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Developmental Biology

Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

doi: 10.3791/59084 Published: February 26, 2019
* These authors contributed equally

Summary

La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.

Abstract

La présente étude combine la transduction in utero par microscopie électronique à transmission (TEM) visant à une analyse morphométrique précis des paramètres ultrastructurales dans des structures topographiques clairement identifiés, touchés par une protéine d’intérêt qui est introduit dans l’organisme par l’intermédiaire de transfert viral. Cette approche combinée permet une transition sans heurt entre macrostructuraux ultrastructurale identification par cartes topographiques navigation suivantes dans un atlas de tissu. La microscopie électronique à haute résolution du tissu in-utero-transduites révèle l’ultrastructure fine de la neuropile et ses paramètres de plasticité, tels que les zones transversales bouton synaptique, le nombre de vésicules synaptiques et les mitochondries dans un profil de bouton, la longueur des contacts synaptiques, zones axonales transversales, l’épaisseur de la gaine de myéline, le nombre de lamelles de la myéline et des zones transversales des profils de mitochondries. L’analyse de ces paramètres révèle les idées essentielles de l’évolution de la plasticité ultrastructurale dans les domaines du système nerveux qui sont concernés par le transfert viral de la construction génétique. Cette méthode combinée peut non seulement être utilisée pour l’étude de l’effet direct des biomolécules génétiquement et/ou de médicaments sur la plasticité neuronale, mais ouvre également la possibilité d’étudier le sauvetage dans l’utérus de la plasticité neuronale (par exemple, dans le cadre de maladies neurodégénératives).

Introduction

Aucun photon ne peut pénétrer un spécimen de tissu ultraminces dans le grade de profondeur d’un électron. Cela attribue des avantages inestimables à TEM à capter des images de résolution nanométrique de structures fines par rapport à des techniques de microscopie optique. Par exemple, permet la visualisation des organites intracellulaires comme les mitochondries, mélanosomes et divers types de granules de sécrétion, les microtubules, microfilaments, cils, microvillosités et jonctions intercellulaires (surface de la cellule TEM des spécialisations), en particulier de synapses dans le système nerveux1,2,3,4. L’objectif global de la présente étude méthodologique est la reconnaissance ultrastructurale des changements dans la plasticité neuronale au cours du développement à interférence prénatale en combinant les techniques de l’état-of-the-art de transduction in utero et TEM. Virally protéines d’intérêt ont été transduites in utero dans le système nerveux central5,6,7, y compris la moelle épinière6. Par exemple, transduction in utero en combinaison avec le TEM a été utilisée pour étudier l’effet de la molécule d’adhésion cellulaire L1 sur moteur d’apprentissage plasticité chez les souris déficientes en L1, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre la L1 et protéines de récepteurs nucléaires dans les neurones cérébraux7.

L’analyse des paramètres de la neuroplasticité exige des informations précises sur la localisation des zones plus petites au sein du système nerveux. Par conséquent, il est adéquat décrire les détails ultrastructurales et leur orientation topographique exacte en ce qui concerne les autres structures. Dans la présente étude, on présente une méthode de préparatoire spécifique visant à l’étude détaillée des aires morphologiques distinctes basées sur la lumière et la microscopie électronique. Cette approche combine plusieurs techniques de manipulation des tissus, à partir de transduction in utero du cerveau de souris et de la moelle épinière et suivie de la fixation de la perfusion, enrobage moule et le traitement du tissu pour TEM. Une étape essentielle, comprise entre l’intégration et le traitement du tissu pour TEM est la documentation du tissu, en utilisant la technique de réflexion de la lumière d’interférence qui permet de documentation microphotographique et faible grossissement précise de tissu spécimens8,9,10. Incorporé à l’approche actuelle, cette technique permet aux chercheurs d’examiner les détails topographiques et structurelles des surfaces de tissus du système nerveux et des profils de tranche de spécimen avant leur préparation pour TEM.

Un cadre exceptionnel pour le cerveau entier de sectionnement correspond aux coordonnées stéréotaxiques. Ce châssis bénéficie de la reconstruction morphologique de (3D) en trois dimensions des zones dans le tissu nerveux et peut être utilisé pour l’analyse morphométrique. Les macrographs des sections visualisées sont assignés coordonnées topographiques et les sections numérotées construire des cartes dans un atlas de tissu.

