Summary
Kombinationen av transmissionselektronmikroskopi och i livmodern transduktion är en kraftfull metod för att studera morfologiska förändringar i den fina ultrastruktur nervsystemet under utveckling. Denna kombinerade metod kan djupa insikter i förändringar i strukturella Detaljer underliggande neuroplasticitet med avseende på deras topografiska representation.
Abstract
Föreliggande studie kombinerar i livmodern transduktion med transmissionselektronmikroskopi (TEM) som syftar till en noggrann morphometrical analys av ultrastrukturella parametrar i entydigt identifierade topografiska strukturer, påverkas av ett protein av intresse som införs i organismen via viral överföring. Detta kombinerat tillvägagångssätt möjliggör en smidig övergång från makrostrukturella till ultrastrukturella identifiering av följande topografisk navigationskartor i en vävnad atlas. Högupplösande elektronmikroskopi av i-utero-sensorik vävnad avslöjar den fina ultrastruktur av neuropil och dess plasticitet parametrar, exempelvis över uppställd synaptic bouton utrymmen, antalet synaptiska vesikler och mitokondrier inom en Bouton profil, längden av synaptiska kontakter, över uppställd axonal områden, tjockleken på myelin slidor, antalet myelin lamellerna och över uppställd områden av mitokondrier profiler. Analysen av dessa parametrar avslöjar viktiga insikter om ändringar av ultrastrukturella plasticitet i de delar av nervsystemet som påverkas av viral överföring av den genetiska konstruktionen. Denna kombinerade metod kan inte bara användas för att studera den direkta effekten av genetiskt modifierade biomolekyler och/eller droger på neuronal plasticitet men öppnar också möjligheten att studera i livmodern räddningsaktionen av neuronal plasticitet (t.ex. i samband med neurodegenerativa sjukdomar).
Introduction
Ingen fotonen kan penetrera en ultrathin vävnad förlagan i djup betyget av en elektron. Detta attribut ovärderliga fördelar till TEM fånga nanometers upplösning bilder av fina strukturer jämfört med ljusmikroskopi tekniker. TEM kan exempelvis för visualisering av intracellulära organeller som mitokondrier, melanosomer och olika typer av sekretoriska granuler, Mikrotubuli, microfilaments, cilier, Mikrovilli och intercellulära junctions (cellytan inriktningar), i synnerhet synapser i nervsystemet1,2,3,4. Det övergripande målet för den aktuella metodologiska studien är ultrastrukturella erkännande av förändringar i neural plasticitet under utveckling vid prenatal störningar genom att kombinera state-of-the-art tekniker för i livmodern transduktion och TEM. Viralt kodade proteiner av intresse har varit sensorik i livmodern in centrala nervsystemet5,6,7, inklusive ryggmärgen6. Exempelvis har i livmodern transduktion i kombination med TEM använts för att studera effekten av cell adhesion molekylen L1 på motor lärande plasticitet i L1-brist möss, i synnerhet när det gäller samspelet mellan L1 och nukleär receptor proteiner i lillhjärnan nervceller7.
Analysen av neuroplasticity parametrar kräver exakt information om lokaliseringen av de minsta områdena inom nervsystemet. Därför är det lämpligt att beskriva ultrastrukturella detaljer och deras exakta topografiska orientering med avseende på andra strukturer. I den aktuella studien presenteras en viss förberedande metod syftar till detaljerad utredning av distinkta morfologiska områden utifrån både ljus- och elektronmikroskopi. Denna strategi kombinerar flera tekniker av vävnad manipulation, börjar med i livmodern transduktion i mus hjärnan och ryggmärgen och följt av perfusion fixering, mögel-inbäddning och bearbetning vävnaden för TEM. Ett viktigt steg som ingår mellan för inbäddning och bearbetningen av vävnad för TEM är dokumentation av vävnad, med hjälp av störningar ljusreflektion teknik som möjliggör exakt microphotographic och låg förstoring dokumentationen av vävnaden exemplar8,9,10. Införlivas med den nuvarande metoden, möjliggör denna teknik forskare att undersöka topografiska och strukturella Detaljer av nervvävnad ytor och preparatet slice profiler innan deras förberedelse för TEM.
