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Developmental Biology

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

doi: 10.3791/59084 Published: February 26, 2019
* These authors contributed equally

Summary

透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。

Abstract

本研究は興味の蛋白質によって影響される、明確に識別された地形構造の微細構造パラメーターの正確な寡を目指して透過型電子顕微鏡 (TEM) で子宮内で伝達を組み合わせたウイルスの転送を介して生物に導入されます。この手法により、細孔から微細構造同定へのスムーズな移行のため組織アトラスの次の地形のナビゲーション マップ。子宮導入組織の高分解能電子顕微鏡、神経とその可塑性パラメーター、断面のシナプスブートン エリア、シナプス小胞内のミトコンドリア数などの細かい微細構造を明らかにする、ブートン プロファイル、シナプス、断面の軸索地域、ミエリン鞘の太さ、髄鞘層板の数とミトコンドリア プロファイルの断面領域の長さ。これらのパラメーターの解析では、神経系の遺伝的構造のウイルスの伝達によって影響を受けるエリアの微細構造可塑性の変化に重要な洞察力を明らかにします。これらの併用のみ神経可塑性に遺伝子組み換えの生体分子や薬剤の直接影響を研究するため使用しないことができますが、また (のコンテキストでは例えば、神経可塑性の子宮内で救助を勉強する可能性を開きます神経変性疾患)。

Introduction

光子は、電子の深さのグレードで極薄の組織標本を貫通できます。これはナノメートル微細構造の光学顕微鏡技術と比較した場合の解像度の画像をキャプチャで TEM に貴重な利点を属性します。たとえば、TEM は、分泌顆粒、微小管、フィラメント、繊毛、絨毛上皮 (細胞表面の様々 なタイプ、メラノソーム、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの可視化特殊化)、特に神経系1,2,3,4シナプスします。本方法論研究の全体的な目標です神経可塑性変化の微細構造認識出生前干渉時に開発時に子宮内での伝達と TEM の最新の技術を組み合わせることによって興味のバイラル符号化された蛋白質は、中枢神経系5,676脊髄などに子宮内で導入されています。例えば、子宮内で伝達電子顕微鏡との組み合わせでは細胞接着分子 L1 の運動 L1 と核内受容体タンパク質間の相互作用に関して、特に L1 欠損マウスにおける可塑性を学習に及ぼす影響を研究するため使用されています小脳ニューロン7

神経可塑性パラメーターの解析には、中枢神経系内の最小領域の局在に関する正確な情報が必要です。したがって、微細構造の詳細とその他の構造についての正確な地形向きについて説明するのには十分です。本研究では光と電子顕微鏡観察に基づく明瞭な形態の区域の詳しい調査を目指して特定の準備メソッドが表示されます。このアプローチは、組織操作、マウスの脳および脊髄の子宮内での伝達から始まる、および灌流固定後のいくつかのテクニックを組み合わせた金型埋め込むと TEM の組織を処理します。埋め込みと TEM のティッシュの処理の間に含まれている重要なステップはの microphotographic と低倍率の正確なドキュメントは、干渉光の反射法による組織のドキュメント組織標本8,9,10。本手法により、神経組織表面と TEM の準備の前に供試体スライス プロファイルの地形と構造の詳細を検討する研究手法に組み込まれ、.

頭脳全体の区分のための特別なフレームは、定位座標に対応します。このフレームは神経組織の区域の形態の三次元 (3 D) 再構成を利点し、形態分析に使用することができます。可視化のセクションの macrographs が地形座標を割り当てられ、連番付きのセクション組織アトラスのマップを構築します。

樹脂加工後で超薄切片に埋め込まれた組織の断面 (< 70 nm) 上記組織アトラスの地図によると、選択したエリアを含んでいます。その内容と連絡先団地内近隣構造物への塑性パラメーター (例えば、シナプス ボタンまたは軸索線維のプロファイル領域を断面するなど) の高解像度の画像を取得する TEM を超薄切片を受けます神経網。

