
Interessant, syntes fluorescens data fra læsioner udgøres af celler transporterer fluorescerende reporter fusions at vise større variation end dem, der mangler reportere. Vi spekulerede på, om variationen i fluorescens målinger observeret skyldtes heterogene udtryk for journalister (det er af biologisk oprindelse). ~ 100 µm afstand konstateredes det, at nogle læsioner udtrykt én eller begge journalister (figur 4). Vigtigere, undersøge reporter aktivitet med enkelt celle opløsning i stafylokokker absces Fællesskaber (sække) afslørede rumlige regulering af nuc udtryk i bylder afgrænset med stærk DAPI farvning, sandsynligvis forbundet med den dannelsen og frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (figur 5A-C)45. For eksempel, målte vi betydeligt højere nuc-sGFP fusion fluorescens i den indre kerne af SAC sammenlignet med periferien (figur 5B, E). I den samme absces, mønster til sarAp1-tdTomato fusion fluorescens syntes at være omvendt (fig. 5D). Mønstret var dog ikke statistisk signifikant, ved hjælp af det samme antal dyr (figur 5F).
Figur 1 : Skematisk gengivelse af genom Integrativ reporter plasmidet pRB4. Plasmidet pRB4 er et derivat af pMAD med en temperatur følsom oprindelse af replikering i S. aureus (Ori pE194ts). Der er tre drug resistance markører: (i) bla, giver resistens over for ampicillin i Escherichia coli; (ii) ermC, overdrage erythromycinresistens i S. aureus; og (iii) kat, giver resistens for chloramphenicol i S. aureus. Reporter konstruktion er flankeret af ~ 500 bp fra de opstrøms og nedstrøms sekvenser af pseudogene SAUSA300_0087 (reference genom: FPR3757) for dobbelt crossover homologe rekombination og genom integration. sGFP, grøn fluorescerende proteiner gen; CS, kloning websted; TT, stærk tovejs transcriptional terminator. Tallet er ikke til skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Jeg ntegrated NUK-sGFP og sarAp1-tdTomato journalister er kommet til udtryk under in vitro-vækst . S. aureus LAC celler (wild-type [WT]), med og uden (A) nuc -sGFP eller (B) sarAp1-tdTomato journalister) var vokset til eksponentiel fase i TSB og re fortyndet i samme medium. Optisk densitet (OD) og fluorescens blev målt ved de angivne ekstinktion værdier. Baggrund-trækkes fluorescens intensitetsværdierne (excitation/emission: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) blev delt af ekstinktionen værdier til at generere Relative fluorescens enheder. Dataene er middel +/-SEM fra to uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Fluorescerende reportere er synlige i nyre væv. Grupper af 13 C57BL/6 mus blev udfordret intravenøst med LAC celler eller LAC celler transporterer både nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato (tdT), og infektionen fik lov til at fortsætte i tre dage. Mus blev aflivet, og organer blev behandlet som beskrevet i trin 2 og 3 i protokollen. Repræsentative nyre afsnit viser flere læsioner og den tilknyttede fluorescens for (A) nuc-sGFP og (B) sarAp1-tdTomato. Skalere barer = 250 µm (10 x mål). Den Relative fluorescens enheder pr. arealenhed (RFU [μm2]-1) forbundet med renal læsioner blev målt ved hjælp af billedanalyse, som beskrevet i trin 3.3 og blev afbildet (C) nuc-sGFP og (E) sarAp1-tdTomato; hver prik repræsenterer en læsion og angiver median; 3-5 læsioner analyseret pr. mus. Analyse af handelsstrømmen flowcytometri (D) nuc-sGFP og (F) sarAp1-tdTomato fusion fluorescens i bakteriel populationer isoleret fra inficerede nyre homogeniseret tre dage efter infektion. Betyde fluorescens intensitet (MFI) er angivet med en solid bar, og hver prik er en nyre. LAC, reporterless vildtype stamme. Statistik: Mann-Whitney Test; p < 0,05. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. Excitation bølgelængder for fluorescens-kanaler er som følger: DAPI, 405 nm; Normal god landbrugspraksis, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Udsendte fluorescens data blev indsamlet over en vifte af bølgelængder: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Bylder udstille variable udtryk for journalister i nyre væv. Grupper af 13 C57BL/6 mus blev udfordret med 1 x 107 CFU af S. aureus -celler via hale-vene. Dyrene var aflivede tre dage efter infektion. Nyrerne er høstet, faste, og sektioneret til fluorescens mikroskopi (40 x mål) som beskrevet i trin 2 i protokollen. Vist er tre læsioner i tæt nærhed med varierende niveauer af (A) nuc-sGFP og (B) sarAp1-tdTomato fluorescens. (C) nukleinsyre fra stafylokokker og vært celler er anførte af DAPI farvning. I grøn og rød kanaler flettes i (D). Tilsvarende resultater blev set i andre sektioner. Billederne er anskaffet ved hjælp af en 40 x mål; Skalalinjen = 25 µm. Excitation bølgelængder for fluorescens-kanaler er som følger: DAPI, 405 nm; Normal god landbrugspraksis, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Udsendte fluorescens data blev indsamlet over en vifte af bølgelængder: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : NUK-sGFP reguleres rumligt i stafylokokker absces mikro-miljø. Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) billeder af en stafylokok absces Fællesskabet (SAC) læsion produceret af S. aureus stamme LAC regnskabsmæssige nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato reporter fusioner. Vist er (A) fusionerede kanaler til nuc-sGFP og sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP fluorescens (grøn), (C) DAPI farvning af nukleinsyrer (blå), og (D) sarAp1-tdTomato fluorescens (rød). Stjerner angiver celler i core (barycentrum) og pilene angiver celler i periferien. Fluorescens intensiteter for (E) nuc -sGFP og (F) sarAp1-tdTomato er vist for celler i den kerne og periferien af SAC. Excitation bølgelængder for fluorescens-kanaler er som følger: DAPI, 405 nm; Normal god landbrugspraksis, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Udsendte fluorescens data blev indsamlet over en vifte af bølgelængder: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Dataene er afledt fra 8 nyrerne (én pr. mus), og 1-2 læsioner blev afbildet fra hver nyre. Angiver median. Stiplet linje, påvisningsgrænse. Statistik: Normal fordeling af data, Student's t-test (parrede), ***p < 0,05. (Skalalinjen = 20 µm; gælder for alle billeder.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriel smitsomme sygdomme er et stigende sundhedsproblem over hele verden på grund af erhvervelse af antibiotikaresistens determinanter46. Fordi tilpasning til værtsmiljøer er afgørende for vækst og overlevelse under infektion, strategier rettet mod gen udtryk programmer, der øger patogen fitness kan vise sig nyttige terapeutisk. Et sådant program er sæt af gener kontrolleret af SaeR/S to komponent system (TCS), vist tidligere at spille en afgørende rolle i immunforsvaret unddragelse47. SaeR/S er foranlediget af en række faktorer, især dem der er forbundet med neutrofiler8,20. Under infektion fremkalder S. aureus en kraftig inflammatorisk respons som neutrofiler og andre fagocytter rekrutteres til stedet, hvor infektion2. Flydendegørelse nekrose og fibrin deposition følge, danner en byld for at forhindre yderligere væv skader48. Inden for disse immun privilegeret websteder bruge S. aureus celler en række Sae-afhængige genprodukter til at omprogrammere bylden for at lette bakteriel multiplikation5,48. En Sae-afhængige gen, nuc, koder for nukleasen og metabolizes redskaber til at producere 2'-deoxyadenosine for at dræbe makrofager43. NUK er således et vigtigt udskilles enzym, der er afgørende for fuld virulens42 og udtrykt i vivo (figur 3, figur 4og figur 5).
Selv om virulens faktorer af S. aureus har været studeret grundigt, er hvordan bakterien vokser i værtslandet et forsømt område, som er at forstå hvordan dens fysiologi er reguleret under infektion. Her beskriver vi en metode for sondering bakterielt gen udtryk og adfærd på det enkelte celle niveau ved hjælp af en modificeret Integrativ vektor, der afbøder bekymring for plasmid tab i fravær af udvalg. Vores metode giver mulighed for direkte visualisering af genekspression i bylder uden at skulle permeabilize cellevægge og uden behov for antistoffer og mærkning. Vi opdaget stærke udtryk for nuc-sGFP fusion samt sarAp1-tdTomato fusion i renal absces sække dannet af wild-type celler tre dage efter infektion i en akut systemisk infektion model. Forsøgets udformning kan dog ændres for at besvare spørgsmål vedrørende genekspression i andre steder. Faktisk, fordi C57BL/6 mus er i stand til at klare S. aureus fra deres væv, bakterier invadere forskellige anatomiske steder herunder knogler (knogler og led) og hjernen, hjertet, milten og leveren, alle har forskellige fysiologi og nærende egenskaber5,49. Således kan meget læres ved hjælp af S. aureus for at sonde arten af værten væv. Det er vigtigt at bemærke, at det er kendt, at visse vært nicher er hypoksiske i naturen eller ellers udviser en stærk ilt gradient50. Fluorescerende proteiner kræver Molekylær ilt til aktivitet, og nogle er mere følsomme over for ilt delvis pres end andre51. Mens vi se fluorescens signal dybt inde i bylden, omfanget kan være en undervurderes. Brug codon-optimeret fluorescerende proteiner er udviklet til brug i Clostridium difficile kan bruges til at afbøde denne bekymring52. Et andet punkt at bemærke er, at de fluorescerende proteiner (sGFP og tdTomato) produceret af reporter stammer anvendes i denne undersøgelse er stabil. Derfor afspejler de fluorescerende data ophobning i løbet af eksperimentet snarere end en nylig svar. Generere en konstruktion, der indeholder en ustabil sGFP eller tdTomato gen ville i høj grad øge nytten af systemet for dynamisk eksperimenter.