En särskild ram för snittning hela hjärnor motsvarar stereotaxic koordinater. Denna ram gynnar morfologiska tredimensionella (3D) återuppbyggnaden av områden i nervvävnad och kan användas för morfometriska analys. Macrographs visualiserade avsnitt tilldelas topografiska koordinater, och avsnitten seriellt numrerade bygga kartor i en vävnad atlas.
Efter harts bearbetning, inbäddade vävnaden är sektioneras i ultrathin sektioner (< 70 nm) som innehåller utvalda områden, enligt kartor över ovannämnda vävnad atlas. Avsnitten ultrathin utsätts för TEM att få högupplösta bilder av plasticitet parametrar (t.ex. tvärsnitt profilområden av synaptic knappar eller axonal fibrer) av deras innehåll och kontakter till närliggande strukturer inom anläggningen neuropil.
Med den metod som beskrivs häri, möjliggör en smidig övergång från visualiserade macrostructures till mikro- och nanostrukturer jämförande fördjupade studier av morfologiska neuronal plasticitet efter Utero transduktion av framkallningen nervös systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden om animaliska ämnen har godkänts av de institutionella djuretik kommittéerna av federalt påstår av Hamburg och Nordrhein-Westfalen, Tyskland. Använd sterila instrument, skyddshandskar och aseptiska kappor under hela operationstiden.
1. i Utero transduktion
- Förbereda adeno-associerade virustyp 1 (AAV1) som kodar för det önskade målet (4 x 1011 viral partiklar/µL av AAV1) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7,4. Tillsätt 0,1 mg/µL snabbt grönt och hålla AAV1-snabb-gröna blandningen vid 37 ° C.
- Förbereda en tunn kapillär spets med önskad form (8 mm i längd, med en yttre diameter av 80 µm och en inre diameter av 50 µm), med hjälp av en mikropipett avdragare (inställningar: Tryck = 500, värme = 700, pull = 0, hastighet = 80, tid = 200, se tabell för material < / c1 >). Bryta spetsen av kapillären så att det är 4-5 mm.
- Montera en insugningsventil tube (44 x 0,7 cm) med kapillär spetsen och sug upp 15 µL av AAV1-snabb-gröna blandningen i kapillären.
- Hålla de animaliska ämnena på en konstant fysiologiska kroppstemperatur på 37 ° C under hela förfarandet.
- Placera en gravid C57Bl/6 mus (embryonala dag 14,5) in i preincubation kammaren och söva musen med gasformiga 4% isofluran (med en volymetrisk luftflöde på 0,6-0,8 L/min).
- Injicera subkutant, buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvikt).
- Placera musen för sövda på förvärmd kirurgiska plattan (37 ° C).
- Täck ögonen med ett smörjmedel.
- Anpassa musen med anestesi masken (gasformiga 1,5% isofluran volymetriska luftflöde uppgå till 0,6-0,8 L/min) på kirurgiska plattan och rakning bukhuden regionen. Torka regionen rakad med 3 X 75% etanol och sedan med betadine lösning.
Obs: Övervaka andningen beteendet hos sövda musen kontinuerligt. Justera koncentrationen av isofluran gasen enligt mönstret inandning-utandning av musen. - Kontrollera om avsaknad av plantar reflexen genom att klämma hind tass falanger på musen.
- Öppna bukhålan genom gripande huden med böjda sågtandade iris pincett (10 cm) och skära huden längs den linea mediana med raka volframkarbid sax (10 cm), och sedan, genom gripande peritoneal väggen med raka Dumont pincett (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) och skära väggen längs linea alba med raka Vannas saxar (8 cm).
- Placera en bit av fenestrated paraffin film på buken öppningen och fixa filmen på båda ändarna med mikro-mygga hemostatiska pincett (12,5 cm, böjda).
- Avslöja livmoderns horn med en sked-liknande enhet för att undvika skador på embryona inuti livmodern hornen. Droppa några droppar av PBS (37 ° C) på uterin hornen och inspektera embryona för skador eller missbildningar inuti livmodern sac.
- Dokumentera beställning och position av embryon i livmodern hornen. Vända embryona noga inuti livmodern sac tills önskad position för injektion nås.