Après résine de traitement, le tissu embarqué est sectionné en coupes ultrafines (< 70 nm) contenant des zones sélectionnées, selon les cartes de l’atlas de tissus mentionnés ci-dessus. Les sections ultra-minces sont soumises à des TEM d’obtenir des images haute résolution des paramètres (par exemple, section profil zones de boutons synaptiques ou fibres axonales) de la plasticité de leur contenu et des contacts aux structures voisines au sein du complexe neuropile.

Avec la méthode décrite ici, la transition sans heurt entre les macrostructures visualisées micro et nanostructures permet des études comparatives approfondies de la plasticité neuronale morphologique après in utero transduction des pays en développement nerveuse système.

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Protocol

Toutes les procédures sur les animaux sujets ont été approuvés par les comités d’éthique animale institutionnelle des Etats fédéraux de Hambourg et Nordrhein-Westfalen, Allemagne.  Utiliser des instruments stériles, gants et manteaux aseptique pendant toute la procédure chirurgicale.

1. in Utero Transduction

  1. Préparer adeno-associated virus de type 1 (AAV1) codant pour la cible souhaitée (4 x 1011 virale particules/µL de AAV1) dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un pH de 7,4. Ajouter 0,1 mg/µL Fast Green et garder le mélange AAV1-Fast-vert à 37 ° C.
  2. Préparer une pointe fine capillaire avec la forme désirée (8 mm de longueur, avec un diamètre extérieur de 80 µm et un intérieur diamètre de 50 µm), à l’aide d’un extracteur d’une micropipette (paramètres : pression = 500, chaleur = 700, tirez = 0, vitesse = 80, temps = 200, voir la Table des matières < / c1 >). Casser l’extrémité du capillaire pour qu’il soit 4-5 mm.
  3. Monter un tube d’aspirateur (44 x 0,7 cm) avec la pointe capillaire et aspirer 15 µL du mélange AAV1-Fast-vert dans le capillaire.
  4. Gardez les animaux sujets à une température constante du corps physiologique de 37 ° C pendant toute la procédure.
  5. Placez les souris C57Bl/6 enceinte (embryonnaire jour 14,5) dans la chambre de préincubation et anesthésier la souris à l’isoflurane gazeux de 4 % (avec un débit volumétrique de 0,6 à 0,8 L/min).
  6. Injecter par voie sous-cutanée, de buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel).
  7. Placez votre souris anesthésiée sur la plaque préchauffée chirurgicale (37 ° C).
  8. Couvrir les yeux avec un lubrifiant.
  9. S’adapter à la souris avec le masque d’anesthésie (isoflurane gazeux de 1,5 % à un débit volumétrique de 0,6 à 0,8 L/min) sur la plaque chirurgicale et le rasage de la région de la peau abdominale. Essuyer la région rasée avec 3 X 75 % éthanol, puis avec betadine solution.
    Remarque : Surveiller en permanence le comportement de la respiration de la souris anesthésié. Ajuster la concentration du gaz isoflurane selon le modèle d’inhalation-exhalation de la souris.
  10. Vérifier l’absence du réflexe plantaire en serrant les phalanges de la patte arrière de la souris.
  11. Ouvrir la cavité abdominale en saisissant la peau avec une pince courbe dentelée iris (10 cm) et couper la peau le long de la mediana linea avec des ciseaux droites carbure de tungstène (10 cm), puis, en attrapant la paroi péritonéale avec droites pinces Dumont (12 cm, 0. 2 mm x 0.12 mm) et couper le mur le long de l’alba linea avec de droite Vanna ciseaux (8 cm).
  12. Placez un morceau de pellicule de paraffine fenêtrée sur l’ouverture abdominale et fixer le film sur les deux extrémités avec une pince hémostatique micro-moustique (12,5 cm, courbé).
  13. Exposer les cornes utérines avec un appareil de type cuillère pour ne pas endommager les embryons dans les cornes utérines. Appliquez quelques gouttes de PBS (37 ° C) sur les cornes utérines et inspecter les embryons pour des dommages ou des malformations à l’intérieur du sac utérin.
  14. Document de l’ordre et la position des embryons dans les cornes utérines. Tourner les embryons soigneusement à l’intérieur du sac utérin jusqu'à obtenir la position désirée pour l’injection.
  15. Injecter 1-2 µL du mélange AAV1-Fast-vert en inspectant visuellement le site d’injection (p. ex., les ventricules cérébraux) et la pénétration du colorant sous un stéréomicroscope.
  16. Documenter les embryons injectés et replacez les cornes utérines avec les embryons injectés dans la cavité abdominale.
  17. Appliquez quelques gouttes de PBS (37 ° C) dans la cavité abdominale. Fermer la cavité en suturant la paroi péritonéale (utilisation polyamide taille 0-6 sutures) et la peau (utilisation polyamide taille 0-3 points de suture), à l’aide de pinces hémostatiques à moustiques de Halsted (12,5 cm, courbé). Également utiliser un simple motif interrompu ou inox suture/agrafes pour fermer la cavité abdominale et la peau.