記載の方法で可視化破面観察からマイクロ構造およびナノ構造への滑らかな移行は以後の子宮内開発の神経形態学的神経可塑性の詳細な比較を許可します。システム。

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Protocol

動物の主題のすべてのプロシージャは、ハンブルク、ドイツのノルトライン ・ ヴェストファーレン州の州の動物倫理委員会によって承認されています。 滅菌器具、手袋、外科プロシージャ全体で無菌のコートを使用します。

1. 子宮伝達で

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 でアデノ随伴ウイルス タイプ 1 (AAV1) (4 x 1011ウイルス粒子/μ AAV1) の目的のターゲットのためのコーディングを準備します。0.1 mg/μ L の高速グリーンを追加し、37 ° C で AAV1 高速グリーン混合物を保持
  2. 目的の形をした薄いキャピラリー先端を準備 (80 μ m と内側の外側の直径、長さ 8 mm 直径 50 μ m)、マイクロ ピペットの引き手を使用して (設定: 圧力 = 500、熱 700、プルを = = 0、速度 = 80、時間 = 200、材料表を参照してください ).それは 4-5 mm、キャピラリーの先端を破る。
  3. キャピラリーの先端に吸引器チューブ (44 × 0.7 cm) をアセンブルし、毛細血管に AAV1 高速グリーンの混合物の 15 μ L を吸引します。
  4. プロシージャ全体で 37 ° C の一定の生理的体温で動物の科目を維持します。
  5. エームスプレインキュベーションの商工会議所に妊娠 c57bl/6 マウス (萌芽期日 14.5) を置き、麻酔ガスの 4% イソフルランとマウス (体積気流率 0.6 0.8 L/分)。
  6. ブプレノルフィン (体重の 0.1 mg/kg) を皮下注入します。
  7. Prewarmed 外科プレート (37 ° C) を麻酔下のマウスを置きます。
  8. 潤滑剤で目をカバーします。
  9. 麻酔マスクを持つマウスを合わせて (0.6 から 0.8 の体積風量でガスの 1.5% イソフルラン L/分) 外科プレート、ひげをそる腹部皮膚領域。剃毛地域 3 X 75% エタノールとし、betadine ソリューションを拭いてください。
    注:麻酔下のマウスの呼吸動作を継続的に監視します。マウスの吸入吐出パターンに従ってイソフルラン麻酔ガスの濃度を調整します。
  10. マウスの後肢の指骨を絞ることによって足底反射の有無を確認します。
  11. 曲線鋸歯状アイリス鉗子 (10 cm) で皮膚をつかんで、ストレート超硬はさみ (10 cm)、リネア正中に沿って皮膚を切断し、ストレート ・ デュモン ピンセット (12 cm、0.2 mm と腹膜壁を掴んで腹部キャビティを開く× 0.12 mm) とストレート ヴァンナの白線に沿って壁を切断はさみ (8 cm)。
  12. 腹部の開口部に穴あきパラフィン フィルムの部分を置き、マイクロ モスキート止血鉗子 (12.5 cm の曲線) と両端にフィルムを修正します。
  13. 子宮角内の胚への損傷を避けるためにスプーンのようなデバイスと子宮角を公開します。子宮角に PBS (37 ° C) を数滴を滴下し、損害または奇形子宮嚢内胚を確認します。
  14. 子宮角の胚の位置や順序を文書化します。注入の目的の位置に到達するまで慎重に子宮嚢内胚をオンにします。
  15. AAV1 高速グリーンの混合物の 1-2 μ L を注入すると、注入部位 (例えば、脳室) および顕微鏡の下で染料の浸透を視覚的に調べることによって。
  16. 注入された胚を文書化し、腹腔内に注入された胚と子宮角を配置します。
  17. 腹腔内に PBS (37 ° C) を数滴を滴下します。腹腔の壁 (使用ポリアミド 6-0 サイズ縫合糸) や皮膚 (使用ポリアミド 3 0 サイズ縫合)、ホルステッドのモスキート止血鉗子 (12.5 cm) 曲線を使用して縫合して空洞を閉じます。また、単純なパターンに中断またはステンレス製縫合/ステープルを使用する腹部キャビティそして皮膚を閉じます。