- Injicera 1-2 µL AAV1-snabb-gröna blandningen genom att visuellt inspektera injektionsstället (t.ex. hjärnans ventriklar) och färgämnet genomträngningen under ett stereomikroskop.
- Dokumentera de injicerade embryona och placera livmoderns horn med injicerade embryon tillbaka i bukhålan.
- Droppa några droppar av PBS (37 ° C) i bukhålan. Nära kaviteten av suturering peritoneal väggen (Använd polyamid 6-0-storlek suturer) och huden (Använd polyamid 3-0-storlek suturer), med hjälp av Halsted's mosquito hemostatiska pincett (12,5 cm, böjda). Alternativt använd ett enkelt avbruten mönster eller rostfritt stål sutur/staples för att stänga bukhålan och huden.
2. Telemacrophotography av isolerade vävnader
-
Beredning av buffertar
- Förbereda Sörensens buffert (1 L) genom upplösning 14,95 g av Na2HPO4 och 2,18 g KH2PO4 i 1 L destillerat vatten under omrörning på 200 rpm. För perfusion sen dräktighet pups eller ungar i den postnatala tidsperioder, Använd lämplig storlek av nålar buk eller intragastrisk injektionsvätska och se till att koncentrationen av den terminal natrium pentobarbital anestesi inte överstiger 180 mg / av kg väger.
- Förbered Mugnainis fixering lösning (5 L) genom värme 500 mL destillerat vatten till 75 ° C och tillsätt 50 g paraformaldehyd pulver under omrörning på 200 rpm, lägga till 200 µL 5 N NaOH, lägga 1500 mL av Sörensens buffert, 1 750 mL destillerat vatten , och 500 mL 25% glutaraldehyd. Fyll upp till 5 000 mL med destillerat vatten. Använd denna slutliga buffert för perfusion.
Obs: Förbereda Mugnainis fixering lösning under huven, Använd skyddsglasögon och undvika rök. Lägga till metylenblått (0,05 g/L) för en bättre visualisering av Perfusionen.
-
Mus perfusion och vävnad isolering
- Transcardially BEGJUTA de dräktiga möss som bär transduced embryon (när det gäller embryo studier) eller född transduced pubarna vid önskad ålder (t.ex. postnatal dag 24) enligt standardförfaranden6,7, 11,12,13,14,15,16,17, använder intraperitoneal terminal natrium pentobarbital anestesi (200 mg/kg kroppsvikt).
- Injicera möss transcardially med heparin lösning (500 U) använder en 26 G, 1 nål och innan fixering, ingjuta möss transcardially med 10 mL PBS att spola ut blodet från kroppen, och BEGJUTA dem transcardially med 30 mL 40 ° C föruppvärmd Mugnaini's fixering lösning.
Obs: För vuxna möss, utföra en alternativ retrograd perfusion via den bukaorta14. - Isolera den perfunderade vävnaden av intresse (t.ex. hela hjärnan eller ryggmärgen) och postfix vävnaden i minst 10 mL av Mugnainis fixering lösning för en annan 24 h vid 4 ° C.
- Tvätta vävnaden i 10 mL PBS för 3 h i rumstemperatur.
-
Inbäddning i agaros, plus dokumentation och snittning
- Justera den isolera vävnaden (t.ex. hela hjärnan) i en speciell ram med en reproducerbar snittningen vinkel8,9,10. Alternativt använda en vibratome med en justerbar skärande tjocklek.
- Placera nervvävnad i ramen, justera vävnaden för telemacrography och dokumentera koordinaterna.
- Förbered 3% låg-smältande agaros-inbäddning medium: tillsätt 3 g agaros i 100 mL Sörensens buffert och värm blandningen i vattenbad till 90 ° C.
- Häll 3% agaros (30 ° C) i den ram som innehåller vävnaden. Täcka ramen med en varm metall block och vänta tills det är härdning. Under härdning, använda telemacrographic enheter till bild embedded vävnaden och dess koordinater inom ramen.
- Överföra agaros-embedded vävnaden till en ram med skärande luckor motsvarar koordinaterna för den första bildrutan.
- Skär den inbäddade vävnaden i delar av önskad tjocklek (t.ex. 1,5 mm) med en enhet med en tunn och vibrerande rakblad (se Tabell för material).
