विकासशील माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के utero transduction में के बाद ultrastructural neuroplasticity मापदंडों का आकलन
Summary
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन और utero में पारक्रमण विकास के दौरान तंत्रिका तंत्र की ठीक ultrastructure में रूपात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है. इस संयुक्त विधि संरचनात्मक विवरण में परिवर्तन में गहरी अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है उनके स्थलाकृतिक प्रतिनिधित्व के संबंध में neuroplasticity अंतर्निहित ।
Abstract
वर्तमान अध्ययन संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ utero पारक्रमण में जोड़ती है (उनि) असंदिग्ध पहचान की स्थलाकृतिक संरचनाओं में ultrastructural मापदंडों का एक सटीक morphometrical विश्लेषण पर लक्ष्य, ब्याज की एक प्रोटीन से प्रभावित जिसे वायरल ट्रांसफर के जरिए जीव में पेश किया जाता है । यह संयुक्त दृष्टिकोण स्थूल संरचनात्मक से एक ऊतक एटलस में स्थलाकृतिक नेविगेशन नक्शे का पालन करके ultrastructural पहचान के लिए एक चिकनी संक्रमण के लिए अनुमति देता है । में-utero ट्रांसड्यूड ऊतक के उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी न्यूरोपिल के ठीक ultrastructure और इसके plasticity मापदंडों, इस तरह के पार खोदी synaptic bouton क्षेत्रों के रूप में पता चलता है, synaptic vesicles और mitochondria की संख्या के भीतर एक bouton प्रोफ़ाइल, synaptic संपर्कों की लंबाई, पार खोदी axonal क्षेत्रों, माइलिन sheaths की मोटाई, माइलिन lamellae की संख्या, और क्रॉस-खोदी क्षेत्रों mitochondria प्रोफाइल. इन मापदंडों के विश्लेषण तंत्रिका तंत्र है कि आनुवंशिक निर्माण के वायरल हस्तांतरण से प्रभावित होते है के क्षेत्रों में ultrastructural plasticity के परिवर्तन में आवश्यक अंतर्दृष्टि से पता चलता है । इस संयुक्त विधि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जैव अणु और/न्यूरोनल plasticity पर दवाओं के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी न्यूरोनल plasticity के utero बचाव में अध्ययन करने के लिए संभावना को खोलता है (जैसे, के संदर्भ में न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां) ।
Introduction
कोई फोटॉन एक इलेक्ट्रॉन की गहराई ग्रेड में एक ultrathin ऊतक नमूना घुसना कर सकते हैं । यह प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक की तुलना में ठीक संरचनाओं के नैनोमीटर संकल्प छवियों पर कब्जा करने में उनि के लिए अमूल्य लाभ का श्रेय । उदाहरण के लिए, उनि, मिटोकॉन्ड्रिया, मेलानोसोम और विभिन्न प्रकार के स्रावी granules, माइक्रोट्यूब्यूल्स, माइक्रोफिलामेंट्स, सिलिया, माइक्रोविली, और इंटरसेलुलर जंक्शन जैसे इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनेल्स के दृश्य के लिए अनुमति देता है (सेल सतह specializations), तंत्रिका तंत्र में विशेष synapses में1,2,3,4. वर्तमान methodological अध्ययन के समग्र लक्ष्य के राज्य-के-the-कला तकनीकों के संयोजन से जंम के पूर्व हस्तक्षेप पर विकास के दौरान तंत्रिका plasticity में परिवर्तन के ultrastructural मांयता है utero पारक्रमण और उनि में । ब्याज की वायरल एन्कोडेड प्रोटीन, रीढ़ की हड्डी6सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र5,6,7, में यूटरो में ट्रांसड्यूड किया गया है । उदाहरण के लिए, यूएनटी के साथ संयोजन में utero पारक्रमण में सेल आसंजन अणु l1 में मोटर सीखने plasticity के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है l1-कमी चूहों में, विशेष रूप से l1 और परमाणु रिसेप्टर प्रोटीन के बीच परस्पर क्रिया के संबंध में अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स में7.