2. Telemacrophotography de tissus isolés

  1. Préparation des tampons
    1. Préparer les tampon de Sörensen (1 L) de dissolution g 14,95 de Na2HPO4 et 2,18 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau distillée sous agitation à 200 tr/min. Pour la perfusion de la fin, chiots de gestation et/ou petits dans le post natal des périodes de temps, utiliser la bonne taille d’aiguilles pour injection abdominale ou intragastrique et s’assurer que la concentration de l’anesthésie au pentobarbital de sodium terminal ne dépasse pas 180 mg / kg de poids de corps.
    2. Préparer la solution de fixation de Mugnaini (5 L) en chauffant 500 mL d’eau distillée à 75 ° C et ajouter 50 g de poudre de paraformaldéhyde sous agitation à 200 tr/min, ajouter 200 µL de 5 N NaOH, ajouter 1 500 mL de tampon de Sörensen, 1 750 mL d’eau distillée et 500 mL de glutaraldéhyde à 25 %. Remplissez jusqu'à 5 000 mL d’eau distillée. Utilisez ce dernier tampon pour perfusion.
      NOTE : Préparer la solution de fixation de Mugnaini sous le capot, porter des lunettes de protection et éviter les émanations. Ajouter le bleu de méthylène (0,05 g/L) pour une meilleure visualisation de la perfusion.
  2. Isolement de perfusion et tissus de souris
    1. Transcardially perfuse les souris enceintes qui transportent les embryons transduits (dans le cas d’études de l’embryon) ou les pubs transduits nés à l’âge désiré (par exemple, le jour après la naissance 24) selon les procédures standard6,7, 11,12,13,14,15,16,17, à l’aide de pentobarbital sodique terminal intrapéritonéale anesthésie (200 mg/kg de poids corporel).
    2. Injecter la souris transcardially avec solution héparinée (500 U) à l’aide d’un 26 G, 1 aiguille et, avant la fixation, infuser les souris transcardially avec 10 mL de PBS à débusquer le sang du corps et eux perfuse transcardially avec 30 mL de 40 ° C préchauffé Mugnaini solution de fixation.
      Remarque : Chez les souris adultes, effectuer une autre perfusion rétrograde par l’intermédiaire de l' aorte abdominale14.
    3. Isoler les tissus perfusés d’intérêt (par exemple, tout le cerveau ou la moelle épinière) et postfix le tissu dans au moins 10 mL de la solution de fixation de Mugnaini pendant encore 24 h à 4 ° C.
    4. Laver le tissu dans 10 mL de PBS pendant 3 h à température ambiante.
  3. Incorporation en gel d’agarose, majoré de documentation et sectionnement
    1. Ajuster les tissus isolés (par exemple, le cerveau entier) dans un cadre exceptionnel avec une reproductibilité sectionnement angle8,9,10. Vous pouvez également utiliser un vibratome avec une épaisseur de coupe réglable.
    2. Placer le tissu nerveux dans l’armature, ajuster le tissu pour telemacrography et documenter les coordonnées.
    3. Préparer 3 % bas point de fusion d’agarose-enrobage moyen : ajouter 3 g d’agarose dans 100 mL de tampon de Sörensen et chauffer le mélange dans un bain d’eau à 90 ° C.
    4. Verser 3 % d’agarose (30 ° C) dans le cadre qui contient le tissu. Couvrir le cadre avec un bloc de métal chaud et attendre qu’il soit durcissement. Durant l’endurcissement, utiliser des dispositifs de telemacrographic pour le tissu embarqué et ses coordonnées dans le cadre de l’image.
    5. Transvaser le tissu d’agarose-encastré dans un cadre avec des écarts de coupe correspondant aux coordonnées de la première image.
    6. Couper le tissu embarqué en sections de l’épaisseur désirée (par exemple, 1,5 mm) avec un appareil avec une lame de rasoir mince et vibrante (voir Table des matières).
      Remarque : Pour améliorer le glissement de la lame de rasoir, appliquez quelques gouttes de glycérine sur le tissu incorporé.
    7. Image de chaque section de tissu dans du PBS et recueillir les images dans un dossier.