Obs: För att förbättra glida av rakbladet, droppa några droppar glycerin på inbäddade vävnaden. - Bild varje vävnad avsnitt i PBS och samla in bilder i en mapp.
3. förberedelse av isolerade vävnad för transmissionselektronmikroskopi
Obs: Utföra alla ytterligare åtgärder för inkubation i glas rätter med tätt förslutningsbar lock på en skakande plattform under huven.
- Tvätta avsnitten vävnad i 2 x 30 min i PBS. Inkubera i avsnitt i 2% vattenlösning osmium vanligtvis lösning (OsO4) för 2 h i rumstemperatur.
Varning: Osmium vanligtvis är giftigt och kan vara skadligt när det kommer i kontakt med huden. - Tvätta osmicated avsnitten för 2 x 30 min i PBS.
- Inkubera i avsnitt i 30%, 50% och 70% etanol i rumstemperatur i 10-15 min (tillval: Inkubera i 70% etanol vid 4 ° C över natten).
- Bild osmicated exemplaren i 70% etanol enligt LED RGB ljus8,9,10 (2 x 15 W) tillämpas på provet från vänster och höger sida i en vinkel på 45 °. Använd svart rätter och en tråkig svart bakgrund för att minimera spridning och reflektion av ljuset under belysning.
Varning: Tillåt inte avsnittet att torka ut under imaging. - Skapa en atlas avsnitt bilder med koordinater genom att samla bilder i serien i en mapp.
- Inkubera exemplar 100% etanol (2 x 30 min) och 100% propylenoxid (2 x 30 min) vid rumstemperatur.
Varning: Tillåt inte avsnitten att torka ut när du byter lösningar. - Blanda 260 mL av harts med 240 mL dodecenylsuccinic bauxit i ett glaskärl medan försiktigt under omrörning med glasbar. Kontrollera regelbundet för inhomogenitet, bubblor och cellprov. Mycket försiktigt, rör för hand i minst 45 min.
- Förbereda harts/propylenoxid i förhållandet 1:2 och 1:1 och lägger till 3% accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Inkubera vävnaden i 1:2 inbäddning lösning från steg 3,8 för 2 h och sedan i 1:1 inbäddning lösningen från steg 3,8 för 2 h i rumstemperatur på ett roterande hjul.
- Placera vävnaden i platt polypropylen rätter, täcka vävnaden med färsk kåda som innehåller 3% accelerator och bota den inbäddade vävnaden på 65-85 ° C för 12-24 h.
- Kyla ner den inbäddade vävnaden till rumstemperatur och ta bort kåda-embedded exemplaren från polypropylen rätter.
4. Val av ultrastrukturella neuroplasticitet parametrar för kvantitativ analys
-
Kartläggning av området av intresse
- Välja ett område av intresse (t.ex. hippocampus eller lillhjärnan) och lokalisera området i avsnittet atlas genom att välja bilden från atlas (steg 3.5) som innehåller detta område.
- Skissa gränsar av området av intresse på avsnitt bilden och hitta/överlagra dessa regionen gränsar till harts preparatet.
- Scratch-mark gränsar av området av intresse (t.ex. hippocampus eller lillhjärnan) på harts preparatet, med hjälp av en fin nål mätare (26 G, 1 in).
- Värm harts preparatet till 85 ° C i en ugn för att mjukgöra kådan för trimning eller, alternativt, använda en trimning enhet, ett tunt blad eller sandpapper.
- Punktskatt området av intresse från harts preparatet med ett rakblad (se Tabell för material). Montera preparatet på holding barer av akrylglas av krävs kaliber t ex med (diameter 8 mm) och en längd av 1 cm med lim. Trimma monterade preparatet för semi- och ultrathin snittning.
- Förbereda semithin (0,75 µm) och ultratunna (70 nm) delar av området trimmade med hjälp av en ultramicrotome: Ställ den på 1,5 mm/s för 0,75 µm tjocklek och på 0,7 mm/s för 70 nm tjocklek.
- Samla de semithin avsnitten på glas transportörer och fläcken avsnitten med 1% toluidinblått blå i PBS (4 min).
- Tvätta i avsnitt flera gånger i avjoniserat vatten. Undersöka de färgade sektioner under mikroskopet ljus använder 4 x (NA av 0.1 ∞ /-), 10 x (NA av 0.22 ∞/0,17), 40 x (NA av 0,65 ∞/0,17), och 100 x (NA av 1,25 ∞/0,17) mål.