2. 隔離されたティッシュの Telemacrophotography

  1. バッファーの準備
    1. Na2HPO4と 1 l 蒸留水 200 rpm で攪拌下の瀬2PO4 2.18 g 溶解の 14.95 gデニスソレンセンのバッファー (1 L) を準備します。灌流末の胎仔および/または出生後の子犬期間、腹部や胃内注入用針の適切なサイズを使用して、ターミナル ナトリウム ペントバルビ タール麻酔濃度が 180 mg を超えないことを確認してください/体の kg の重量を量る。
    2. 75 ° C に蒸留水 500 mL を加熱することによってMugnainiの固定の解決 (5 L) を準備し、5 の 200 μ L を追加する、200 rpm で攪拌下パラホルムアルデヒド粉末 50 g を追加する N 水酸化ナトリウム、デニスソレンセンのバッファーの追加 1,500 mL、1,750 mL の蒸留水、と 25% グルタルアルデヒドの 500 mL。5,000 mL を蒸留水に詰めます。灌流のこの最後のバッファーを使用します。
      注: ボンネットの下の Mugnaini の固定の解決を準備、保護メガネを着用し、煙を避けるため。灌流のより良い視覚化のメチレン ブルー (0.05 g/L) を追加します。
  2. マウスの血流と組織の分離
    1. Transcardially が導入された胚 (胚研究) の場合、または標準手順6,7によると希望年齢 (例えば、生後 24 日目) で生まれた導入されたパブを運ぶ妊娠マウスを灌流します。 11,12,13,14,15,16,17, 腹腔内ターミナル ナトリウム ペントバルビ タールを使用して麻酔 (体重の 200 mg/kg)。
    2. マウス transcardially を注入マウスを吹き込む 26 G、針と、固定の前に 1 を使用して (500 U)、ヘパリン溶液を 10 ml、体内から血液を洗い流すし、30 ml 40 ° C prewarmed Mugnaini の transcardially を灌流する PBS の transcardially固定の解決。
      注:成体マウスの腹部大動脈14経由で代替の逆行性血流を実行します。
    3. 興味 (全脳や脊髄など) の灌流の組織を分離し、4 ° C で 24 時間の別の Mugnaini の固定の解決の少なくとも 10 mL で組織を置
    4. 室温で 3 h の 10 mL の PBS で組織を洗浄します。
  3. アガロース、およびドキュメントに埋め込み、セクショニング
    1. 再現性のある断面角度8,9,10特別なフレームの分離組織 (例えば、全脳) を調整します。また、調節可能な切削厚、vibratome を使用します。
    2. フレームに神経組織を配置、telemacrography のための組織を調整し、座標を文書化します。
    3. 3% 低融点アガロース埋め込みメディアの準備: agarose の 3 g を 100 mL のデニスソレンセンのバッファーの追加し、90 ° C の水浴中で混合物を熱
    4. 組織を含む枠の 3% の agarose (30 ° C) を注ぐ。暖かい金属ブロックとフレームをカバーし、それが硬化するまで待ちます。硬化中に埋め込まれた組織とその座標フレーム内のイメージを telemacrographic デバイスを使用します。
    5. 最初のフレームの座標に対応する切削ギャップのあるフレームに agarose 埋め込まれたティッシュを転送します。
    6. 薄いと振動のかみそりの刃を備えたデバイスで所望の厚さ (例えば、1.5 mm) のセクションに埋め込まれた組織を削減 (材料の表を参照してください)。
      注:かみそりの刃の滑走を改善するために埋め込まれた組織にグリセリン数滴を滴下します。
    7. PBS で各切片を画像フォルダーに画像を収集しています。