3. préparation du tissu isolée pour la microscopie électronique à Transmission

Remarque : Effectuer toutes les autres étapes de l’incubation dans des plats en verre avec couvercle refermable étroitement sur une plate-forme vibrante sous le capot.

  1. Laver les coupes de tissus pour 2 x 30 min dans du PBS. Incuber les sections en solution aqueuse le tétroxyde d’osmium à 2 % (OsO4) pendant 2 h à température ambiante.
    Mise en garde : Le tétroxyde d’osmium est toxique et peut être nocif lorsqu’il entre en contact avec la peau.
  2. Laver les sections osmicated pour 2 x 30 min dans du PBS.
  3. Incuber les sections dans l’éthanol 70 % 30 % et 50 % à température ambiante pendant 10-15 min (en option : incuber dans l’éthanol à 70 % à 4 ° C pendant la nuit).
  4. Image les spécimens osmicated dans l’éthanol à 70 % sous LED RGB léger8,9,10 (2 x 15 W) appliquées à l’échantillon de gauche et à droite à un angle de 45 °. Utiliser les plats noirs et fond noir mat pour réduire au minimum la diffusion et la réflexion de la lumière au cours de l’illumination.
    Mise en garde : Ne laissez pas la section se dessécher pendant la formation image.
  5. Créer un atlas des images section avec coordonnées par collectionner des images en série dans un dossier.
  6. Incuber les échantillons à 100 % d’éthanol (2 x 30 min) et 100 % d’oxyde de propylène (2 x 30 min) à température ambiante.
    Mise en garde : Ne pas laisser les sections à se dessécher lors du changement des solutions.
  7. Mélanger les 260 mL de résine avec 240 mL d’anhydride dodecenylsuccinic dans un récipient en verre en remuant doucement d’un verre. Contrôler périodiquement d’inhomogénéité, bulles et frottis. Remuer très doucement, à la main pendant au moins 45 min.
  8. Préparer la résine/méthyloxiane à un ratio de 1:2 et 1:1 et ajouter 3 % accélérateur (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. Incuber le tissu dans le 1:2, intégration de solution de l’étape 3,8 pendant 2 h, puis dans la solution d’encastrement 1:1 de l’étape 3,8 pendant 2 h à température ambiante sur une roue en rotation.
  10. Placez le tissu en polypropylène plat plats, couvrir le tissu avec de la résine fraîche contenant 3 % accélérateur et guérir le tissu incorporé entre 65 et 85 ° C pendant 12 à 24 heures.
  11. Refroidir le tissu incorporé à la température ambiante et enlever les spécimens enrobées dans la résine de la vaisselle en polypropylène.

4. sélection des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurale pour l’analyse Quantitative

  1. Cartographie de la zone d’intérêt
    1. Choisissez un domaine d’intérêt (par exemple, le hippocampe ou le cervelet) et localiser la zone dans l’atlas de la section en choisissant l’image de l’atlas (étape 3.5) qui contient la matière.
    2. Esquissez les frontières de la zone d’intérêt sur la section image et trouver/superposer ces frontières de la région sur le spécimen de résine.
    3. Marque de zéro les frontières de la région d’intérêt (par exemple, le hippocampe ou le cervelet) sur l’échantillon de résine, aide d’une aiguille fine jauge (26 G, 1 in).
    4. Chauffer l’échantillon de résine à 85 ° C dans un four pour ramollir la résine pour dégrossir ou, sinon, utiliser un dispositif de coupe, une lame mince ou papier de verre.
    5. La zone d’intérêt dans l’échantillon de résine avec une lame de rasoir de l’accise (voir Table des matières). Monter le spécimen sur la tenue des barres de verre acrylique du calibre requis par exemple avec (diamètre 8 mm) et d’une longueur de 1 cm avec de la colle. Taillez le spécimen monté pour semi - et coupes ultraminces.
    6. Préparer semi-fines (0,75 µm) et ultra-minces (70 nm) sections de la zone rognée en utilisant un ultramicrotome : définissez-la à 1,5 mm/s pour 0,75 µm d’épaisseur et à 0,7 mm/s pour 70 épaisseur nm.
    7. Recueillir les sections semi-fines sur des supports de verre et de tacher les sections avec 1 % toluidine bleu dans du PBS (pendant 4 min).
    8. Laver les sections plusieurs fois dans l’eau désionisée. Examiner les sections colorées sous microscope photonique à l’aide de 4 x (NA de ∞ 0.1 /-), 10 x (NA de ∞/0,17 0,22), 40 x (NA de 0.65 ∞/0,17) et 100 x objectifs (NA de 1,25 ∞/0,17).
    9. Recueillir des coupes ultrafines sur grilles de nickel. Soumettre les grilles à TEM à 180 kV et à 3, 200 x, 6, 000 x, et/ou un grossissement de 8 000 x.
  2. Analyse TEM
    1. Choisissez les paramètres ultrastructures d’intérêt pour l’analyse quantitative de TEM (par exemple, les boutons avec des vésicules et des mitochondries ou des axones myélinisés et nonmyelinated) et prendre des images de TEM de ces paramètres de moins de 3 ans, x 500, x 6 000 ou 8 000 x grossissement.