- Samla ultrathin sektioner på nickel rutnät. TEM på 180 som omfattas av rutnäten kV och 3, 200 x, 6, 000 x eller 8 000 x förstoring.
-
TEM analys
- Välj de ultrastrukturella parametrarna av intresse för kvantitativa TEM analys (t.ex. knappar med blåsor och mitokondrier eller myeliniserade och nonmyelinated axoner) och ta TEM bilder av dessa parametrar under 3, 500 x, 6000 x eller 8 000 x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Talrika säkerhetsparametrar ansågs pålitlig och snabb anestesi av möss, och en optimerad arbetsyta av anestesi enheten visade sig vara tillräcklig (figur 1A). Enheten är avsedd att styra blandningen av flytande isofluran och luften med en precision som krävs för framgångsrika kirurgi på smådjur, som möss och råttor. Luft och isofluran blandas i spridare enligt önskade inställningar och levereras i en låda eller via en mask till djuret (figur 1A). Gatsopare samlar och inaktiverar eventuella överskott isofluran gas som får produceras, vilket ger en säker arbetsmiljö. Gasen samlas och passerade genom aktivt kol i en patron (figur 1A).
En optimerad uppsättning instrument (figur 1B) tillåter forskare att snabbt utföra kirurgi på dräktiga möss. En enkel paraffin film med hydrofoba egenskaper förhindrar buk slemhinnan torkning efter resektion (figur 1B). Livmoderns horn härbärgerat embryona exponeras på paraffin film och embryon är numrerade på det sätt som visas i figur 1C. När lokaliserade, justeras embryona i rätt position för injektion av viruset via en tunn kapillär (figur 1D). Injektionen är visuellt kontrolleras genom att observera formen diffusion av genomträngande färgämnet som finns i den injicerade virus blandningen (figur 1D). Efter i livmodern injektion placeras uterin hornen tillbaka i bukhålan att möjliggöra en utveckling av de injicerade embryona tills scenen (t.ex. till födelse och nå postnatal dag 24) som behövs för experimentet (se, till exempel Lutz et al.5 ,6 och Kraus et al.7). För studier på synaptisk plasticitet rekommenderas sena utvecklingstoxicitet eller vuxna stadier.
Efter en transcardial perfusion av djuren vid önskad scenen, är nervvävnad (exempelvis hjärnan och ryggmärgen i figur 2) placerade och orienterade i en genomskinlig plast ram med koordinater och inbäddade i agaros (figur 2 ” A, B). Efter styckning, varje sektion är avbildats (figur 2C, E, G) och sedan osmicated. Efter osmication och inkubation i 70% eller 80% etanol, är avsnitten avbildade igen med hjälp av störningar ljus telemacrography8,9,10. Avsnitten vävnad måste placeras i en tråkig svart omgivning att minimera spridda strålning under krävs högintensiva belysning. Fiber skrifter och olika områden av vävnad återspeglar skimrande färger som kontrasterar den mörka vävnad bakgrunden och ett specifikt färgade mönster av vävnadsytan framträder (figur 2D, F, H). Alla skimrande bilder läggs med nonosmicated bilder och, tillsammans med de projicerade koordinaterna av inbäddning steg, de genererar av vävnad topografin kartor på navigation. Vävnaden är därefter ytterligare uttorkad och inbäddade i harts. Baserat på navigationskartor, intresseområden är valt och bearbetas vidare för TEM-som exempel, den hippocampus (stratum lucidum), lillhjärnan (granule cellager) och ryggmärgen (dorsala funiculus) visas i figur 3A1-C4 .
I hippocampus och lillhjärnan, är mossiga fiber synapser kända för att uppvisa unika ultrastrukturella egenskaper jämfört med andra synapser, inklusive stora presynaptiska knappar (figur 3A1-B5). De kan enkelt lokaliseras med hjälp av skimrande navigationskartor upprättade under föregående bearbetningssteg. I deras tvärsnitt profiler, knappar innehåller ett stort antal blåsor och mitokondrier och mycket ofta bifoga flera dendritutskotten (figur 3A4, A5, B4, B5). TEM bilder av dessa profiler kan en kvantifiering av över uppställd synaptic bouton områden, numrerar av synaptiska vesikler och mitokondrier inom en bouton profil, längden av synaptiska kontakter och antal kontakt webbplatser.
