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Developmental Biology

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

doi: 10.3791/59084 Published: February 26, 2019
* These authors contributed equally

Summary

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

Abstract

Il presente studio combina trasduzione nell'utero, con microscopia elettronica a trasmissione (TEM), che mira ad un'analisi morfometrica precisa dei parametri ultrastrutturali in strutture topografiche inequivocabilmente identificati, colpite da una proteina di interesse che è introdotta nell'organismo tramite trasferimento virale. Questo approccio combinato consente una transizione fluida dal macrostrutturali identificazione ultrastrutturale di seguenti mappe topografiche in un Atlante di tessuto. Microscopia elettronica ad alta risoluzione del tessuto in-utero-trasdotte rivela l'ultrastruttura bene del neuropil e i relativi parametri di plasticità, quali le bouton sinaptico zone, il numero delle vescicole sinaptiche e dei mitocondri all'interno di un Profilo di bouton, la lunghezza dei contatti sinaptici, le aree di axonal, lo spessore di foderi di myelin, il numero delle lamelle di mielina e le zone di profili di mitocondri. L'analisi di questi parametri rivela intuizioni essenziali modifiche ultrastrutturali plasticità nelle aree del sistema nervoso che sono interessati dal trasferimento virale del costrutto genetico. Questo metodo combinato non può essere utilizzato solo per studiare l'effetto diretto di geneticamente biomolecole e/o droghe sulla plasticità neuronale, ma apre anche la possibilità di studiare il salvataggio nell'utero della plasticità neuronale (ad es., nel contesto della malattie neurodegenerative).

Introduction

Nessun fotone può penetrare un campione di tessuto ultrasottile del grado di profondità di un elettrone. Questo attribuisce vantaggi inestimabili a TEM a catturare immagini a risoluzione nanometrica di strutture fini rispetto alle tecniche di microscopia chiara. Ad esempio, TEM consente la visualizzazione di organelli intracellulari come i mitocondri, i melanosomes e vari tipi di granuli secretori, microtubuli, microfilamenti, ciglia, microvilli e giunzioni intercellulari (superficie cellulare specializzazioni), in particolare le sinapsi nel sistema nervoso1,2,3,4. L'obiettivo generale del presente studio metodologico è il riconoscimento ultrastrutturale dei cambiamenti nella plasticità neurale durante lo sviluppo su interferenza prenatale combinando le tecniche di state-of-the-art di trasduzione nell'utero e TEM. Viralmente codificato le proteine di interesse sono state trasdotte nell'utero nel sistema nervoso centrale5,6,7, compreso il midollo spinale6. Per esempio, nell'utero trasduzione in combinazione con TEM è stato utilizzato per studiare l'effetto della molecola di adesione cellulare L1 sull'apprendimento plasticità nei topi L1-carenti, in particolare per quanto riguarda l'interazione tra L1 e proteine recettori nucleari motorio in neuroni cerebellari7.

L'analisi dei parametri di neuroplasticità richiede informazioni precise circa la localizzazione delle zone più piccole all'interno del sistema nervoso. Pertanto, essa è sufficiente descrivere dettagli ultrastrutturali e il loro orientamento topografico esatta rispetto alle altre strutture. Nello studio presente, è presentato un metodo specifico preparatorio puntando l'indagine dettagliata di aree morfologiche distinte sulla base sia di luce e di microscopia elettronica. Questo approccio combina diverse tecniche di manipolazione dei tessuti, a partire con trasduzione nell'utero del cervello del topo e del midollo spinale e seguita dalla fissazione di aspersione, incorporamento di muffa e il tessuto di elaborazione per TEM. Un passo essenziale incluso tra l'incorporamento e la lavorazione del tessuto per TEM è la documentazione del tessuto, usando la tecnica di riflessione della luce di interferenza che permette la precisa documentazione microfotografici e basso ingrandimento dei tessuto esemplari8,9,10. Inglobato l'approccio attuale, questa tecnica permette ai ricercatori di esaminare dettagli topografici e strutturali delle superfici di tessuto nervoso e dei profili di fetta di campione prima della loro preparazione per TEM.

Una cornice speciale per il sezionamento intero cervello corrisponde alle coordinate stereotassiche. Questo telaio avvantaggia la ricostruzione (3D) tridimensionale morfologica delle aree nel tessuto nervoso e può essere utilizzato per l'analisi morfometrica. Le grafie delle sezioni visualizzate vengono assegnate coordinate topografiche e le sezioni numerate progressivamente costruire mappe in un Atlante di tessuto.