3. 分離組織の透過電子顕微鏡用の準備

注:フードの下で動揺のプラットホームのしっかりと開閉蓋とガラス皿で培養の以降のすべての手順を実行します。

  1. PBS で 2 x 30 分間ティッシュ セクションを洗います。室温で 2 時間 2% 水溶液四酸化オスミウム ソリューション (OsO4) のセクションを孵化させなさい。
    注意:四酸化オスミウムは有毒、皮膚接触すると有害のおそれ。
  2. PBS で 2 × 30 分の osmicated セクションを洗います。
  3. 10-15 分の室温で 30%、50%、70% エタノールでセクションを孵化させなさい (オプション: 4 ° C で 70% エタノールで一晩インキュベート)。
  4. LED RGB 光8,9,10 (2 x 15 W) 70% エタノールで osmicated の標本は、45 ° の角度で左右からサンプルに適用するイメージ。散乱とイルミネーションの中に、光の反射を最小限に抑えるため黒い皿および鈍い黒の背景を使用します。
    注意:イメージ投射の間を乾燥させるセクションを許さない。
  5. シリーズ フォルダー内の画像を収集することにより、座標を持つセクション画像のアトラスを作成します。
  6. 100% エタノール (30 分の 2 倍)、室温で 100% のプロピレンの酸化物 (30 分の 2 倍) に標本を孵化させなさい。
    注意:セクションにソリューションを変えながら乾くようにしてください。
  7. ドデセニルこはく酸ガラス容器内の 240 mL と優しくガラス棒で攪拌しながら 260 mL の樹脂を混ぜます。不均質性、泡と汚れを定期的にチェックします。非常に優しく、少なくとも 45 分手でかき混ぜます。
  8. 1:2 と 1:1 の比率で樹脂/プロピレンの酸化物を準備し、3% アクセラレータ (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol) を追加.
  9. 1:2 のステップ 3.8 2 h し 1:1 の埋め込みソリューションのステップ 3.8 から 2 時間室温で回転ホイール上からソリューションを埋め込み組織を孵化させなさい。
  10. フラット ポリプロピレン皿にティッシュを置き、ティッシュをかぶせて 3% アクセラレータを含む新鮮な樹脂と 12-24 時間の 65-85 ° C で埋め込まれた組織を治します。
  11. 埋め込まれた組織を室温に冷却し、ポリプロピレンの料理から樹脂包埋標本を削除します。

4. 定量分析のための超微細構造の神経可塑性パラメーターの選択

  1. 関心のある領域のマッピング
    1. (例えば、海馬や小脳) 関心の領域を選択し、このエリアを含むアトラス (ステップ 3.5) からイメージを選択してセクション アトラス地区をローカライズします。
    2. 断面画像に関心のある領域の境界線をスケッチし、樹脂試料の上にこれらの地域のボーダーを見つける/スーパーイン ポーズします。
    3. スクラッチ マーク (26 G、1 で) 細針ゲージを使用して、樹脂試料 (例えば、海馬や小脳) 関心のある領域の国境。
    4. トリミング用樹脂を柔らかくしたり、また、トリミング装置、薄い刃またはサンドペーパーを使用するオーブンで 85 ° C に樹脂試験片を加熱します。
    5. かみそりの刃をもつ樹脂試料から関心のある分野を消費税 (材料の表を参照してください)。試料をマウント接着剤など (直径 8 mm) と長さ 1 cm 必要な口径のアクリル ガラスのバーを保持しています。準超薄切片とマウントされた試料をトリミングします。
    6. グリコールメタクリル (0.75 μ m) を準備し、極薄 (70 nm)、ウルトラミクロトームを使用してトリミング領域のセクション: 0.75 μ m 厚 1.5 mm/s と 70 nm 厚さ 0.7 mm/s でそれを設定。
    7. ガラス担体にグリコールメタクリル セクションを収集し、(4 分) 用 PBS で青 1% トルイジンのセクションを染色します。
    8. 何度か脱イオン水内のセクションを洗います。4 x を使用して光学顕微鏡の下でステンド グラスのセクションを調べる (0.1 ∞ の NA/-), 10 (0.22 ∞/0.17 の NA)、x 40 x (0.65 ∞/0.17 の NA)、(1.25 ∞/0.17 の NA) 目標 × 100。
    9. ニッケル グリッドの超薄切片を収集します。180 で TEM グリッドの対象 kV、3、200 x、6, 000 x および/または 8,000 倍の倍率。
  2. TEM 分析
    1. 定量的な TEM 分析 (例えば、小胞とミトコンドリアや有髄と無髄の軸索の研究) のための興味の微細構造パラメーターの選択し、これらのパラメーター未満 3 8,000 倍の倍率や 6,000 x 500 x の TEM 画像を取る。