I ryggmärgen innehåller den dorsala funiculus många axonal fibrer som är myeliniserade av oligodendroglia. På övergripande delar, kan den dorsala funiculus hittas mellan båda bakre horn i ryggmärgen på tvärgående delar (figur 3C1, C2). På TEM bilder, över uppställd myeliniserade axoner visas runda och de myelin slidor kring axoner är organiserade i lamellerna (figur 3C3, C4). En kvantifiering av över uppställd axonal områden, bland annat tjockleken på myelin slidor och antalet myelin lamellerna, samt en kvantifiering av över uppställd mitokondrier profilområden kan utföras.
Beredda atlas och mikrofotografiska upptag-TEM bilder av ultrastrukturella parametrarna är inte bara bra för en jämförelse av morfologiska neuroplasticitet vid olika villkor för behandling, men också när en jämförelse mellan parametrar inom samma område krävs (t.ex. en jämförelse mellan olika typ av synapser i hippocampus18 och motsvarande strukturer av olika arter [figur 4]).
Figur 1 : Förberedelse för i livmodern transduktion. (A) isofluran anestesi setup: 1) induktion kammare för inledande anestesi; (2) pump; (3) anestesi enhet; (4) routing switch ventilen; (5) anestesi tillförsel slang; (6) gatsopare enhet; (7) andningsmask; (8) uppvärmt operationsbord; 9) kikare Stereoskop med ljuskälla; 10) styrenhet. (B) kirurgisk utrustning: 1) rakapparat; (2) öga smörjmedel; (3) fixering band; (4) bindor; (5) iris pincett (10 cm, böjda, räfflade); 6 och 7) iris sax (11 cm, rak, volframkarbid); (8) Dumont pincett (nr 3, 12 cm, rak, 0.2 x 0,12 mm). 9) Vannas sax (8 cm, rak); 10 och 11) mikro-mygga hemostatiska pincett (12,5 cm, böjda); 12) paraffin filma; 13) micro sked; 14) bomullspinnar; 15 och 16) Halsted's mosquito hemostatiska pincett (12,5 cm, rak); 17 och 18) suturer (storlek 6-0 och 3-0); 19) spruta. 20) hygienfilter tube sammansättningar för kalibrerad microcapillary pipetter. (C) system för en systematisk numrering av embryon i livmodern horn på embryonala dag (E) 14,5: L = vänster; R = höger. (D) strategier för injektion: i första och andra hjärnans ventriklar (jagve och IIve, respektive), fjärde ventrikeln (IVve) och ryggmärgen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Dokumentation av isolerade vävnad av telemacrography. (A och B) Inbäddning av en hjärna och en ryggmärgen i agaros, med hjälp av kyvetter med ett koordinatsystem (nät). Efter styckning, avsnitten utsätts för telemacrography och störningar speglar ljus imaging. (C-F) Transversella och sagittala delar av hjärnan. Skala barer = 5 mm; Co = cortex; St = striatum; di = diencephalon; mig = mesencephalon; Hej = hippocampus; PED = pedunculi cerebri; CE = lillhjärnan; Mo = förlängda märgen. (G och H) transversala avsnittet av ett cervikala segment av ryggmärgen. Skalstapeln = 1 mm; ahR = höger främre horn; ahL = vänster främre horn; DF = dorsala funiculus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Topografiska och ultrastrukturella identifiering av plasticitet parametrar. (A1) Inverterad störningar ljus macrograph av hippocampus. Regionen i de mossiga fiber knappar inom de stratum lucidum (sl) markeras. PCL = pyramidal celllagrar; gcl = granule cellager. Skalstapeln = 500 µm. (A2) ljus microphotograph (100 x mål) av ett semithin avsnitt (0,75 µm) visar stratum lucidum. Asteriskerna visar regioner i mossiga fiber knappar som omger många dendritiska öar (svarta pilar). Toluidin blå/OsO4 färgning. Skalstapeln = 50 µm. (A3) Transmission electron mikrograf vid låg förstoring, visar mossiga fiber knappar (asterisker) kring en dendrite (D). Rektangeln innehåller en enda mossiga fiber bouton. Skalstapeln = 2 µm. (A4) Transmission electron mikrograf av tvärsnitt profilen av en enda mossiga fiber bouton (MFB). Spines (blå) och området tvärsnitt bouton (violett) markeras. m = mitokondrien; s = spines. Skalstapeln = 200 nm. (A5) Synaptic blåsor inuti en MFB. Skalstapeln = 100 nm. (B1) Inverterad störningar ljus macrograph av lillhjärnan. Regionen i den granule cellager (gcl) som innehåller de mossiga fiber knappar är indicerat. mcl = molekylära lagret; h = hilus. Skalstapeln = 500 µm. (B2) ljus microphotograph (100 x mål) av ett semithin avsnitt (0,75 µm) visar en region av lagrets granule cellen som gränsar till Purkinje celler (PC). Asteriskerna visar regioner i mossiga fiber knappar som omges av många cerebellär granule nervceller (CGN). Toluidin blå/OsO4 färgning. Skalstapeln = 50 µm. (B3) Transmission electron mikrograf vid låg förstoring, Visar området av MFBs. Rektangeln innehåller en enda MFB. Skalstapeln = 2 µm. (B4) Transmission electron mikrograf av tvärsnitt profilen av en svamp-liknande MFB inom granule cellen lager av lillhjärnan. Området tvärsnitt bouton (violett) och vesikler-fri spines (blå) markeras. Skalstapeln = 1 µm. (B5) mitokondrier (violett) och synaptic blåsor inuti en MFB. Skalstapeln = 150 nm. (C1) Inverterad störningar ljus macrograph av ryggmärgen. Regionen i den dorsala funiculus (df) som innehåller kraftigt myeliniserade axoner är markerat. ahR och ahL = höger och vänster främre horn, respektive; phR och phL = höger och vänster bakre horn, respektive. Skalstapeln = 500 µm. (C2) ljus microphotograph (100 x mål) av ett semithin avsnitt (0,75 µm) visar den dorsala funiculus som är berikad med kraftigt myeliniserade axoner (ax) som är klart urskiljbar från nonmyelinated fibrer (asterisker). CT = bindväv. Toluidin blå/OsO4 färgning. Skalstapeln = 50 µm. (C3) Transmission electron mikrograf av tvärsnitt profiler av myeliniserade och nonmyelinated axoner (ax, violett). min = myelin slidor. Skalstapeln = 200 nm. (C4) Rektangeln visar hög-förstorad, kraftigt myeliniserade axoner med myelin lamellerna och nonmyelinated fibrer. De Mikrotubuli (mt) och mitokondrier (m) inom axonal fibrerna är synliga. Skalstapeln = 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Exempel på ultrastrukturella plasticitet parametrar i olika djurmodeller. (A) mossiga fiber knappar i lillhjärnan av en haj. Skalstapeln = 400 nm. (B) mossiga fiber bouton i hippocampus av en rhesus Makaker. Skalstapeln = 200 nm. (C) neuromuskulära förbindelsen av en katt. Skalstapeln = 300 nm. (D) Synaptic knappar i pars reticularis substantia nigra av en phalanger. Asteriskerna visar postsynaptiska densitet (PSD; i infälld: svart pilspetsar). Rektangeln visar en förstorad PSD. Skalstapeln = 400 nm. (E) A nonmyelinating Schwann celler (SC) kring många axonal fibrer i spinal ganglion av en mus. I närheten är kraftigt myeliniserade fibrer synlig. Skalstapeln = 300 nm. För alla paneler: ax = axon; D = dendrite; m = mitokondrien; MFB = mossiga fiber bouton; MF = mossiga fiber; min = myelin slidor; s = ryggraden; sa = ryggraden apparater; sv = synaptiska vesikler. Kontakt platser (postsynaptiska densitet) markeras med asterisker. Tvärsnitt områden markeras i violett och blått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett avgörande steg för i livmodern transduktion är Injektionsproceduren. Den exakta injektionen i hjärnans ventriklar eller till ett annat område av intresse kräver erfarenhet och praktisk färdighet. Ju tunnare microcapillary spets, den mindre vävnadsskadan kan förekomma; Detta är dock på bekostnad av ökande insprutningstryck. I motsats till i livmodern elektroporation19,20,21,22, överlevnaden av de injicerade embryona efter i livmodern transduktion är mycket hög. Alla embryon av livmoderns horn kan injiceras, även om embryon är belägna vid rötterna av livmoderns horn och behöver justeras inom uterin sac. Utvecklingsstadierna i injektion och analys kan anpassas till den vetenskapliga frågan.