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Representative Results

Pour l’anesthésie fiable et rapide des souris, nombreux paramètres de sécurité étaient considérés comme et un espace de travail optimisé de l’unité de l’anesthésie s’est avérée adéquate (Figure 1A). L’appareil est conçu pour contrôler le mélange de liquide isoflurane et l’air ambiant avec une précision requise pour une opération avec succès sur petits animaux, tels que les souris et les rats. Air et isoflurane sont mélangés dans le vaporisateur selon les paramètres désirés et livrés dans une boîte ou à travers un masque à l’animal (Figure 1A). Le Piégeur recueille et inactive tout gaz isoflurane excédentaires qui peut-être être produits, fournissant ainsi un environnement de travail sécuritaire. Le gaz est recueilli et transmis par l’intermédiaire de charbon actif dans un cartouche (Figure 1A).

Un jeu optimisé des instruments (Figure 1B) permet aux scientifiques d’effectuer une chirurgie rapidement sur des souris enceintes. Un film de paraffine simple avec des propriétés hydrophobes empêche la muqueuse abdominale de séchage après résection (Figure 1B). Les cornes utérines hébergeant les embryons sont exposés sur la pellicule de paraffine et les embryons sont numérotées de la manière indiquée dans la Figure 1C. Une fois localisé, les embryons sont ajustées dans la position correcte pour l’injection du virus via un mince tube capillaire (Figure 1D). L’injection est contrôlée visuellement en observant la forme de diffusion de la teinture pénétrante contenue dans le mélange de virus injecté (Figure 1D). Après injection dans l’utérus, les cornes utérines sont placés dans la cavité abdominale pour permettre le développement des embryons injectés jusqu’au stade (par exemple, jusqu'à la naissance et atteignant postnatal jour 24) qui est nécessaire pour l’expérience (voir, par exemple, Lutz et al.,5 ,6 et Kraus et al.7). Pour les études sur la plasticité synaptique, stades développementaux ou adultes sont recommandés.

Après une perfusion de transcardial des animaux au stade désiré, le tissu nerveux (par exemple, le cerveau et la moelle épinière à la Figure 2) est placé et orienté dans un cadre en plastique transparent avec coordonnées et intégré dans l’agarose (Figure 2 A, B). Après la découpe, chaque section est imagé (Figure 2C, E, G) et ensuite osmicated. Après osmication et l’incubation dans de l’éthanol 70 % ou 80 %, les sections sont imagées à nouveau à l’aide d’interférence lumineuse telemacrography8,9,10. Les sections de tissu doivent être placées dans un cadre noir mat pour minimiser le rayonnement diffusé pendant l’allumage de haute intensité requis. Tracts de fibre et de différents secteurs du tissu reflètent les couleurs irisées qui contrastent avec l’arrière-plan foncé tissus et un modèle spécifiquement couleur de la surface du tissu ressort (Figure 2D, F, H). Toutes les images irisées sont superposées avec les images nonosmicated et, ainsi que les coordonnées projetées de l’étape de l’encastrement, elles génèrent des cartes de navigation de la topographie de tissu. Ensuite, le tissu est plus déshydraté et incorporé dans la résine. Basé sur les cartes de navigation, les domaines d’intérêt sont choisis et traitées ultérieurement pour TEM-comme exemples, l’hippocampe (stratum lucidum), cervelet (couche de cellules de granules) et la moelle épinière (dorsale funicule) sont indiquées dans la Figure 3A1-C4 .

Dans l’hippocampe et le cervelet, les fibres moussues synapses sont connus pour pièce uniques caractéristiques ultrastructurales comparativement à d’autres synapses, y compris les gros boutons présynaptiques (Figure 3A1-B5). Ils peuvent être facilement localisées à l’aide des cartes navigation irisé établis au cours des étapes précédentes de traitement. Dans leurs profils de coupe transversale, les boutons contiennent un grand nombre de vésicules et de mitochondries et très souvent joindre plusieurs épines dendritiques (Figure 3A4, A5, B4, B5). Images TEM de ces profils permettent une quantification des zones transversales bouton synaptique, le nombre de mitochondries dans un profil de bouton et les vésicules synaptiques, la durée des contacts synaptiques et le nombre de sites de contact.