Reporter systemet beskrevet her sørger et kraftfuldt værktøj til at kvantitativt studie gen forordning in vitro- og in vivo. Fordi reporter opretholdes i ét eksemplar på kromosom, er systemet velegnet til stærkt udtrykte gener, (det er, at have høje promotor aktivitet). Biosyntetiske gener eller andre kærlig udtrykte gener kan ikke være synlig, fordi niveauet af fluorescens udtryk kunne falde under grænsen på opdagelse eller baggrunden auto-fluorescens. Det er kendt, at ribosomet bindingssted (RBS) påvirker aktiviteten af reporter fusions33. En mulig løsning på dette problem er at bruge et stærkere RBS såsom oversættelse indledningen region (TIR)53 eller at integrere tandem kopier af initiativtagerne af interesse i kromosomet. Alternativt kunne stabilt multi kopi plasmider være brugt54.
En begrænsning af den beskrevne metode er, at i modsætning til en cDNA forberedelse fra RNA ekstraheret fra væv, et relativt lille antal gener kan være afhørt samtidigt (begrænset af tilgængelig fluorescerende kanaler uden spektrale overlapning). Men hvad er opnået kan være potentielt mere informative. qRT-PCR og andre udlæsninger, at den gennemsnitlige hovedparten befolkningen er i stand til at fange befolkning heterogenitet på infektionsstedet. Ja, vi observeret heterogenitet i niveauet af nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato udtryk mellem absces læsioner i umiddelbar nærhed (figur 4). Dette er lig hvad blev for nylig rapporteret af Cassat et al. 55 på dette tidspunkt, oprindelsen af denne forskelligartethed er ikke kendt. Men næringsstoftilgængelighed, variabel induktion af næringsstof erhvervelse systemer eller andre vært faktorer kan muligvis forklare fænomenet. Desuden opstår vært-patogen interaktion inden for microenvironments af organer eller bylder, der har komplekse tredimensionale struktur og forskellige celletyper. Inden for disse strukturer, kan væv varierer betydeligt med hensyn til pH, osmolaritet, iltning og næringsstoftilgængelighed, et fænomen kendt som metaboliske zonation56,57. Serendipitously opdagede vi, at et mønster af rumlige forordning opstår i wild-type celler bosat i byld (figur 5). Dette er til vores viden første observation af sin art i en Gram-positive patogenet under infektion. Den rumlige forordning rapporteret her er lig den, fremstillet ved Davis et al. som indeholder microcolonies af Gram-negative patogenet Yersinia pseudotuberculosis58i milt væv. I dette tilfælde, vært produceret nitrogenoxid (NO *) stimuleret produktionen af nitrogenoxid dioxygenase (Hmp) i celler i periferien af microcolony tættest på den spreder NO *, besparende interiør celler behovet for at fremkalde udtryk af hmp. I stafylokokker bylder er nuc udtryk stærkeste kernen af SAC, og svageste langs periferien. Fordi bylder er omgivet af en manchet af neutrofiler, er det fristende at spekulere at neutrofile-afledte stikord er vejledende funktionsmåden for stafylokokker, polariserende cellerne i to fænotype adskilte populationer minder om morphogenic forordning om differentiering under udvikling i højere liv59. Den mekanistiske understøttelse af dette mønster er ukendt og er genstand for en intens undersøgelse i vores laboratorium.
Vi mener, at vores metode giver et effektivt redskab til at studere de fine detaljer af genekspression i enkelte celler under infektion. Metoden giver en unik mulighed for at observere og til sidst forstår de fysiologiske oprindelse af heterogenitet og rumlige mønstre af genekspression i væv. Denne heterogene adfærd skal tages hensyn ved udviklingen af nye behandlingsmodaliteter, som kun en delpopulation af celler (dvs., de giver udtryk for gener) kan blive ramt af den terapeutiske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takke Alexander Horswill til PsarAP1- tdTomato fusion, og Karen Creswell gave til hjælp med flow flowcytometri analyse. Vi takker også Alyssa King for rådgivning om statistisk analyse. Dette arbejde var delvis finansieret af en NIH sonderende/udviklingsmæssige Research Award (grant AI123708) og Fakultet start midler til SRB. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at sende arbejdet for publikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lowy, F.
- Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
- Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
- Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
- Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
- Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
- Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
- Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
- Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
- Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
- Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
- Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
- Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
- Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
- Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
- Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
- Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
- Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
- Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
- Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
- Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
- Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
- Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
- Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
- Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
- Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
- Novick, R. P.
- Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
- Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
- Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
- Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
- Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
- Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
- Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
- Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
- Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
- Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
- Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
- Bose, J. L.
- Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
- Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
- Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
- Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
- Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
- Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).