När injiceras i hjärnans ventriklar, distribueras AAV1 partiklarna via ryggmärgsvätskan genom hela ventrikulära systemet. Utveckla strukturer med ytor som är i nära kontakt med sprit, såsom hippocampus och lillhjärnan, är sensorik av tillämpad viruspartiklar5,6,7. En analys av förändringarna i ultrastrukturella parametrar, såsom bouton storlek, över uppställd bouton områden, numrerar av synaptiska vesikler, antalet mitokondrier, och antal och längd av synaptiska kontakter i dessa strukturer, som är en elegant avläsningssystem för ultrastrukturella plasticitet. I livmodern transduktion metoden kan tillämpas för att studera olika hjärnområden, liksom i ryggmärgen6. Andra organ och vävnader kan dessutom på samma sätt väljas som transduktion mål. Slutligen kan används ofta musmodell ersättas av andra arter som krävs.
Fotografin av vävnad skivor möjliggör en mycket exakt dissektion av harts-embedded prover för transmissionselektronmikroskopi. Eftersom den rumsliga orienteringen av provet är definierade, omfattande och tidskrävande skärande utelämnades. Avgörande angränsande regioner kan dessutom hållas i deras ursprungliga relation till varandra. En viktig fördel med steget fotografisk dokumentation är möjligheten att övervaka kvaliteten på vävnad fixering och att känna igen patologiska förändringar. Således, kvaliteten på fixering och inbäddning av materialet är av avgörande betydelse. Nonsuitable prover som innehåller artefakter kan läggas ut före vidare bearbetning.
Mikrograf serien i avbildad vävnad skivor ger en bra morfologiska atlas. För jämförande neuroanatomiska studier, vilket kan även sällsynt art, är atlas ett värdefullt arkiv. Val av tjocklek på vävnad skivor beror på adresserade vetenskapliga frågan och begränsas av storleken på vävnad preparatet. För små djur, bör en tjocklek på upp till 1 mm ändras. Mycket tjocka sektioner (> 5 mm) rekommenderas inte, på grund av begränsad penetration kapacitet osmium vanligtvis8,9,10.
Telemacrophotography dokumentation är viktigt för morphometrical studier. Här erbjuds en fast korrelation på vävnadsytan åt sidan och övre planet av ramen och definierar placeringen av en given struktur i ett rumsliga koordinater. En kombination av den beskrivna metoden med elektrofysiologi18 eller ryggmärgen skadan modellen, där plasticitet spelar en viktig roll i regenerering6, är möjligt. För jämförande neuroanatomiska studier, vilket kan även sällsynt art, är skimrande vävnad atlas och mikrofotografiska upptag-TEM bilder av ultrastrukturella parametrarna värdefulla tillgångar.
Trots dess styrkor, TEM har flera begränsningar på grund av storleken tjocklek av provet (70 nm), området över uppställd (< 6 mm2), och komplexiteten i provberedningen. Men när ett prov är noggrant förberedda, är TEM bilder av preparatets ultrastruktur av högsta kvalitet i jämförelse med bilder som produceras av alla ljus-mikroskopiska tekniker. I livmodern transduktion tekniken begränsas av den injicerade volymen och topografiska regionen av injektionen. Obestridligen, tekniken har en stark translationell medicinsk potential i tidig utveckling behandling och i räddningsaktionen av medfödda neuropatologiska sjukdomar. Dessutom kan den nuvarande kombinationen av i livmodern transduktion med TEM bara inte betraktas som en strategi för den framtida behandlingen av medfödda sjukdomar, men också för högkvalitativa ultrastruktur-baserade neurodevelopmental diagnostik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar kollegorna i djuranläggningen vid den medicinska fakulteten, Ruhr-University Bochum, för deras stöd och djur vård.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