Dans la moelle épinière, le funicule dorsal contient de nombreuses fibres axonales qui sont myélinisées d’oligodendrocytes. Sur des coupes transversales, le funicule dorsal se trouvent entre les deux cornes postérieures de la moelle épinière sur des coupes transversales (Figure 3,C1, C2). Sur les images TEM, les axones myélinisés transversales apparaissent ronds et les gaines de myéline qui entoure les axones sont organisés en lamelles (Figure 3C3, C4). Une quantification des domaines axonale transversales, y compris l’épaisseur des gaines de myéline et le nombre de lamelles de myéline, ainsi qu’une quantification des mitochondries transversales des zones de profil peuvent être effectuées.

L’atlas préparés et les images TEM micrographiques des ultrastructures paramètres ne sont pas seulement utiles pour une comparaison de la neuroplasticité morphologique différentes conditions de traitement, mais aussi lorsqu’une comparaison entre les paramètres dans la même zone est requise (p. ex., une comparaison entre différents types de synapses dans l' hippocampe18 et entre structures équivalentes de différentes espèces [Figure 4]).

Figure 1
Figure 1 : Préparation pour la transduction in utero. Installation de l’anesthésie Isoflurane (A) : 1) chambre d’induction d’anesthésie initiale ; 2) pompe ; 3) unité d’anesthésie ; 4) soupape de commutateur routage ; 5) alimentation anesthésie tube ; 6) unité de charognard ; 7) masque respiratoire ; 8) table d’opération chirurgicale chauffée ; 9) stéréoscope binoculaire avec source lumineuse ; 10) unité de commande. Matériel de chirurgie (B) : 1) rasoir électrique ; 2) lubrifiant oculaire ; 3) bandes de fixation ; 4) blocs sanitaires ; 5) forceps iris (10 cm, courbé, dentelé) ; 6 et 7) les ciseaux iris (11 cm, droite, carbure de tungstène) ; 8) brucelles Dumont (#3, 12 cm, droite, 0,2 x 0,12 mm) ; 9) ciseaux de Vanna (8 cm, droite) ; 10 et 11) micro-moustique pince hémostatique (12,5 cm, courbé) ; 12) film de paraffine ; 13) micro cuillère ; 14) écouvillons en coton ; pinces hémostatiques à 15 et 16) de Halsted moustique (12,5 cm, droite) ; 17 et 18) sutures (taille 6-0 et 3-0) ; 19) seringue ; 20) ensembles de tubes d’aspirateur pour pipettes calibrées microcapillaire. (C) schéma d’une numérotation systématique des embryons dans les cornes utérines à jour embryonnaire (E) 14,5 : L = gauche ; R = right. (D) stratégies d’injection : dans les ventricules du cerveau de premier et deuxième (jeve et IIve, respectivement), quatrième ventricule (IVve) et la moelle épinière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Documentation des tissus isolés de telemacrography. (A et B) Incorporation d’un cerveau et la moelle épinière dans l’agarose, en utilisant des cuves avec un système de coordonnées (grilles). Après la découpe, les sections sont soumises à réflexion telemacrography et interférences d’imagerie de la lumière. (C-F) Sections transversales et sagittales du cerveau. Barreaux de l’échelle = 5 mm ; co = cortex ; St = striatum ; di = diencéphale ; me = mésencéphale ; Salut = hippocampe ; PED = pedunculi cerebri ; ce = cervelet ; Mo = bulbe rachidien. (G et H) de section transversale d’un segment cervical de la moelle épinière. Echelle = 1 mm ; ahR = corne droite antérieure ; la Ligue = corne antérieure gauche ; DF = dorsale funicule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Identification topographique et ultrastructurale des paramètres plasticité. (A1) Interférence inversé macrograph lumière de l’hippocampe. La région des boutons des fibres moussues dans le stratum lucidum (sl) est mis en surbrillance. PCL = couche de cellules pyramidales ; GCL = couche de cellules de granules. Echelle = 500 µm. (A2) lumière microphotographie (100 x, objectif) d’une section semi-fines (0,75 µm) montrant le stratum lucidum. Les astérisques indiquent les régions de boutons de fibres moussues qui entourent les nombreuses îles dendritiques (flèches noires). Toluidine bleu/OsO4 coloration. Echelle = 50 µm. (A3) au microscope électronique à un faible grossissement, affichage de boutons de fibres moussues (astérisques) entourant une dendrite (D). Le rectangle comprend un bouton unique de fibres moussues. Echelle = 2 µm. (A4) au microscope électronique du profil coupe transversale d’un bouton unique de fibres moussues (MFB). Épines (bleus) et la transversale