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Representative Results

マウスの信頼性と高速麻酔の安全な多数のパラメーターが考慮されたと麻酔ユニットの最適化されたワークスペースが十分な (図 1A) をあることを証明しました。単位は、マウスやラットなどの小動物の手術の成功に必要な精度で液体イソフルランと周囲の空気の混合を制御するために設計されています。空気とイソフルランは目的の設定によると気化器の混合し、動物 (図 1A) ボックスに、マスクを配信しました。スカベン ジャーは、収集し、安全な作業環境を提供するため、生成される任意のイソフルラン麻酔余剰ガスを不活性化します。ガスの収集し、カートリッジ (図 1A) でアクティブな石炭を通過しました。

妊娠マウスに対する手術を迅速に実行する楽器 (図 1B) の最適化されたセット作成できます。疎水性のプロパティを持つ単純なパラフィン フィルムは、腹部の粘膜を切除 (図 1B) 乾燥から防ぎます。胚をかくまっている子宮角がパラフィン フィルム上に公開され、胚が図 1Cに示すように番号が付けられます。ローカライズは、胚が細いキャピラリー (図 1D) を介してウイルスの注入のための正しい位置に調整されます。注入は、注入されたウイルスの混合物 (図 1D) に含まれる鋭い染料の拡散形状を観察することによって視覚的に制御されます。子宮内注入後子宮角が (参照、たとえば、ルッツら5 実験に必要な (例えば、まで誕生、生後 24 に達する) 段階まで注入された胚の開発を許可する腹腔内で再配置されます。 ,6とクラウスら7)。シナプス可塑性に関する研究、発達や成人後期が推奨されます。

目的の段階で動物の transcardial 流後、神経組織 (脳と脊髄の図 2など) は配置座標を持つ透明なプラスチック フレームで指向し、アガロース (図 2に埋め込まれました。A、B)切断した後、各セクションは (図 2C, E, G) のイメージを作成し、osmicated。Osmication は、70% か 80% エタノールでインキュベーション後のセクションは再び画像処理による干渉光 telemacrography8,9,10。ティッシュ セクションは、必要な高輝度照明の中に散乱を最小限に抑えるために鈍い黒周辺に置かれなければなりません。維路と組織のさまざまな分野暗い組織背景をコントラスト虹の色を反映し、組織面の特に色のパターンが現れる (図 2D, F, H)。Nonosmicated 画像虹色のすべてのイメージに重ね書きされ、投影座標埋め込み手順、組織地形のナビゲーション マップを生成します。次に、組織はさらに脱水し、樹脂に埋め込まれています。ナビゲーション マップを基に、関心のある分野が選択、さらに TEM の処理-海馬 (透明層の直下)、小脳 (顆粒細胞層)、および脊髄 (背側索)、図 3A1 C4 に示す例として.