Dopo resina l'elaborazione, il tessuto incorporato è sezionato in sezioni ultrasottili (< 70 nm) contenenti aree selezionate, secondo le mappe dell'Atlante del tessuto di cui sopra. Le sezioni ultrasottili sono sottoposti a TEM per ottenere immagini ad alta risoluzione di parametri di plasticità (ad es., sezione profilo aree di boutons sinaptici o fibre assonali) del loro contenuto e dei contatti per le strutture vicine all'interno del complesso neuropil.

Con il metodo descritto nel presente documento, la transizione da macrostrutture visualizzati per micro - e nanostrutture consente studi comparativi approfonditi di plasticità neuronale morfologici dopo nell'utero trasduzione dello sviluppo nervoso sistema.

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Protocol

Tutte le procedure su soggetti animali sono state approvate dai comitati di etica animale istituzionale degli Stati federali di Amburgo e Nordrhein-Westfalen, Germania.  Utilizzare strumenti sterili, guanti protettivi e cappotti asettici durante tutta la procedura chirurgica.

1. nella trasduzione del Utero

  1. Preparare virus adeno-associato di tipo 1 (AAV1) che codifica per la destinazione desiderata (4 x 1011 virale particelle / µ l di AAV1) in tampone fosfato salino (PBS) a pH 7,4. Aggiungere 0,1 mg / µ l Fast Green e mantenere la miscela di AAV1-Fast-verde a 37 ° C.
  2. Preparare una sottile punta capillare con la forma desiderata (8 mm di lunghezza, con un diametro esterno di 80 µm e una parte interna diametro di 50 µm), con l'estrattore micropipetta (impostazioni: pressione = 500, calore = 700, pull = 0, velocità = 80, tempo = 200, vedere il tabella materiali < / c1 >). Rompere la punta del capillare in modo che è 4-5 mm.
  3. Montare un tubo aspiratore (44 x 0,7 cm) con la punta capillare e aspirare 15 µ l della miscela AAV1-Fast-verde in vaso capillare.
  4. Tenere l'animali soggetti ad una temperatura corporea costante fisiologica di 37 ° C durante tutta la procedura.
  5. Posizionare un mouse C57Bl/6 incinto (giorno embrionale 14,5) nella camera di preincubazione e anestetizzare il mouse con gassoso isoflurano 4% (con una portata volumetrica di 0,6-0,8 L/min).
  6. Iniettare per via sottocutanea, buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo).
  7. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piastra chirurgica preriscaldata (37 ° C).
  8. Coprire gli occhi con un lubrificante.
  9. Montare il mouse con la maschera di anestesia (gassoso isoflurano 1,5% a un tasso di flusso d'aria volumetrica di 0,6-0,8 L/min) sulla piastra chirurgica e rasatura della regione di pelle addominale. Pulire la regione rasata con 3 X 75% etanolo e poi con soluzione di betadine.
    Nota: Monitorare continuamente il comportamento di respirazione del mouse anestetizzato. Regolare la concentrazione del gas isoflurano secondo il modello di inspirazione-espirazione del mouse.
  10. Verificare l'assenza del riflesso plantare comprimendo le falangi di zampa posteriore del mouse.
  11. Aprire la cavità addominale afferrando la pelle con il forcipe curvo seghettato iride (10 cm) e tagliando la pelle lungo la linea mediana con forbici dritto in carburo di tungsteno (10 cm) e poi, afferrando la parete peritoneale con dritto pinzette Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) e la parete lungo la linea alba con di dritto Vanna forbici (8 cm).
  12. Posizionare un pezzo di paraffina fenestrated film sull'apertura addominale e fissare la pellicola su entrambe le estremità con micro-zanzara pinze emostatiche (12,5 cm curvata).
  13. Esporre i corni uterini con un cucchiaio come dispositivo per evitare di danneggiare gli embrioni all'interno i corni uterini. Gocciolare qualche goccia di PBS (37 ° C) sui corni uterini e ispezionare gli embrioni per danni o malformazioni all'interno del sac uterina.
  14. Documentare l'ordine e la posizione degli embrioni nei corni uterini. Girare gli embrioni con cura all'interno del sac uterino fino a quando non viene raggiunta la posizione desiderata per l'iniezione.
  15. Iniettare 1-2 µ l della miscela AAV1-Fast-verde ispezionando visivamente il sito di iniezione (ad es., i ventricoli del cervello) e la penetrazione del colorante sotto un microscopio stereoscopico.
  16. Documentare gli embrioni iniettati e rimettere i corni uterini con embrioni iniettati nella cavità addominale.
  17. Gocciolare qualche goccia di PBS (37 ° C) nella cavità addominale. Chiudere la cavità suturando la parete peritoneale (uso poliammide 6-0-dimensioni suture) e la pelle (uso poliammide 3-0-dimensioni suture), utilizzando la pinza emostatica di Halsted mosquito (12,5 cm curvata). In alternativa, utilizzare un semplice schema interrotto o in acciaio inox sutura/staples per chiudere la cavità addominale e la pelle.