neuroplasticity मापदंडों के विश्लेषण तंत्रिका तंत्र के भीतर सबसे छोटे क्षेत्रों के स्थानीयकरण के बारे में सटीक जानकारी की आवश्यकता है. इसलिए, यह अन्य संरचनाओं के संबंध में अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरण और उनके सटीक स्थलाकृतिक अभिविन्यास का वर्णन करने के लिए पर्याप्त है । वर्तमान अध्ययन में, प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी दोनों के आधार पर विशिष्ट रूपात्मक क्षेत्रों की विस्तृत जांच का लक्ष्य एक विशेष तैयारी पद्धति प्रस्तुत की गई है । इस दृष्टिकोण ऊतक हेरफेर के कई तकनीकों को जोड़ती है, माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के यूट्रो पारक्रमण में के साथ शुरू करने और छिड़काव निर्धारण, मोल्ड embedding, और उनि के लिए ऊतक प्रसंस्करण द्वारा पीछा किया । एक आवश्यक कदम embedding और उनि के लिए ऊतक के प्रसंस्करण के बीच शामिल ऊतक के प्रलेखन है, का उपयोग कर हस्तक्षेप प्रकाश प्रतिबिंब तकनीक है कि सटीक microphotographic और कम आवर्धन प्रलेखन के लिए अनुमति देता है ऊतक8,9,10नमूनों । वर्तमान दृष्टिकोण में शामिल, इस तकनीक के शोधकर्ताओं ने तंत्रिका ऊतक सतहों के स्थलाकृतिक और संरचनात्मक विवरण की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है और नमूना स्लाइस प्रोफाइल के लिए उनकी तैयारी के लिए पहले ।
पूरे दिमाग को सेक्शनिंग के लिए एक विशेष फ्रेम stereotaxic निर्देशांक से मेल खाती है । इस फ्रेम के रूपात्मक तीन आयामी लाभ (3 डी) तंत्रिका ऊतक में क्षेत्रों के पुनर्निर्माण और रूपात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कल्पना वर्गों के macrographs स्थलाकृतिक निर्देशांक आवंटित कर रहे हैं, और प्रश्नपत्र गिने वर्गों एक ऊतक एटलस में नक्शे का निर्माण ।
राल प्रसंस्करण के बाद, एम्बेडेड ऊतक ultrathin वर्गों में खोदी है (< 70 एनएम) चयनित क्षेत्रों से युक्त, उपर्युक्त ऊतक एटलस के नक्शे के अनुसार. ultrathin वर्गों के लिए उनि के अधीन है उच्च plasticity मापदंडों के संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए (जैसे, क्रॉस-अनुभाग synaptic बूटोंस या axonal फाइबर के क्षेत्र प्रोफ़ाइल क्षेत्रों) अपनी सामग्री और संपर्कों के परिसर के भीतर पड़ोसी संरचनाओं के लिए न्यूरोपिल.
विधि के साथ साथ वर्णित है, सूक्ष्म और nanostructures के लिए कल्पना macrostructures से चिकनी संक्रमण की अनुमति देता है तुलनात्मक में गहराई से अध्ययन रूपात्मक न्यूरोनल plasticity के utero पारक्रमण में विकासशील तंत्रिका के बाद प्रणाली.
Protocol
Representative Results
Discussion
के एक महत्वपूर्ण कदम में utero पारक्रमण इंजेक्शन प्रक्रिया है । मस्तिष्क निलय में सटीक इंजेक्शन या ब्याज की एक और क्षेत्र में अनुभव और हाथों पर कौशल की आवश्यकता है । पतले microcapillary टिप, कम ऊतक क्षति हो सकती है; ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों चिकित्सा संकाय में पशु सुविधा के सहयोगियों का शुक्र है, ruhr-विश्वविद्यालय bochum, उनके समर्थन और पशु देखभाल के लिए ।
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