海馬と小脳、苔状線維シナプスが大きなシナプス ボタン (図 3A1 B5) を含む他のシナプスと比較してユニークな微細構造の特性を展示する知られています。彼らは、前の処理ステップの間に確立された虹色のナビゲーション マップの助けを借りて簡単にローカライズできます。断面、自分のプロファイルで、研究は小胞とミトコンドリアの膨大な数が含まれて、非常によく (図 3A4, A5, B4, B5) 複数の樹状突起スパインを囲みます。これらのプロファイルの TEM 像は、断面シナプスブートン エリア、シナプス小胞とブートン プロファイル内でミトコンドリアの数、シナプスの連絡先、連絡先のサイトの数の長さの定量化を許可します。

脊髄には背側索にはオリゴデンドログリアによって有髄である多くの軸索線維が含まれています。横断セクション、背側索脊髄の横断セクション (図 3C1 C2) の両方の後部角の間に見つけることができます。TEM 画像を断面の有髄軸索がラウンド表示され、軸索を取り巻く髄鞘がラメラ (図 3C3、C4) に編成されます。断面積が実施することができます断面のミトコンドリアの定量化と同様、ミエリン鞘と髄鞘層板の数の厚さを含む断面の軸索地域の定量化。

準備のアトラスと微細構造パラメーターの顕微鏡 TEM 像はただ治療のさまざまな条件に形態学的神経可塑性の比較のために有用もとき同じエリア内のパラメーターの比較必要です (例えば、比較 [図 4] の異なる種と同等の構造と異なるタイプ18海馬におけるシナプスの間)。