2. Telemacrophotography dei tessuti isolati

  1. Preparazione di buffer
    1. Preparare tampone di Sörensen (1 L) di dissoluzione 14,95 g di Na2HPO4 e 2,18 g di KH2PO4 in 1 L di acqua distillata sotto agitazione a 200 giri/min. Per aspersione di ritardo cuccioli di gestazione e/o cuccioli nel post-partum periodi di tempo, utilizzare una dimensione appropriata di aghi per iniezione addominale o intragastrica e assicurarsi che la concentrazione dell'anestesia terminale sodio pentobarbital non superi i 180 mg / kg di peso del corpo.
    2. Preparare la soluzione di fissaggio di Mugnaini (5L) di riscaldamento 500 mL di acqua distillata fino a 75 ° C e aggiungere 50 g di polvere di paraformaldeide sotto agitazione a 200 giri/min, aggiungere 200 µ l di 5 N NaOH, aggiungendo 1.500 mL di tampone di Sörensen, 1.750 mL di acqua distillata e 500 mL di 25% glutaraldeide. Riempire fino a 5.000 mL con acqua distillata. Utilizzare questo buffer finale per aspersione.
      Nota: Preparare la soluzione di fissaggio di Mugnaini sotto il cofano, indossare occhiali protettivi ed evitare fumi. Aggiungere blu di metilene (0,05 g/L) per una migliore visualizzazione della perfusione.
  2. Isolamento di aspersione e tessuto di mouse
    1. Via irrorare i topi incinto che trasportano gli embrioni trasdotte (nel caso di studi di embrione) o il pub trasdotte nata all'età desiderata (ad esempio, postnatale giorno 24) secondo le procedure standard6,7, 11,12,13,14,15,16,17, utilizzando intraperitoneale terminale sodio pentobarbital anestesia (200 mg/kg di peso corporeo).
    2. Iniettare la via di topi con soluzione di eparina (500 U) utilizzando un G 26, 1 ago e, prima della fissazione, infondere i topi via con 10 mL di PBS per scovare l'anima dal corpo e li irrorare via con 30 mL di 40 ° C preriscaldato Mugnaini soluzione di fissaggio.
      Nota: Per topi adulti, eseguire un'aspersione retrograda alternativo tramite l' aorta addominale14.
    3. Isolare il tessuto irrorato di interesse (ad es., intero cervello o midollo spinale) e postfix il tessuto in almeno 10 mL di soluzione di fissaggio di Mugnaini per altre 24 ore a 4 ° C.
    4. Lavare il tessuto in 10 mL di PBS per 3 h a temperatura ambiente.
  3. L'incorporamento in agarosio, oltre a documentazione e sezionamento
    1. Regolare il tessuto isolato (ad es., intero cervello) in una cornice speciale con un riproducibile sezionamento angolo8,9,10. In alternativa, è possibile utilizzare un vibratomo con uno spessore di taglio regolabile.
    2. Posizionare il tessuto nervoso nel telaio, regolare il tessuto per telemacrography e documentare le coordinate.
    3. Preparare 3% basso punto di fusione dell'agarosi-incorporamento medio: aggiungere 3 g di agarosio in 100 mL di tampone di Sörensen e riscaldare la miscela in un bagno di acqua a 90 ° C.
    4. Versare agarosio al 3% (30 ° C) nel frame che contiene il tessuto. Coprire il telaio con un blocco di metallo caldo e attendere che sia avanzata. Durante l'indurimento, utilizzare dispositivi di telemacrographic per il tessuto incorporato e le sue coordinate all'interno della cornice di immagine.
    5. Trasferire il tessuto dell'agarosi-incastonato in una cornice con lacune di taglio corrispondente alle coordinate del primo fotogramma.
    6. Tagliare il tessuto incorporato in sezioni di spessore desiderato (ad esempio 1,5 mm) con un dispositivo con una lama di rasoio sottile e vibra (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Per migliorare lo scorrimento della lama di rasoio, gocciolare qualche goccia di glicerina sul tessuto incorporato.
    7. Immagine di ogni sezione di tessuto in PBS e raccogliere le immagini in una cartella.