de bouton (violet) sont mises en évidence. m = la mitochondrie ; s = épines. Echelle = 200 nm. (A5) Vésicules synaptiques à l’intérieur d’un MFB. Echelle = 100 nm. (B1) Interférence inversé macrograph lumière du cervelet. La région de la couche de cellules de granules (gcl) qui contient les boutons de fibres moussues est indiquée. MCL = couche moléculaire ; h = hile. Echelle = 500 µm. (B2) lumière microphotographie (100 x, objectif) d’une coupe semi-fines (0,75 µm) montrant une région de la couche de cellules de granules qui borde sur des cellules de Purkinje (PC). Les astérisques indiquent les régions de boutons de fibres moussues qui sont entourés de nombreux neurones du cervelet granule (CGN). Toluidine bleu/OsO4 coloration. Echelle = 50 µm. (B3) au microscope électronique à un faible grossissement, montrant la zone du GPRA. Le rectangle comprend un seul MFB. Echelle = 2 µm. (B4) au microscope électronique du profil coupe transversale d’un champignon MFB au sein de la couche de cellules de granules du cervelet. La transversale de bouton (violet) et exempt de vésicule épines (bleu) sont mises en évidence. Echelle = 1 µm. (B5) mitochondries (violet) et des vésicules synaptiques à l’intérieur d’un MFB. Echelle = 150 nm. (C1) Interférence inversé lumière macrograph de la moelle épinière. La région de la dorsale funicule (df) qui contient les axones myélinisés fortement est mis en surbrillance. procréation assistée et la Ligue = droite et gauche de la corne antérieure, respectivement ; phR et phL = droite et gauche corne postérieure, respectivement. Echelle = 500 µm. (C2) lumière microphotographie (100 x, objectif) d’une coupe semi-fines (0,75 µm) montrant le funicule dorsal qui est enrichi avec des axones myélinisés lourdement (ax) qui sont distinguent nettement des fibres nonmyelinated (astérisques). CT = du tissu conjonctif. Toluidine bleu/OsO4 coloration. Echelle = 50 µm. (C3) au microscope électronique des profils de section transversale des axones myélinisés et nonmyelinated (ax, violet). ma = des gaines de myéline. Echelle = 200 nm. (C4) Le rectangle montre haute-magnifiée, largement myélinisées des axones avec lamelles de la myéline et des fibres nonmyelinated. Les microtubules (mt) et les mitochondries (m) dans les fibres axonales sont visibles. Echelle = 50 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemples de paramètres de plasticité ultrastructurales dans différents modèles animaux. (A) les boutons de fibres moussues dans le cervelet du requin. Echelle = 400 nm. (B) les bouton de fibres moussues dans l’hippocampe d’un macaque rhésus. Echelle = 200 nm. (C) la jonction neuromusculaire d’un chat. Echelle = 300 nm. (D) les boutons synaptiques dans le pars reticularis substantia nigra d’un phalanger. Les astérisques indiquent une densité postsynaptique (PSD ; en médaillon : noir des pointes de flèche). Le rectangle montre un PSD agrandi. Echelle = 400 nm. Nonmyelinating (E), une cellule de Schwann (SC) qui entoure de nombreuses fibres axonales dans le ganglion spinal de souris. Dans les environs, les fibres myélinisées fortement sont visibles. Echelle = 300 nm. Pour tous les panneaux : ax = axone ; D = dendrite ; m = la mitochondrie ; MFB = bouton de fibres moussues ; MF = fibres moussues ; ma = des gaines de myéline ; s = épine ; sa = appareils de colonne vertébrale ; SV = vésicules synaptiques. Sites de contact (densité postsynaptique) sont indiquées par des astérisques. Les zones de coupe sont surlignés en bleu et violet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une étape cruciale de la transduction in utero est la procédure d’injection. L’injection précise dans les ventricules cérébraux ou dans un autre domaine d’intérêt nécessite l’expérience et les compétences pratiques. Le diluant l’astuce microcapillaire, moins les dommages de tissu peuvent se produire ; Cependant, c’est au détriment de l’augmentation de pression d’injection. Contrairement à l’électroporation in utero19,20,21,22, le taux de survie des embryons injectés après transduction in utero est très élevé. Tous les embryons de la corne utérine peuvent être injectées, même si les embryons sont situés à la racine des cornes utérines et nécessiter un réajustement dans le sac utérin. Les stades de développement de l’injection et l’analyse peuvent être adaptés à la question scientifique.