Figure 1
図 1: 子宮内での情報伝達のための準備。(A) イソフルラン麻酔のセットアップ: 1) 誘導室初期麻酔;2) ポンプ;3) 麻酔の単位;4) ルーティング スイッチ弁;5) 麻酔供給管;6) スカベン ジャー ユニット;7) 呼吸マスク;8) 温水手術台。光源; 9) 両眼万国実体写真10) 制御ユニット。(B) 手術装置: 1) 電気シェーバー。2) 目の潤滑剤;3) 固定テープ。4) 生理用ナプキン。5) アイリス鉗子 (10 cm、湾曲、鋸歯状);6 と 7) アイリスはさみ (11 cm、ストレート、タングステン カーバイド);8) ・ デュモン ピンセット (#3、12 cm、ストレート、0.2 × 0.12 mm);9) ヴァンナのはさみ (8 cm、ストレート);10 および 11) のマイクロ モスキート止血鉗子 (12.5 cm、湾曲した);12) パラフィン フィルム;13) マイクロ スプーン。14) 綿棒。15 および 16) ホルステッド モスキート止血鉗子 (12.5 cm、ストレート);17 と 18) 縫合糸 (サイズ 6-0 および 3-0);19) 注射器;20) アスピレータ ピペット校正マイクロキャピ ラリーのチューブ ・ アセンブリ。(C)日 (E) 14.5 子宮角内胚の体系的な番号付けのスキーム: L = 左;R = 右。(D)注入の戦略: 最初と 2 番目の脳室に (私veと IIve、それぞれ)、(IVve)、第 4 脳室と脊髄。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: Telemacrography による分離組織のドキュメント。(AB)脳と脊髄のアガロース、キュヴェットを用いた座標システム (グリッド) に埋め込みます。Telemacrography と干渉反射を受けるがセクション切断した後、光のイメージング。(CF)脳の横断および矢状セクション。スケール バー = 5 mm;co = 野。st = 線条体;ディ = 間脳。私 = 中脳;こんにちは = 海馬。ped = pedunculi 脳腫瘍;ce = 小脳;mo = 延髄。(GおよびH) 脊髄の頸部のセグメントの横断セクション。スケール バー = 1 mmahR = 右前角;ahL = 左前角;df 背側索を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 塑性パラメーターの地形および超微細構造の同定します。(A1)海馬の干渉光原寸を反転します。透明層の直下 (sl) 内の苔状線維研究の領域が強調表示されます。pcl = 錐体細胞層;gcl 顆粒細胞層を =。スケール バー = 500 μ m. (A2) 光顕微鏡写真 (× 100 対物) 層タペタムを示すグリコールメタクリル セクション (0.75 μ m) の。アスタリスクは、樹状の島々 (黒矢印) を囲む苔状線維研究の領域を示します。トルイジン ブルー/OsO4染色。スケールバー = 50 μ m. (A3) 透過電子顕微鏡写真低倍率で示す苔状線維研究 (アスタリスク) を周囲の樹状突起 (D)。四角形には、単一の苔状線維のブートンが含まれています。スケール バー = 2 μ m. (A4) 透過電子顕微鏡写真の単一の苔状線維ブートン (MFB) の断面形状。棘 (青) と断面ブートン区域 (バイオレット) がハイライトされます。m = ミトコンドリア;s = 棘。スケール バー = 200 nm。(A5)MFB 内シナプス小胞。スケールバー = 100 nm。(B1)小脳の干渉光原寸を反転します。苔状線維の研究を含む顆粒細胞層 (gcl) の領域が示されます。mcl = 分子層;h = 門部。スケール バー = 500 μ m. (B2) 光顕微鏡写真 (× 100 対物) プルキンエ細胞 (PC) の国境顆粒細胞層の領域を示すグリコールメタクリル セクション (0.75 μ m) の。アスタリスクは、苔状線維の研究多くの小脳顆粒ニューロン (CGN) に囲まれている地域を示しています。トルイジン ブルー/OsO4染色。スケールバー = 50 μ m. (B3) 透過電子顕微鏡写真 MFBs の領域を示す、低倍率で。四角形には、単一の MFB が含まれています。スケール バー = 2 μ m. (B4) 透過電子顕微鏡写真の小脳の顆粒細胞の層内のキノコのような MFB の断面形状。ブートン断面 (バイオレット)、小胞無料棘 (青) が強調表示されます。スケール バー = 1 μ m. (B5) ミトコンドリア (バイオレット)、シナプス小胞、MFB の中。スケール バー = 150 nm。(C1)脊髄の干渉光原寸を反転します。大きく有髄軸索を含む背索 (df) の領域が強調表示されます。ahR と ahL = 右とそれぞれ; 左から前角、phR、phL = 右、それぞれ後部の角を左します。スケール バー = 500 μ m. (C2) 光顕微鏡写真 (× 100 対物) 大きく有髄軸索 (ax) 無髄線維 (アスタリスク) と明確に区別が濃縮されて背側索を示すグリコールメタクリル セクション (0.75 μ m) の。ct = 結合組織。トルイジン ブルー/OsO4染色。スケールバー = 50 μ m. (C3) 透過電子顕微鏡写真有髄と無髄軸索 (ax、バイオレット) の断面プロファイルの。私ミエリン鞘を =。スケール バー = 200 nm。(C4)四角形は、髄鞘層板と無髄線維高拡大、大きく有髄軸索を示しています。(Mt) の微小管と軸索線維内のミトコンドリア (m) が表示されます。スケールバー = 50 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 異なる動物モデルで微細構造の塑性パラメーターの例です。(A) サメの小脳苔状線維研究。スケール バー = 400 nm。(B)、アカゲザルの海馬苔状線維ブートン。スケール バー = 200 nm。(C) 猫の神経筋接合部です。スケールバー = 300 nm。(D)、phalanger の pars 斑黒質でシナプスの研究。印はシナプス後密度 (PSD; はめ込み: 黒の矢印)。四角形は、拡大された psd ファイルを示しています。スケール バー = 400 nm。(E) A nonmyelinating マウスの脊髄神経節の軸索線維多くを取り巻くシュワン細胞 (SC)。近隣には大きく有髄線維が表示されます。スケールバー = 300 nm。すべてのパネル: ax = 軸索;D = 樹状突起;m = ミトコンドリア;MFB = 苔状線維のブートン;MF = 苔状線維;私 = 髄鞘。s = 脊柱;sa = 背骨装置;sv シナプス小胞を =。お問い合わせサイト (シナプス後肥厚部) は、アスタリスクで示されます。面積は、紫と青でハイライトされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