3. preparazione del tessuto isolato per microscopia elettronica di trasmissione

Nota: Eseguire gli ulteriori passi di incubazione in piatti di vetro con coperchi ermeticamente chiudibili su una piattaforma d'agitazione sotto il cofano.

  1. Lavare le sezioni di tessuto per 2 x 30 min in PBS. Incubare le sezioni in soluzione acquosa tetrossido di osmio al 2% (OsO4) per 2 h a temperatura ambiente.
    Attenzione: Tetrossido di osmio è tossico e può essere dannoso quando viene a contatto con la pelle.
  2. Lavare le sezioni osmicated per 2 x 30 min in PBS.
  3. Incubare le sezioni in etanolo 30%, 50% e 70% a temperatura ambiente per 10-15 min (opzionale: Incubare in etanolo al 70% a 4 ° C durante la notte).
  4. Immagine di osmicated esemplari in etanolo al 70% sotto LED RGB luce8,9,10 (2 x 15 W) applicati al campione da sinistra e destra con un angolo di 45 °. Utilizzare piatti neri e sfondo nero opaco per ridurre al minimo la dispersione e la riflessione della luce durante l'illuminazione.
    Attenzione: Non consentire la sezione ad asciugarsi durante la formazione immagine.
  5. Creare un Atlante delle immagini sezione con coordinate attraverso la raccolta di immagini in serie in una cartella.
  6. Incubare i campioni in etanolo al 100% (2x per 30 min) e 100% ossido di propilene (2x per 30 min) a temperatura ambiente.
    Attenzione: Non consentono le sezioni ad asciugarsi durante la modifica di soluzioni.
  7. Mix 260 mL di resina con 240 mL di anidride acetica di dodecenylsuccinic in un recipiente di vetro, mescolando delicatamente con una barra di vetro. Controllare periodicamente per disomogeneità, bolle e sbavature. Mescolare molto delicatamente, a mano per almeno 45 min.
  8. Preparare la resina/ossido in un rapporto di 1:2 e 1:1 e aggiungere 3% accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. Incubare il tessuto in 1:2 l'incorporamento di soluzione da passo 3.8 per 2 h e poi nella soluzione 1:1 l'incorporamento da passo 3.8 per 2 h a temperatura ambiente su una ruota in movimento.
  10. Posizionare il tessuto in piatti piatto in polipropilene, coprire il tessuto con resina fresca contenente 3% acceleratore e curare il tessuto incorporato al 65-85 ° C per 12-24 h.
  11. Raffreddare il tessuto incorporato a temperatura ambiente e rimuovere i campioni di resina incorporati dai piatti in polipropilene.

4. scelta dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturale di analisi quantitativa

  1. La mappatura dell'area di interesse
    1. Scegliere un'area di interesse (ad es., ippocampo o cervelletto) e localizzare la zona nell'Atlante sezione scegliendo l'immagine dall'Atlante (passo 3.5) che contiene questa zona.
    2. I confini della zona di interesse sull'immagine sezione di schizzo e trovare/sovrapporre questi confini di regione sull'esemplare di resina.
    3. Zero-mark i bordi dell'area di interesse (ad es., ippocampo o cervelletto) il campione di resina, usando un indicatore di fine dell'ago (26 G, 1 in).
    4. Riscaldare il campione di resina a 85 ° C in un forno per ammorbidire la resina per la rifilatura o, in alternativa, utilizzare un dispositivo di taglio, una lama sottile o carta vetrata.
    5. Asportare l'area di interesse dall'esemplare di resina con una lama di rasoio (Vedi Tabella materiali). Montare l'esemplare su barre di vetro acrilico del calibro richiesto ad es., con (un diametro di 8 mm) e una lunghezza di 1 cm con la colla della holding della. Sgrossare il campione montato per semi - e il sezionamento ultrasottile.
    6. Preparare semifini (0,75 µm) e ultrasottile (70 nm) sezioni dell'area di taglio utilizzando un ultramicrotomo: impostarlo a 1,5 mm/s per 0,75 µm spessore e a 0,7 mm/s per spessore di 70 nm.
    7. Raccogliere le sezioni semifini sugli elementi portanti di vetro e macchia le sezioni con 1% toluidina blu in PBS (per 4 min.).
    8. Lavare le sezioni più volte in acqua deionizzata. Esaminare le sezioni macchiate al microscopio luce utilizzando 4 x (NA di ∞ 0,1 /-), 10 x (NA di ∞/0,17 0,22), 40 x (NA di 0,65 ∞/0,17) e 100 x obiettivi (NA di 1,25 ∞/0,17).
    9. Raccogliere sezioni ultrasottili su griglie di nichel. Le griglie con riserva di TEM 180 kV e a 3, 200 x, 6, 000 x e/o 8.000 ingrandimenti.
  2. Analisi TEM
    1. Scegliere i parametri ultrastrutturali di interesse per l'analisi quantitativa di TEM (ad es., boutons con vescicole e mitocondri o assoni myelinated e senza) e prendere le immagini TEM di questi parametri sotto i 3, x 500, 6.000 x e/o 8.000 ingrandimenti.

