子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価
Summary
透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。
Abstract
本研究は興味の蛋白質によって影響される、明確に識別された地形構造の微細構造パラメーターの正確な寡を目指して透過型電子顕微鏡 (TEM) で子宮内で伝達を組み合わせたウイルスの転送を介して生物に導入されます。この手法により、細孔から微細構造同定へのスムーズな移行のため組織アトラスの次の地形のナビゲーション マップ。子宮導入組織の高分解能電子顕微鏡、神経とその可塑性パラメーター、断面のシナプスブートン エリア、シナプス小胞内のミトコンドリア数などの細かい微細構造を明らかにする、ブートン プロファイル、シナプス、断面の軸索地域、ミエリン鞘の太さ、髄鞘層板の数とミトコンドリア プロファイルの断面領域の長さ。これらのパラメーターの解析では、神経系の遺伝的構造のウイルスの伝達によって影響を受けるエリアの微細構造可塑性の変化に重要な洞察力を明らかにします。これらの併用のみ神経可塑性に遺伝子組み換えの生体分子や薬剤の直接影響を研究するため使用しないことができますが、また (のコンテキストでは例えば、神経可塑性の子宮内で救助を勉強する可能性を開きます神経変性疾患)。
Introduction
光子は、電子の深さのグレードで極薄の組織標本を貫通できます。これはナノメートル微細構造の光学顕微鏡技術と比較した場合の解像度の画像をキャプチャで TEM に貴重な利点を属性します。たとえば、TEM は、分泌顆粒、微小管、フィラメント、繊毛、絨毛上皮 (細胞表面の様々 なタイプ、メラノソーム、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの可視化特殊化)、特に神経系1,2,3,4シナプスします。本方法論研究の全体的な目標です神経可塑性変化の微細構造認識出生前干渉時に開発時に子宮内での伝達と TEM の最新の技術を組み合わせることによって興味のバイラル符号化された蛋白質は、中枢神経系5,6、7、6脊髄などに子宮内で導入されています。例えば、子宮内で伝達電子顕微鏡との組み合わせでは細胞接着分子 L1 の運動 L1 と核内受容体タンパク質間の相互作用に関して、特に L1 欠損マウスにおける可塑性を学習に及ぼす影響を研究するため使用されています小脳ニューロン7。
神経可塑性パラメーターの解析には、中枢神経系内の最小領域の局在に関する正確な情報が必要です。したがって、微細構造の詳細とその他の構造についての正確な地形向きについて説明するのには十分です。本研究では光と電子顕微鏡観察に基づく明瞭な形態の区域の詳しい調査を目指して特定の準備メソッドが表示されます。このアプローチは、組織操作、マウスの脳および脊髄の子宮内での伝達から始まる、および灌流固定後のいくつかのテクニックを組み合わせた金型埋め込むと TEM の組織を処理します。埋め込みと TEM のティッシュの処理の間に含まれている重要なステップはの microphotographic と低倍率の正確なドキュメントは、干渉光の反射法による組織のドキュメント組織標本8,9,10。本手法により、神経組織表面と TEM の準備の前に供試体スライス プロファイルの地形と構造の詳細を検討する研究手法に組み込まれ、.
頭脳全体の区分のための特別なフレームは、定位座標に対応します。このフレームは神経組織の区域の形態の三次元 (3 D) 再構成を利点し、形態分析に使用することができます。可視化のセクションの macrographs が地形座標を割り当てられ、連番付きのセクション組織アトラスのマップを構築します。
樹脂加工後で超薄切片に埋め込まれた組織の断面 (< 70 nm) 上記組織アトラスの地図によると、選択したエリアを含んでいます。その内容と連絡先団地内近隣構造物への塑性パラメーター (例えば、シナプス ボタンまたは軸索線維のプロファイル領域を断面するなど) の高解像度の画像を取得する TEM を超薄切片を受けます神経網。
記載の方法で可視化破面観察からマイクロ構造およびナノ構造への滑らかな移行は以後の子宮内開発の神経形態学的神経可塑性の詳細な比較を許可します。システム。
Protocol
動物の主題のすべてのプロシージャは、ハンブルク、ドイツのノルトライン ・ ヴェストファーレン州の州の動物倫理委員会によって承認されています。 滅菌器具、手袋、外科プロシージャ全体で無菌のコートを使用します。 1. 子宮伝達で リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 でアデノ随伴ウイルス タイプ 1 (AAV1) (4 x 1011ウイルス粒子/μ AAV1) の目的のターゲ?…
Representative Results
マウスの信頼性と高速麻酔の安全な多数のパラメーターが考慮されたと麻酔ユニットの最適化されたワークスペースが十分な (図 1A) をあることを証明しました。単位は、マウスやラットなどの小動物の手術の成功に必要な精度で液体イソフルランと周囲の空気の混合を制御するために設計されています。空気とイソフルランは目的?…
Discussion
子宮内での情報伝達の重要なステップは、注入の手順です。脳室または興味の別の領域に精密成形には、経験と実践的なスキルが必要です。シンナーのマイクロキャピ ラリー チップ以下の組織の損傷が発生します。しかし、これは射出圧力の増加を犠牲にしては。子宮内でエレクトロポレーション19,20,21,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、そのサポートと動物のケアのため医学部、ルール大学ボーフムで飼養施設の同僚をありがちましょう。
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
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Cite This Article
Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).