Summary

Vurdering av Ultrastructural Neuroplasticity parametere etter i Utero signaltransduksjon utvikle musen hjernen og ryggmarg

Published: February 26, 2019
doi:

Summary

Kombinasjonen av overføring elektronmikroskop og i livmoren signaltransduksjon er en kraftig tilnærming for å studere morfologiske endringer i den fine ultrastructure av nervesystemet under utvikling. Denne kombinerte metoden gir dyp innsikt i endringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticity med hensyn til deres topografiske representasjon.

Abstract

Studien kombinerer i livmoren signaltransduksjon med overføring elektronmikroskop (TEM) sikte på en presis morphometrical analyse av ultrastructural parametere i entydig identifisert topografiske strukturer, påvirket av et protein av interesse som er innført i organismen via viral overføring. Dette kombinert tilnærming gir en myk overgang fra macrostructural til ultrastructural identifikasjon av følgende topografiske navigasjonskart i en vev atlas. Høyoppløselig elektronmikroskop av i-utero-transduced vev avslører den fine ultrastructure av neuropil og plastisitet parameterne, som kryss-delt synaptic bouton områder, antall synaptic blemmer og mitokondrier innenfor en Bouton profil, lengden på synaptic kontakter, kryss-delt axonal områder, tykkelsen på myelin sheaths, antall myelin lamellae, og kryss-delt områder av mitokondrier profiler. Analyse av disse parameterne avslører viktig innsikt i endringer av ultrastructural plastisitet i områdene av nervesystemet som berøres av viral overføring av genetiske Konstruer. Denne kombinerte metoden kan ikke bare brukes for å studere den direkte effekten av genmodifiserte biomolecules og/eller narkotika på neuronal plastisitet, men åpner også muligheten til å studere i livmoren redning av neuronal plastisitet (f.eks i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer).

Introduction

Ingen Foton kan trenge en supertynn vev prøven i dybden klasse til et elektron. Dette attributtene uvurderlig fordeler til TEM fange nanometer oppløsning av fine strukturer sammenlignet med * lys teknikker. For eksempel tillater TEM visualisering av intracellulær organelles som mitokondrier, melanosomes og ulike typer sekretoriske granulater, piskehale som henger, microfilaments, flimmerhårene, microvilli og intercellulære veikryss (celleoverflaten spesialisering), spesielt synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede målet med metodiske studien er ultrastructural anerkjennelse av endringer i nevrale plastisitet under utvikling på prenatal forstyrrelser ved å kombinere state-of-the-art teknikker i livmoren signaltransduksjon og TEM. Virally kodet proteiner rundt har vært transduced i livmoren i sentralnervesystemet5,6,7, inkludert ryggmarg6. For eksempel har i livmoren signaltransduksjon i kombinasjon med TEM blitt brukt for å studere effekten av celle vedheft molekyl L1 på motoren lære plastisitet i L1-mangelfull mus, spesielt med hensyn til samspillet mellom L1 og kjernefysiske reseptor proteiner i lillehjernen neurons7.

Analyse av neuroplasticity parametere krever presis informasjon om lokalisering av de minste områdene nervesystemet. Derfor er det tilstrekkelig å beskrive ultrastructural detaljer og deres nøyaktige topografiske retning når det gjelder andre strukturer. Studien presenteres en bestemt forberedende metode sikte på detaljert etterforskningen av forskjellige morfologiske områder basert på både lys og elektronmikroskop. Denne tilnærmingen kombinerer flere teknikker av vev manipulasjon, starter med i livmoren Albin på musen hjernen og ryggmarg og etterfulgt av perfusjon fiksering, innebygging av mold og behandling vev for TEM. Et viktig skritt inkludert mellom innebygging og behandling av vevet om TEM er dokumentasjon av vevet, ved hjelp av forstyrrelser lyset refleksjon teknikk som tillater presis microphotographic og lav forstørrelse dokumentasjon av vev prøver8,9,10. Innlemmet i den nåværende tilnærmingen, kan denne teknikken forskere å undersøke topografiske og strukturelle detaljer nervøse vev overflater og prøven skive profiler før sine forberedelser til TEM.

En spesiell ramme snitting hele hjernen tilsvarer stereotaxic koordinater. Denne rammen fordeler morfologiske tredimensjonale (3D) gjenoppbyggingen av områdene i nervøse vev og kan brukes for morphometric analyse. Macrographs av visualisert tilordnes topografiske koordinater, og delene serielt nummererte bygge kartene i en vev atlas.

Etter harpiks behandling, innebygde vev er delt inn i ultrathin deler (< 70 nm) som inneholder merkede områder, ifølge kart over nevnte vev atlas. Supertynn delene er utsatt for TEM å få høyoppløselige bilder av plastisitet parametere (f.eks tverrsnitt profil områder av synaptic boutons eller axonal fiber) innholdet og kontakter til nærliggende strukturer i komplekset neuropil.

Med metoden beskrevet her, tillater den glatte overgangen fra visualisert macrostructures mikro – og nanostrukturer sammenlignende grundige studier av morfologiske neuronal plastisitet etter i utero Albin på utvikle nervøs system.

Protocol

Alle prosedyrer på dyr fag er godkjent av institusjonelle dyreetikk komiteer av delstatene Hamburg og Nordrhein-Westfalen, Tyskland.  Bruk sterilt instrumenter, vernehansker og aseptiske strøk gjennom hele kirurgiske prosedyren. 1. i Utero signaltransduksjon Forberede adeno-assosiert virus type 1 (AAV1) coding for ønsket mål (4 x 1011 virus partikler/µL av AAV1) i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved pH 7.4. Legge til 0,1 mg/µL Fast Green og beholde AAV1-rask-grønne b…

Representative Results

Pålitelig og rask anestesi mus, mange sikkerhetsparametere ble vurdert og en optimalisert arbeidsområdet av anestesi viste seg for å være tilstrekkelig (figur 1A). Enheten er utviklet for å styre blanding av flytende isoflurane og luften med en presisjon kreves for vellykket operasjon på små dyr, for eksempel mus og rotter. Luft og isoflurane er blandet i vaporizer etter ønskede innstillinger og leveres i en boks eller gjennom en mask…

Discussion

Et avgjørende skritt i i livmoren signaltransduksjon er injeksjon prosedyren. Presis injeksjon i hjernen ventriklene eller et annet område av interesse krever erfaring og praktiske ferdigheter. Det tynnere microcapillary spissen, jo mindre vevsskade kan oppstå; Dette er imidlertid på bekostning av økende injeksjon press. I motsetning til i livmoren electroporation19,20,21,22, overlevelse a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke kolleger av dyr anlegget medisinske fakultetet, Ruhr Universitetet Bochum, for deres støtte og dyr omsorg.

Materials

2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26Gx 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor)
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon polyamide
eye lubricant Bepanthene
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 ml
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor)
iris forceps (10cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257x110x18 mm.
Heating area: 190×90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor)
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor)
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments
thin vibrating razor blade device Krup with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6mm
Inner diameter: 4mm
Wa
ll thickness: 1mm
Biomedical Instruments (Univentor)
Ultracut E Reichert-Jung ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

References

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

View Video