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Representative Results

Per anestesia affidabile e veloce di topi, sono stati considerati numerosi parametri di sicurezza e un'area di lavoro ottimizzata dell'unità anestesia si è rivelata adeguata (Figura 1A). L'unità è progettata per controllare la miscela di isoflurane liquida e aria ambiente con una precisione richiesta per riuscito ambulatorio su piccoli animali, quali topi e ratti. Aria e isoflurano sono mescolati in vaporizzatore secondo le impostazioni desiderate e consegnati in una scatola o attraverso una maschera all'animale (Figura 1A). L'organismo saprofago raccoglie e rende inattivi eventuali gas di isoflurane surplus che può essere prodotta, fornendo così un ambiente di lavoro sicuro. Il gas viene raccolto e passare attraverso carbone attivo in una cartuccia (Figura 1A).

Un set ottimizzato degli strumenti (Figura 1B) permette agli scienziati di eseguire chirurgia rapidamente sui topi incinto. Un film semplice paraffina con proprietà idrofobe impedisce l'essiccazione dopo resezione (Figura 1B) mucosa addominale. I corni uterini che harboring gli embrioni sono esposti sulla pellicola di paraffina e gli embrioni sono numerati nel modo illustrato nella Figura 1C. Una volta localizzato, gli embrioni vengono regolati nella posizione corretta per l'iniezione del virus tramite un sottile capillare (Figura 1D). L'iniezione è controllata visivamente osservando la forma di diffusione della tintura penetrante contenuta nella miscela iniettata virus (Figura 1D). Dopo l'iniezione nell'utero, i corni uterini sono inseriti nuovamente nella cavità addominale per permettere lo sviluppo di embrioni iniettati fino alla fase (ad es., fino alla nascita e raggiungendo postnatale giorno 24) che è necessario per l'esperimento (Vedi, ad esempio, Lutz et al.5 ,6 e Kraus et al.7). Per gli studi sulla plasticità sinaptica, fine delle fasi inerenti allo sviluppo o adulti sono raccomandati.

Dopo un'aspersione di perfusione degli animali nella fase desiderata, il tessuto nervoso (ad esempio, il cervello e il midollo spinale nella Figura 2) è disposto e orientato in una cornice di plastica trasparente con coordinate e incorporato in agarosio (Figura 2 A, B). Dopo il taglio, ogni sezione è imaged (Figura 2C, E, G) e poi osmicated. Dopo osmicate e incubazione in etanolo al 70% o 80%, le sezioni sono Imaging nuovamente mediante interferenza luce telemacrography8,9,10. Le sezioni di tessuto devono essere posizionate in un nero opaco che circonda per ridurre al minimo la radiazione diffusa durante l'illuminazione ad alta intensità necessaria. Tratti della fibra e diverse aree del tessuto riflettono colori iridescenti che contrastano con il fondo di tessuto scuro e (Figura 2D, F, H), emerge un modello appositamente colorato della superficie del tessuto. Tutte le immagini iridescenti si sovrappongono con le immagini nonosmicated e, insieme con le coordinate proiettate del passo incorporamento, generano mappe di navigazione della topografia del tessuto. Successivamente, il tessuto è ulteriormente disidratato e incorporato in resina. Basato sulle mappe di navigazione, aree di interesse sono scelti e ulteriormente trattati per TEM-come esempi, l'ippocampo (stratum lucidum), del cervelletto (strato delle cellule del granello) e del midollo spinale (funicolo dorsale) sono mostrati in Figura 3A1-C4 .

Nell'ippocampo e nel cervelletto, sinapsi fibre muscose sono noti per presentano caratteristiche ultrastrutturali uniche rispetto alle altre sinapsi, tra cui grande boutons presinaptici (Figura 3A1-B5). Essi possono essere facilmente localizzati con l'aiuto delle mappe navigazione iridescente stabilite durante le precedenti fasi di lavorazione. Nei loro profili di sezione trasversale, il boutons contengono un vasto numero di vescicole e mitocondri e molto spesso racchiudono diverse spine dendritiche (Figura 3A4, A5, B4, B5). Immagini TEM di questi profili consentono una quantificazione delle aree le bouton sinaptico, numeri delle vescicole sinaptiche e dei mitocondri all'interno di un profilo di bouton, la lunghezza dei contatti sinaptici e numeri di contatti siti.

