Vurdering av Ultrastructural Neuroplasticity parametere etter i Utero signaltransduksjon utvikle musen hjernen og ryggmarg
Summary
Kombinasjonen av overføring elektronmikroskop og i livmoren signaltransduksjon er en kraftig tilnærming for å studere morfologiske endringer i den fine ultrastructure av nervesystemet under utvikling. Denne kombinerte metoden gir dyp innsikt i endringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticity med hensyn til deres topografiske representasjon.
Abstract
Studien kombinerer i livmoren signaltransduksjon med overføring elektronmikroskop (TEM) sikte på en presis morphometrical analyse av ultrastructural parametere i entydig identifisert topografiske strukturer, påvirket av et protein av interesse som er innført i organismen via viral overføring. Dette kombinert tilnærming gir en myk overgang fra macrostructural til ultrastructural identifikasjon av følgende topografiske navigasjonskart i en vev atlas. Høyoppløselig elektronmikroskop av i-utero-transduced vev avslører den fine ultrastructure av neuropil og plastisitet parameterne, som kryss-delt synaptic bouton områder, antall synaptic blemmer og mitokondrier innenfor en Bouton profil, lengden på synaptic kontakter, kryss-delt axonal områder, tykkelsen på myelin sheaths, antall myelin lamellae, og kryss-delt områder av mitokondrier profiler. Analyse av disse parameterne avslører viktig innsikt i endringer av ultrastructural plastisitet i områdene av nervesystemet som berøres av viral overføring av genetiske Konstruer. Denne kombinerte metoden kan ikke bare brukes for å studere den direkte effekten av genmodifiserte biomolecules og/eller narkotika på neuronal plastisitet, men åpner også muligheten til å studere i livmoren redning av neuronal plastisitet (f.eks i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer).
Introduction
Ingen Foton kan trenge en supertynn vev prøven i dybden klasse til et elektron. Dette attributtene uvurderlig fordeler til TEM fange nanometer oppløsning av fine strukturer sammenlignet med * lys teknikker. For eksempel tillater TEM visualisering av intracellulær organelles som mitokondrier, melanosomes og ulike typer sekretoriske granulater, piskehale som henger, microfilaments, flimmerhårene, microvilli og intercellulære veikryss (celleoverflaten spesialisering), spesielt synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede målet med metodiske studien er ultrastructural anerkjennelse av endringer i nevrale plastisitet under utvikling på prenatal forstyrrelser ved å kombinere state-of-the-art teknikker i livmoren signaltransduksjon og TEM. Virally kodet proteiner rundt har vært transduced i livmoren i sentralnervesystemet5,6,7, inkludert ryggmarg6. For eksempel har i livmoren signaltransduksjon i kombinasjon med TEM blitt brukt for å studere effekten av celle vedheft molekyl L1 på motoren lære plastisitet i L1-mangelfull mus, spesielt med hensyn til samspillet mellom L1 og kjernefysiske reseptor proteiner i lillehjernen neurons7.
Analyse av neuroplasticity parametere krever presis informasjon om lokalisering av de minste områdene nervesystemet. Derfor er det tilstrekkelig å beskrive ultrastructural detaljer og deres nøyaktige topografiske retning når det gjelder andre strukturer. Studien presenteres en bestemt forberedende metode sikte på detaljert etterforskningen av forskjellige morfologiske områder basert på både lys og elektronmikroskop. Denne tilnærmingen kombinerer flere teknikker av vev manipulasjon, starter med i livmoren Albin på musen hjernen og ryggmarg og etterfulgt av perfusjon fiksering, innebygging av mold og behandling vev for TEM. Et viktig skritt inkludert mellom innebygging og behandling av vevet om TEM er dokumentasjon av vevet, ved hjelp av forstyrrelser lyset refleksjon teknikk som tillater presis microphotographic og lav forstørrelse dokumentasjon av vev prøver8,9,10. Innlemmet i den nåværende tilnærmingen, kan denne teknikken forskere å undersøke topografiske og strukturelle detaljer nervøse vev overflater og prøven skive profiler før sine forberedelser til TEM.
En spesiell ramme snitting hele hjernen tilsvarer stereotaxic koordinater. Denne rammen fordeler morfologiske tredimensjonale (3D) gjenoppbyggingen av områdene i nervøse vev og kan brukes for morphometric analyse. Macrographs av visualisert tilordnes topografiske koordinater, og delene serielt nummererte bygge kartene i en vev atlas.
Etter harpiks behandling, innebygde vev er delt inn i ultrathin deler (< 70 nm) som inneholder merkede områder, ifølge kart over nevnte vev atlas. Supertynn delene er utsatt for TEM å få høyoppløselige bilder av plastisitet parametere (f.eks tverrsnitt profil områder av synaptic boutons eller axonal fiber) innholdet og kontakter til nærliggende strukturer i komplekset neuropil.
Med metoden beskrevet her, tillater den glatte overgangen fra visualisert macrostructures mikro – og nanostrukturer sammenlignende grundige studier av morfologiske neuronal plastisitet etter i utero Albin på utvikle nervøs system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et avgjørende skritt i i livmoren signaltransduksjon er injeksjon prosedyren. Presis injeksjon i hjernen ventriklene eller et annet område av interesse krever erfaring og praktiske ferdigheter. Det tynnere microcapillary spissen, jo mindre vevsskade kan oppstå; Dette er imidlertid på bekostning av økende injeksjon press. I motsetning til i livmoren electroporation19,20,21,22, overlevelse a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke kolleger av dyr anlegget medisinske fakultetet, Ruhr Universitetet Bochum, for deres støtte og dyr omsorg.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
