Summary

Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

Published: February 26, 2019
doi:

Summary

La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.

Abstract

La présente étude combine la transduction in utero par microscopie électronique à transmission (TEM) visant à une analyse morphométrique précis des paramètres ultrastructurales dans des structures topographiques clairement identifiés, touchés par une protéine d’intérêt qui est introduit dans l’organisme par l’intermédiaire de transfert viral. Cette approche combinée permet une transition sans heurt entre macrostructuraux ultrastructurale identification par cartes topographiques navigation suivantes dans un atlas de tissu. La microscopie électronique à haute résolution du tissu in-utero-transduites révèle l’ultrastructure fine de la neuropile et ses paramètres de plasticité, tels que les zones transversales bouton synaptique, le nombre de vésicules synaptiques et les mitochondries dans un profil de bouton, la longueur des contacts synaptiques, zones axonales transversales, l’épaisseur de la gaine de myéline, le nombre de lamelles de la myéline et des zones transversales des profils de mitochondries. L’analyse de ces paramètres révèle les idées essentielles de l’évolution de la plasticité ultrastructurale dans les domaines du système nerveux qui sont concernés par le transfert viral de la construction génétique. Cette méthode combinée peut non seulement être utilisée pour l’étude de l’effet direct des biomolécules génétiquement et/ou de médicaments sur la plasticité neuronale, mais ouvre également la possibilité d’étudier le sauvetage dans l’utérus de la plasticité neuronale (par exemple, dans le cadre de maladies neurodégénératives).

Introduction

Aucun photon ne peut pénétrer un spécimen de tissu ultraminces dans le grade de profondeur d’un électron. Cela attribue des avantages inestimables à TEM à capter des images de résolution nanométrique de structures fines par rapport à des techniques de microscopie optique. Par exemple, permet la visualisation des organites intracellulaires comme les mitochondries, mélanosomes et divers types de granules de sécrétion, les microtubules, microfilaments, cils, microvillosités et jonctions intercellulaires (surface de la cellule TEM des spécialisations), en particulier de synapses dans le système nerveux1,2,3,4. L’objectif global de la présente étude méthodologique est la reconnaissance ultrastructurale des changements dans la plasticité neuronale au cours du développement à interférence prénatale en combinant les techniques de l’état-of-the-art de transduction in utero et TEM. Virally protéines d’intérêt ont été transduites in utero dans le système nerveux central5,6,7, y compris la moelle épinière6. Par exemple, transduction in utero en combinaison avec le TEM a été utilisée pour étudier l’effet de la molécule d’adhésion cellulaire L1 sur moteur d’apprentissage plasticité chez les souris déficientes en L1, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre la L1 et protéines de récepteurs nucléaires dans les neurones cérébraux7.

L’analyse des paramètres de la neuroplasticité exige des informations précises sur la localisation des zones plus petites au sein du système nerveux. Par conséquent, il est adéquat décrire les détails ultrastructurales et leur orientation topographique exacte en ce qui concerne les autres structures. Dans la présente étude, on présente une méthode de préparatoire spécifique visant à l’étude détaillée des aires morphologiques distinctes basées sur la lumière et la microscopie électronique. Cette approche combine plusieurs techniques de manipulation des tissus, à partir de transduction in utero du cerveau de souris et de la moelle épinière et suivie de la fixation de la perfusion, enrobage moule et le traitement du tissu pour TEM. Une étape essentielle, comprise entre l’intégration et le traitement du tissu pour TEM est la documentation du tissu, en utilisant la technique de réflexion de la lumière d’interférence qui permet de documentation microphotographique et faible grossissement précise de tissu spécimens8,9,10. Incorporé à l’approche actuelle, cette technique permet aux chercheurs d’examiner les détails topographiques et structurelles des surfaces de tissus du système nerveux et des profils de tranche de spécimen avant leur préparation pour TEM.

Un cadre exceptionnel pour le cerveau entier de sectionnement correspond aux coordonnées stéréotaxiques. Ce châssis bénéficie de la reconstruction morphologique de (3D) en trois dimensions des zones dans le tissu nerveux et peut être utilisé pour l’analyse morphométrique. Les macrographs des sections visualisées sont assignés coordonnées topographiques et les sections numérotées construire des cartes dans un atlas de tissu.

Après résine de traitement, le tissu embarqué est sectionné en coupes ultrafines (< 70 nm) contenant des zones sélectionnées, selon les cartes de l’atlas de tissus mentionnés ci-dessus. Les sections ultra-minces sont soumises à des TEM d’obtenir des images haute résolution des paramètres (par exemple, section profil zones de boutons synaptiques ou fibres axonales) de la plasticité de leur contenu et des contacts aux structures voisines au sein du complexe neuropile.

Avec la méthode décrite ici, la transition sans heurt entre les macrostructures visualisées micro et nanostructures permet des études comparatives approfondies de la plasticité neuronale morphologique après in utero transduction des pays en développement nerveuse système.

Protocol

Toutes les procédures sur les animaux sujets ont été approuvés par les comités d’éthique animale institutionnelle des Etats fédéraux de Hambourg et Nordrhein-Westfalen, Allemagne.  Utiliser des instruments stériles, gants et manteaux aseptique pendant toute la procédure chirurgicale. 1. in Utero Transduction Préparer adeno-associated virus de type 1 (AAV1) codant pour la cible souhaitée (4 x 1011 virale particules/µL de AAV1) dans la solution saline tampon…

Representative Results

Pour l’anesthésie fiable et rapide des souris, nombreux paramètres de sécurité étaient considérés comme et un espace de travail optimisé de l’unité de l’anesthésie s’est avérée adéquate (Figure 1A). L’appareil est conçu pour contrôler le mélange de liquide isoflurane et l’air ambiant avec une précision requise pour une opération avec succès sur petits animaux, tels que les souris et les rats. Air et isoflurane s…

Discussion

Une étape cruciale de la transduction in utero est la procédure d’injection. L’injection précise dans les ventricules cérébraux ou dans un autre domaine d’intérêt nécessite l’expérience et les compétences pratiques. Le diluant l’astuce microcapillaire, moins les dommages de tissu peuvent se produire ; Cependant, c’est au détriment de l’augmentation de pression d’injection. Contrairement à l’électroporation in utero19,20,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les collègues de l’animalerie à la faculté de médecine, Université de la Ruhr de Bochum, pour leurs soins de soutien et des animaux.

Materials

2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26Gx 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor)
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon polyamide
eye lubricant Bepanthene
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 ml
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor)
iris forceps (10cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257x110x18 mm.
Heating area: 190×90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor)
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor)
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments
thin vibrating razor blade device Krup with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6mm
Inner diameter: 4mm
Wa
ll thickness: 1mm
Biomedical Instruments (Univentor)
Ultracut E Reichert-Jung ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

References

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

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Cite This Article
Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

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