Nel midollo spinale, al funicolo dorsale contiene molte fibre assonali che sono myelinated di oligodendroglia. Sulle sezioni trasversali, al funicolo dorsale può essere trovato tra entrambi i corni posteriori del midollo spinale sulle sezioni trasversali (Figura 3C1, C2). Sulle immagini di TEM, gli assoni myelinated le appaiono rotondi e i foderi di myelin che circonda gli assoni sono organizzati in lamelle (Figura 3C3, C4). Una quantificazione delle zone assonale, compreso lo spessore delle guaine di mielina e il numero di lamelle di mielina, nonché una quantificazione dei mitocondri le zone di profilo possono essere effettuate.

L'Atlante preparato e le immagini TEM micrografiche dei parametri ultrastrutturale non sono solo utili per un confronto della neuroplasticità morfologica secondo diverse condizioni di trattamento, ma anche quando un confronto tra i parametri all'interno dell'area stessa è necessario (ad esempio, un confronto tra diversi tipi di sinapsi nell' ippocampo18 e tra strutture equivalenti di diverse specie [Figura 4]).

Figure 1
Figura 1 : Preparazione per la trasduzione nell'utero. Installazione di anestesia (A) isoflurano: 1) camera di induzione di anestesia iniziale; 2) pompa; 3) anestesia unità; 4) valvola di commutazione routing; 5) alimentazione anestesia della tubazione; 6) unità organismo saprofago; 7) maschera di respirazione; 8) riscaldata tavolo operatorio; 9) binoculare stereoscopio con sorgente luminosa; 10) centralina. Apparecchi chirurgici (B): 1) rasoio elettrico; 2) lubrificante occhio; 3) nastri di fissaggio; 4) assorbenti; 5) forcipe iride (10 cm, curvata, Seghettato); 6 e 7) forbici iris (11 cm, dritto, carburo di tungsteno); 8) pinzette di Dumont (n. 3, 12 cm, dritto, 0,2 x 0,12 mm); 9) forbici di Vanna (8 cm, dritto); 10 e 11) micro-zanzara pinze emostatiche (12,5 cm curvata); 12) paraffina pellicola; 13) micro cucchiaio; 14) tamponi di cotone; mosquito pinza emostatica 15 e 16) di Halsted (12,5 cm, dritto); 17 e 18) suture (dimensione 6-0 e 3-0); 19) siringa; 20) assemblaggio di tubi aspiratore per pipette calibrate microcapillary. Schema (C) di una numerazione sistematica degli embrioni all'interno i corni uterini al giorno embrionale (E) 14,5: L = sinistra; R = destra. (D) strategie di iniezione: nei ventricoli del cervello prima e la seconda (iove e IIve, rispettivamente), quarto ventricolo (IVve) e il midollo spinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Documentazione del tessuto isolato da telemacrography. (A e B) Incorporamento di un cervello e un midollo spinale in agarosio, usando le provette con un sistema di coordinate (griglie). Dopo il taglio, le sezioni sono sottoposti a riflessione telemacrography e interferenze di formazione immagine della luce. (C-F) Sezioni trasversali e sagittale del cervello. Scala bar = 5 mm; Co = corteccia; St = STRIATO; di = diencefalo; me = mesencefalo; Ciao = ippocampo; PED = pedunculi cerebri; CE = cervelletto; mo = oblongata del midollo. Sezione trasversale (G e H) di un segmento cervicale del midollo spinale. Barra della scala = 1 mm; ahR = corno anteriore di destra; ahL = corno anteriore di sinistra; DF = funicolo dorsale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Individuazione topografica ed ultrastrutturale di plasticità parametri. (A1) Macrograph luce invertito interferenza dell'ippocampo. L'area della boutons muscosi della fibra all'interno il stratum lucidum (sl) viene evidenziata. PCL = strato delle cellule piramidali; GCL = strato delle cellule del granello. Barra della scala = 500 µm. (A2) luce microfotografia (obiettivo 100 x) di una sezione semifini (0,75 µm) mostrando stratum lucidum. Gli asterischi indicano le regioni dei boutons muscosi della fibra che circondano molte isole dendritiche (frecce nere). Toluidina colorazione blu/OsO4 . Barra della scala = 50 µm. (A3) trasmissione Micrografo elettronico ad un ingrandimento basso, visualizzando boutons di muscosi della fibra (asterischi) che circondano un dendrite (D). Il rettangolo include una bouton singola fibra muscosa. Barra della scala = 2 µm. (A4) trasmissione Micrografo elettronico del profilo sezione trasversale di un bouton singola fibra muscosa (MFB). Spine (blu) e la zona cross-section bouton (viola) sono evidenziati. m = mitocondrio; s = spine. Barra della scala = 200 nm. (A5) Vescicole sinaptiche all'interno di un MFB. Barra della scala = 100 nm. (B1) Interferenze invertito luce macrograph del cervelletto. La regione di strato delle cellule del granello (gcl) che contiene il boutons muscosi della fibra è indicata. MCL = strato molecolare; h = hilus. Barra della scala = 500 µm. (B2) luce microfotografia (obiettivo 100 x) di una sezione semifini (0,75 µm) che mostra una regione di strato delle cellule del granello che confina con le cellule di Purkinje (PC). Gli asterischi indicano le regioni dei boutons muscosi della fibra che sono circondati da molti neuroni cerebellari del granello (CGN). Toluidina colorazione blu/OsO4 . Barra della scala = 50 µm. (B3) trasmissione Micrografo elettronico ad un ingrandimento basso, mostrando la zona di MFBs. Il rettangolo include un singolo MFB. Barra della scala = 2 µm. (B4) trasmissione Micrografo elettronico del profilo sezione trasversale di un fungo-come MFB all'interno dello strato delle cellule del granello del cervelletto. La zona cross-section bouton (viola) e privo di vescicola spine (blu) vengono evidenziati. Barra della scala = 1 µm. (B5) i mitocondri (viola) e vescicole sinaptiche all'interno di un MFB. Barra della scala = 150 nm. (C1) Interferenze invertito luce macrograph del midollo spinale. L'area del funicolo dorsale (df) che contiene gli assoni myelinated pesantemente viene evidenziata. ahR e ahL = destra e sinistra del corno anteriore, rispettivamente; phR e phL = destra e sinistra corno posteriore, rispettivamente. Barra della scala = 500 µm. (C2) luce microfotografia (obiettivo 100 x) di una sezione semifini (0,75 µm) mostrando il funicolo dorsale che è arricchito con gli assoni myelinated pesantemente (ax) che sono chiaramente distinguibili da senza fibre (asterischi). CT = tessuto connettivo. Toluidina colorazione blu/OsO4 . Barra della scala = 50 µm. (C3) trasmissione Micrografo elettronico di profili di sezioni trasversali degli assoni myelinated e senza (ax, viola). mio = foderi di myelin. Barra della scala = 200 nm. (C4) Il rettangolo mostra alta-ingrandito, pesantemente myelinated assoni con lamelle di mielina e senza fibre. I microtubuli (mt) e mitocondri (m) all'interno le fibre assonali sono visibili. Barra della scala = 50 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Esempi di parametri di plasticità ultrastrutturali in diversi modelli animali. (A) boutons muscosi della fibra nel cervelletto di uno squalo. Barra della scala = 400 nm. (B) bouton fibre muscose nell'ippocampo di un macaco rhesus. Barra della scala = 200 nm. Giunzione neuromuscolare (C) di un gatto. Barra della scala = 300 nm. (D) boutons sinaptici nel nigra di substantia pars reticularis di un phalanger. Gli asterischi indicano la densità post-sinaptica (PSD; nell'inserto: nero le punte di freccia). Il rettangolo mostra un PSD ingrandito. Barra della scala = 400 nm. (E), A nonmyelinating delle cellule di Schwann (SC) che circondano molte fibre assonali nel ganglio spinale di un mouse. Nelle vicinanze, fibre myelinated pesantemente sono visibili. Barra della scala = 300 nm. Per tutti i pannelli: ax = assone; D = dendrite; m = mitocondrio; MFB = bouton muscosi della fibra; MF = muscosi della fibra; mio = foderi di myelin; s = colonna vertebrale; sa = apparato della colonna vertebrale; SV = vescicole sinaptiche. Siti di contatto (densità postsinaptica) sono contrassegnati con un asterisco. Aree di sezione trasversale sono evidenziate in viola e blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un passo cruciale di trasduzione nell'utero è la procedura di iniezione. L'iniezione precisa nei ventricoli del cervello o in un'altra area di interesse richiede esperienza e abilità pratiche. Più sottile è la punta di microcapillary, può verificarsi il meno danno tessutale; Tuttavia, questo è a costo di aumentare la pressione di iniezione. In contrasto con elettroporazione nell'utero19,20,21,22, il tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati dopo trasduzione nell'utero è molto alto. Tutti gli embrioni del corno uterino possono essere iniettati, anche se gli embrioni sono situati presso le radici dei corni uterini e devono essere regolati all'interno del sac uterino. Le fasi di sviluppo di iniezione e di analisi possono essere adattate alla domanda scientifica.