Lorsqu’elle est injectée dans les ventricules du cerveau, les particules de AAV1 sont distribuées via le liquide céphalorachidien par le biais de l’ensemble du système ventriculaire. Structures de développement avec des surfaces qui sont en contact étroit avec les boissons alcoolisées, telles que l’hippocampe et le cervelet, sont transduites par les particules virales appliquée5,6,7. Une analyse des changements ultrastructures paramètres, tels que la taille du bouton, zones transversales bouton, nombre de vésicules synaptiques, nombre de mitochondries et nombre et longueur des contacts synaptiques dans ces structures, est une lecture élégante pour plasticité ultrastructurale. La méthode transduction in utero peut être appliquée à l’étude certaines zones du cerveau différentes, ainsi que la moelle épinière6. En outre, autres organes et tissus peuvent être de même choisis comme cibles de transduction. Enfin, le modèle murin fréquemment utilisés peut être remplacé par d’autres espèces comme l’exige.

La photographie des tranches tissus permet une dissection très précise des échantillons enrobées dans la résine pour la microscopie électronique à transmission. Puisque l’orientation spatiale de l’échantillon est définie, une vaste et longue coupe a été omise. En outre, cruciales régions voisines peuvent être maintenues dans leur relation originale à l’autre. Un avantage important de l’étape de la documentation photographique est la possibilité de surveiller la qualité de la fixation du tissu et de reconnaître les altérations pathologiques. Ainsi, la qualité de la fixation et l’incorporation de la matière sont d’importance cruciale. Nonsuitable échantillons contenant des artefacts peuvent être sous-traitées avant traitement ultérieur.

La série de micrographie des tranches imagés tissus fournit un atlas morphologique utile. Pour les études comparatives neuroanatomiques, qui peuvent également inclure des espèces rares, l’atlas est une archive précieuse. Le choix de l’épaisseur des tranches tissu dépend de la question scientifique dédiée et est limité par la taille de l’échantillon de tissu. Pour petits animaux, une épaisseur de 1 mm doit être ajustée. Coupes très épaisses (> 5 mm) ne sont pas recommandés en raison de la capacité de pénétration limitée du tétroxyde d’osmium8,9,10.

La documentation de telemacrophotography est indispensable pour les études morphométriques. Il offre une corrélation fixe de la surface du tissu sur le côté et le plan supérieur du cadre et définit la position d’une structure donnée dans un système spatial de coordonnées. Une combinaison de la méthode décrite avec électrophysiologie18 ou avec le modèle de blessure de la moelle épinière, où la plasticité joue un rôle essentiel dans la régénération6, est possible. Comparative études neuroanatomiques, qui peuvent également inclure des espèces rares, l’atlas de tissu irisé et les images TEM micrographiques des paramètres ultrastructurales sont des atouts précieux.

Malgré ses atouts, TEM a plusieurs limitations, en raison de la taille de l’épaisseur de l’échantillon (70 nm), la zone transversales (< 6 mm2) et la complexité de la préparation de l’échantillon. Toutefois, lorsqu’un spécimen est correctement préparé, les images TEM de l’ultrastructure de l’échantillon sont de qualité supérieure par rapport aux images produites par toute technique de lumière-microscopique. La technique de transduction in utero est limitée par le volume injecté et de la région topographique de l’injection. Sans conteste, la technique a un fort potentiel de médecin translationnel dans le traitement du développement précoce et au sauvetage des maladies neuropathologiques et malformations congénitales. En outre, la combinaison actuelle de transduction in utero avec TEM ne pourrait pas seulement considérée comme une approche pour le traitement futur des maladies et malformations congénitales, mais aussi pour des diagnostics de qualité axée sur l’ultrastructure du développement neurologique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient les collègues de l’animalerie à la faculté de médecine, Université de la Ruhr de Bochum, pour leurs soins de soutien et des animaux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26 G x 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) - For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor) -
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips -
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon - polyamide
eye lubricant Bepanthene -
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
iris forceps (10 cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor) -
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica - 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH -
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor) -
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon - Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments -
thin vibrating razor blade device Krup - with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips - up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
Ultracut E Reichert-Jung - ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

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References

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Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement
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Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).More

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

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