子宮内での情報伝達の重要なステップは、注入の手順です。脳室または興味の別の領域に精密成形には、経験と実践的なスキルが必要です。シンナーのマイクロキャピ ラリー チップ以下の組織の損傷が発生します。しかし、これは射出圧力の増加を犠牲にしては。子宮内でエレクトロポレーション19,20,21,22と対照をなして子宮内で伝達後注入された胚の生存率は非常に高い。子宮角のすべての胚は、胚は子宮角の根元に位置し、子宮嚢内に再調整される必要がある場合でも注入することができます。インジェクションや分析の発達段階は、科学的な質問に合わせることができます。

脳室に注入、AAV1 粒子が全体の心室システムを介して脳脊髄液を介して配布されます。開発は、表面構造海馬と小脳を適用されたウイルス粒子5,6,7で導入、酒との接触を閉じる。ブートン サイズ、断面ブートン エリア、シナプス小胞の数、ミトコンドリア、数と数字シナプス連絡先これらの構造の長さなどの微細構造パラメーターの変化の分析はのエレガントな読み出し微細構造の可塑性。子宮内での伝達方法は、脊髄の6と同様、異なった頭脳区域の研究に適用できます。また、他の臓器や組織同様に選択できます伝達ターゲットとして。最後に、必要に応じて他の種によって頻繁に使用されたマウス モデルを置き換えることができます。

透過電顕用樹脂包埋試料の非常に正確な郭清組織スライスの撮影が可能です。サンプルの空間的なオリエンテーションが定義されているので、広範な時間のかかる加工は省略されました。また、重要な隣接地域は互いに彼らの元の関係で保つことができます。写真マニュアル手順の重要な利点は、ティッシュの固定の品質を監視し、病理学的変化を認識する可能性です。したがって、固定の品質と材料の埋め込みはとても重要です。成果物を含む nonsuitable のサンプルは、さらに処理する前に委託できます。

イメージの切片の顕微鏡写真シリーズは、役立つ形態学的アトラスを提供します。アトラスは、比較解剖学的研究、希少種もあります、貴重なアーカイブです。組織スライスの厚さの選択アドレスの科学的な質問に依存し、組織標本のサイズによって制限されます。小動物 1 mm までの厚さを調整してください。非常に厚いセクション (> 5 mm) 四酸化オスミウム8,9,10の限られた浸透能力のため、お勧めしませんが。

Telemacrophotography マニュアルの形態計測学的研究に不可欠です。側とフレームの上面に組織表面の固定相関があり、座標の空間システムの構造の位置を定義します。電気生理学18や、可塑性は重要な役割を果たしている再生6、脊髄損傷モデルの記述法の組み合わせは可能です。比較解剖学的研究、希少種もあります、虹色組織アトラスと微細構造パラメーターの顕微鏡 TEM 写真が貴重な資産。

その強さにもかかわらず TEM はサンプル厚さのサイズのためにいくつかの制限 (70 nm)、断面急変部 (< 6 mm2)、およびサンプル準備の複雑さ。ただし、標本が正確に準備、供試体の微細構造の TEM 画像は任意の光顕的手法によって生成された画像と比較して優れた品質の。子宮内での伝達方法は、噴射量と噴射の地形の地域によって制限されます。議論の余地なく、テクニックでは、発達早期の治療、先天性中枢神経系疾患の救助、強いトランスレーショナル医療可能性があります。また、TEM と子宮内で伝達の組み合わせしないだけ考えられる先天性疾患の治療は将来も高品質微細構造を用いた神経発達診断のためのアプローチとして。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、そのサポートと動物のケアのため医学部、ルール大学ボーフムで飼養施設の同僚をありがちましょう。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26 G x 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) - For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor) -
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips -
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon - polyamide
eye lubricant Bepanthene -
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
iris forceps (10 cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor) -
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica - 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH -
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor) -
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon - Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments -
thin vibrating razor blade device Krup - with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips - up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
Ultracut E Reichert-Jung - ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

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References

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子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価
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Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).More

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

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