Quando iniettate nei ventricoli del cervello, le particelle di AAV1 sono distribuite tramite il liquido cerebrospinale attraverso l'intero sistema ventricolare. Strutture in via di sviluppo con superfici che sono in stretto contatto con il liquore, come l'ippocampo e il cervelletto, vengono trasdotti dalla particelle virali applicata5,6,7. Un'analisi dei cambiamenti nei parametri ultrastrutturali, quali dimensioni bouton, aree le bouton, numeri delle vescicole sinaptiche, i numeri dei mitocondri e numeri e lunghezza dei contatti sinaptici in queste strutture, è un'elegante lettura per ultrastrutturali plasticità. Il metodo di trasduzione nell'utero può essere applicato per lo studio di aree differenti del cervello, così come il midollo spinale6. Inoltre, altri organi e tessuti allo stesso modo possono essere scelti come bersagli di trasduzione. Infine, il modello di uso frequente del mouse può essere sostituito da altre specie come richiesto.

La fotografia delle fette del tessuto permette una dissezione molto precisa di resina-embedded campioni per microscopia elettronica di trasmissione. Poiché l'orientamento spaziale del campione è definito, è stato omesso un taglio ampio e che richiede tempo. Inoltre, nelle regioni limitrofe cruciale possono essere mantenute nella loro reciproca relazione originale. Un importante vantaggio di passaggio la documentazione fotografica è la possibilità di monitorare la qualità della fissazione del tessuto e di riconoscere alterazioni patologiche. Così, la qualità della fissazione e l'incorporamento del materiale è di fondamentale importanza. Nonsuitable campioni contenenti manufatti possono essere esternalizzati prima dell'ulteriore elaborazione.

La serie Micrografo delle fette del tessuto imaged forniscono un utile Atlante morfologico. Per gli Studi neuroanatomici comparativi, che possono includere anche specie rare, l'Atlante è un prezioso archivio. La scelta dello spessore delle fette del tessuto dipende dalla domanda scientifica indirizzata ed è limitata dalle dimensioni dell'esemplare del tessuto. Per piccoli animali, dovrebbe essere regolato uno spessore fino a 1 mm. Sezioni molto spesse (> 5 mm) non sono consigliate, a causa della capacità limitata penetrazione di tetrossido di osmio8,9,10.

La documentazione di telemacrophotography è essenziale per gli studi morfometrici. Esso offre una correlazione fissa della superficie del tessuto sul lato e il piano superiore del telaio e definisce la posizione di una determinata struttura in un sistema di coordinate spaziali. Una combinazione del metodo descritto con elettrofisiologia18 o con il modello di ferita del midollo spinale, dove la plasticità svolge un ruolo essenziale nella rigenerazione6, è possibile. Per gli Studi neuroanatomici comparativi, che possono includere anche specie rare, l'Atlante di tessuto cangiante e le immagini TEM micrografiche dei parametri ultrastrutturali sono beni preziosi.

Nonostante i suoi punti di forza, TEM presenta diverse limitazioni a causa delle dimensioni di spessore del campione (70 nm), la zona le (< 6 mm2) e la complessità della preparazione del campione. Tuttavia, quando un esemplare è accuratamente preparato, le immagini TEM di ultrastruttura del provino sono di qualità superiore rispetto alle immagini prodotte mediante tecniche luce-microscopico. La tecnica di trasduzione nell'utero è limitata dal volume iniettato e la regione topografica dell'iniezione. Indiscutibilmente, la tecnica ha un forte potenziale di medico traslazionale nel trattamento dello sviluppo precoce e nel salvataggio delle malattie congenite neuropathological. Inoltre, l'attuale combinazione di trasduzione nell'utero con TEM potrebbe essere considerata non solo come un approccio per il trattamento futuro di malattie congenite, ma anche per la diagnostica di alta qualità basati su ultrastruttura neurodevelopmental.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano i colleghi della struttura animale alla facoltà di medicina, Università della Ruhr di Bochum, per la loro cura di animali e di supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26 G x 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) - For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor) -
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips -
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon - polyamide
eye lubricant Bepanthene -
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
iris forceps (10 cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor) -
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica - 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH -
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor) -
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon - Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments -
thin vibrating razor blade device Krup - with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips - up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
Ultracut E Reichert-Jung - ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

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References

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Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale
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Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).More

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

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