Kombinationen af transmissions elektronmikroskopi og i livmoderen transduktion er en kraftfuld tilgang til at studere morfologiske ændringer i den fine ultrastruktur af nervesystemet under udvikling. Denne kombinerede metode giver dyb indsigt i ændringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticitet med hensyn til deres topografiske repræsentation.
Den nuværende undersøgelse kombinerer i livmoderen transduktion med transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) sigter mod en præcis morphometrical analyse af ultrastrukturelle parametre i entydigt identificeret topografiske strukturer, ramt af en protein af interesse der er indført i organismen via viral overførsel. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for en glidende overgang fra macrostructural til ultrastrukturelle identifikation af følgende topografiske navigationskort i et væv atlas. Høj opløsning elektronmikroskopi af i-utero-transduced væv afslører den fine ultrastruktur af neuropil og dets plasticitet parametre, såsom cross-sectioned synaptic bouton områder, antallet af synaptiske vesikler og mitokondrier inden for en Bouton profil, længden af synaptic kontakter, cross-sectioned cytoskeletale områder, tykkelsen af myelin skeder, antallet af myelin lamellae, og cross-sectioned områder af mitokondrier profiler. En analyse af disse parametre afslører afgørende indsigt i ændringer af ultrastrukturelle plasticitet i de områder af nervesystemet, der er berørt af den virale overførsel af den genetiske konstruktion. Denne kombinerede metode kan ikke kun bruges til at studere den direkte virkning af gensplejsede biomolekyler og/eller narkotika på neuronal plasticitet, men også åbner mulighed for at studere i livmoderen redning af neuronal plasticitet (f.eks. i forbindelse med neurodegenerative sygdomme).
Ingen foton kan trænge en ultratynde væv modellen i dybde grade af en elektron. Dette tilskriver uvurderlige fordele til TEM erobre nanometer opløsning billeder i fine strukturer i forhold til lysmikroskopi teknikker. For eksempel, TEM giver mulighed for visualisering af intracellulære organeller som mitokondrier, melanosomer og forskellige typer af sekretorisk granulat, mikrotubuli, microfilaments, cilia, microvilli og intercellulære vejkryds (cellens overflade specialer), navnlig synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede mål med de nuværende metodiske undersøgelse er ultrastrukturelle anerkendelse af ændringer i neural plasticitet under udvikling ved prænatal interferens ved at kombinere de state-of-the-art teknikker i livmoderen transduktion og TEM. Viralt kodede proteiner af interesse har været transduced i livmoderen i det centrale nervesystem5,6,7, herunder rygmarven6. For eksempel, er i livmoderen transduktion i kombination med TEM blevet brugt til at studere effekten af celle vedhæftning molekyle L1 på motordrevne læring plasticitet i L1-mangelfuld mus, navnlig med hensyn til samspillet mellem L1 og nukleare receptorproteiner i cerebellare neuroner7.
Analyse af neuroplasticitet parametre kræver præcise oplysninger om lokaliseringen af de mindste områder inden for nervesystemet. Derfor er det passende at beskrive ultrastrukturelle detaljer og deres nøjagtige topografiske orientering med hensyn til andre strukturer. I den foreliggende undersøgelse præsenteres en forberedende metode med henblik på en detaljeret undersøgelse af særskilte morfologiske områder baseret på både lys og elektronmikroskopi. Denne metode kombinerer flere teknikker til væv manipulation, begyndende med i livmoderen transduktion af musen hjernen og rygmarven og efterfulgt af perfusion fiksering, skimmel-indlejring, og behandling af væv til TEM. Et væsentligt skridt mellem integrering og behandling af væv til TEM er dokumentation af væv, ved hjælp af interferens lysrefleksion teknik, der giver mulighed for præcis microphotographic og lav forstørrelse dokumentationen af væv prøver8,9,10. Indarbejdet i den nuværende fremgangsmåde, denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge topografiske og strukturelle detaljer af nervevæv overflader og modellen skive profiler inden deres forberedelse til TEM.
En særlig ramme for skæring hele hjerner svarer til stereotaxisk koordinater. Denne ramme fordele morfologiske tredimensionale (3D) genopbygning af områder i nervevæv og kan bruges til morfometrisk analyse. Macrographs af sektionerne visualiseret tildeles topografiske koordinater, og de seriefremstillede nummererede afsnit bygge kort i et væv atlas.
Efter harpiks behandling, den indlejrede væv er opdelt i ultratynde sektioner (< 70 nm) der indeholder udvalgte områder, ifølge maps af ovennævnte væv atlas. De ultratynde afsnit udsættes for TEM at opnå høj opløsning billeder af plasticitet parametre (f.eks. tværsnit profil områder af synaptic boutons eller cytoskeletale fibre) af deres indhold og kontakter til nærliggende strukturer inden for komplekset neuropil.
Med den metode beskrevet heri, tillader overgangen fra visualiseret macrostructures til mikro- og nanostrukturer sammenlignende grundige undersøgelser af morfologiske neuronal plasticitet efter i utero transduktion af udviklingslandene nervøs system.
Et afgørende skridt for in utero transduktion er proceduren injektion. Den præcise injektion i hjernens ventrikler eller i et andet område af interesse kræver erfaring og praktiske færdigheder. Jo tyndere microcapillary spids, de mindre vævsskade kan forekomme; Dette er dog på bekostning af stigende indsprøjtning pres. I modsætning til i livmoderen elektroporation19,20,21,22, overlevel…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke kolleger af det animalsk facilitet på det medicinske fakultet, Ruhr-Universität Bochum, for deres støtte og dyrs pleje.
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
electric shaver | Phillips | – | |
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
eye lubricant | Bepanthene | – | |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
razor blades | Schick | 87-10489 | |
Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |