Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

doi: 10.3791/59084 Published: February 26, 2019
* These authors contributed equally

Summary

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

Abstract

현재 연구 관심사의 단백질에 의해 영향을 명확 하 게 확인 된 지형 구조에서 ultrastructural 매개 변수는 정확한 morphometrical 분석에 utero 변환 전송 전자 현미경 (TEM)와 결합 그 바이러스 전송을 통해 유기 체에 도입 되었습니다. 이 결합 된 접근 다음 지형 탐색 지도 조직 아틀라스에서 ultrastructural 식별 macrostructural에서 부드러운 전환에 대 한 수 있습니다. 에-utero-불리고 조직의 고해상도 전자 현미경 계시는 neuropil와 소성 매개 변수, cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 내 미토 콘 드리 아의 수의 좋은 열 대권 외는 bouton 프로필, 시 냅 스 연락처, cross-sectioned axonal, 수 초 두께, myelin lamellae 수 및 미토 콘 드리 아 프로필의 cross-sectioned 분야의 길이. 이러한 매개 변수의 분석 유전자 구성의 바이러스 성 전송에 의해 영향을 받는 신경 영역에 ultrastructural가 소성의 변화에 대 한 필수적인 통찰력을 보여준다. 이 결합 된 방법만 사용할 수 없는 신경가 소성에 유전자 조작된 생체 약물의 직접 효과 공부 하지만 또한 가능성 (예를 들어, 컨텍스트에서 신경가 소성의 utero 구조 연구 신경 퇴행 성 질병)입니다.

Introduction

아니 광자는 전자의 깊이 학년에서 ultrathin 조직 표본을 침투 수 있습니다. 이 가벼운 현미경 검사 법 기술에 비해 미세 구조의 나노미터 해상도 이미지를 캡처에 가장 귀중 한 장점을 특성. 예를 들어 가장 미토 콘 드리 아, melanosomes, 등 다양 일 분 비과 립, microtubules, microfilaments, 섬 모, microvilli, 및 세포 접합 (세포 표면 세포내 세포의 시각화 수 있습니다. 전문화), 특히 신 경계1,2,,34synapses. 현재 방법론 연구의 전반적인 목표는 utero에서 변환의 가장 최신의 기술을 결합 하 여 태아 간섭에 따라 개발 하는 동안 신경가 소성에 변화의 ultrastructural 인식 이다. 관심의 virally 인코딩된 단백질 중앙 신 경계5,6,7,6척수 포함 하 여에 utero에서 불리고 되어 있다. 예를 들어, 함께 가장 utero에서 변환 사용 되었습니다 L1 및 핵 수용 체 단백질 사이 상호 작용에 관해서는 특히 L1 불충분 한 쥐에서 소성을 학습 하는 모터에 세포 접착 분자 L1의 효과 공부 하 고 소 뇌 신경7에서.

Neuroplasticity 매개 변수 분석 신 경계 내의 작은 지역의 지역화에 대 한 정확한 정보가 필요합니다. 따라서, 그것은 ultrastructural 세부 사항 및 다른 구조에 관하여 그들의 정확한 지형 방향을 설명 하기 위해 적절 한입니다. 현재 연구에서 특정 준비 방법 빛과 전자 현미경 검사 법에 따라 다른 형태학 분야의 상세한 조사에 제공 됩니다. 이 이렇게 결합 조직 조작, 마우스 뇌와 척수의 utero에 변환 시작 하 고 관류 고정, 다음의 몇 가지 기술을 몰드-포함, 그리고 가장에 대 한 처리 하는 조직. 포함 및 가장에 대 한 조직의 처리 사이 포함 하는 필수적인 단계는의 정확한 microphotographic 및 낮은 확대 설명서에 대 한 허용 간섭 빛 반사 기술을 사용 하 여 조직의 설명서 조직 표본8,,910. 현재 접근에 통합,이 기술은 신경 조직 표면 및 가장에 대 한 그들의 준비에 앞서 표본 조각 프로필의 지형 및 구조 정보를 검토 하는 연구를 수 있습니다.

전체 두뇌를 단면에 대 한 특별 한 프레임 stereotaxic 좌표에 해당 합니다. 이 프레임과 신경 조직에서 영역의 형태 3 차원 (3D) 재건 혜택 형태학 분석에 사용할 수 있습니다. 시각화 된 섹션의 macrographs 지형 좌표를 할당 빌드하고를 순차적으로 번호가 매겨진된 섹션 조직 아틀라스에 지도.

수 지 처리, 후 포함 된 조직 ultrathin 섹션으로 구분 됩니다 (< 70 nm) 위에서 언급 한 조직 아틀라스의 지도 따라 선택된 영역을 포함. 그들의 내용의 및 단지 내에 인접 구조에 연락처의 소성 매개 변수 (예: 횡단면 프로필 영역 시 냅 스 boutons 또는 axonal 섬유)의 고해상도 이미지를 얻기 위해 가장 ultrathin 섹션 대상이 됩니다. neuropil입니다.

여기에 설명 된 방법으로 마이크로-그리고 nanostructures 시각화 된 macrostructures에서 부드러운 전환 utero에서 변환 개발의 긴장 후 형태학 신경가 소성의 비교 심층 연구를 허용 시스템입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

동물 주제에 모든 절차는 함부르크와 노르 트 베스트 팔 렌, 독일의 연방 국가의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.  사용 하 여 살 균 기기, 보호 장갑 및 전체 수술을 통해 무 균 코트.

1.에 Utero 변환

  1. PH 7.4에 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 원하는 대상 (4 x 1011 바이러스 성 입자 / µ L AAV1의)에 대 한 코딩 adeno 관련 바이러스 타입 1 (AAV1)를 준비 합니다. 빠른 녹색 µ 0.1 mg/L을 추가 하 고 37 ° c.에 AAV1-빠른-녹색 혼합물을 유지
  2. 원하는 모양으로 얇은 모 세관 팁 준비 (길이 80 µ m와 안쪽의 외부 직경 8 m m 50 µ m의 직경), micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (설정: 압력 = 500, 열 700, 풀 = = 0, 속도 = 80, 시간 = 200, 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c1 >). 그것은 4-5 m m 되도록 모 세관의 끝을 휴식.
  3. 모 세관 팁 흡 인기 튜브 (44 cm x 0.7 cm)를 조립 하십시오 그리고 모 세관으로 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 15 µ L 발음.
  4. 동물 주제 전체 절차 동안 37 ° C의 일정 한 생리 적 체온 유지.
  5. Preincubation 챔버로 임신 C57Bl/6 마우스 (배아 일 14.5)를 배치 하 고 기체 4 %isoflurane 마우스 anesthetize (0.6-0.8의 체적 공기 흐름 속도와 L/분).
  6. 피하, buprenorphine (몸 무게의 0.1 mg/kg) 주사.
  7. Prewarmed 수술 플레이트 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.
  8. 윤활제와 함께 눈을 커버.
  9. 마 취 마스크와 마우스에 맞게 (0.6-0.8의 체적 공기 속도로 가스 1.5% isoflurane L/min) 수술 판과 면도 복 부 피부 영역에. 면도 지역을 그리고 betadine 솔루션 3 X 75% 에탄올을 닦아냅니다.
    참고: 마 취 마우스의 호흡 동작을 지속적으로 모니터링 합니다. 마우스의 흡입-증발 기 패턴에 따라 isoflurane 가스의 농도 조정 합니다.
  10. 마우스의 뒷 발 골을 압박 하 여 발바닥의 반사의 부재를 확인 합니다.
  11. 곡선된 톱니 모양의 아이리스 포 셉 (10 cm)와 피부를 재 밌 고 직선 텅스텐 카바 이드가 위 (10 cm), 교육 년 따라 피부를 절단 한 다음, 바로 Dumont 핀셋 (12 c m, 0.2 m m으로 복 벽을 댔 지에 의해 복 부 구멍을 열으십시오 0.12 m m) x (8 cm)가 위 직선 바와 교육 알바 따라 벽을 절단 하 고.
  12. 복 부 오프닝에 한 조각의 fenestrated 파라핀 영화를 놓고 마이크로-모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선)의 양쪽 끝에 영화를 해결 합니다.
  13. 자 궁 뿔 안에 태아 손상을 방지 하려면 숟가락 모양의 장치 자 궁 뿔을 노출 합니다. 자 궁 뿔에 PBS (37 ° C)의 몇 방울 똑 하 고 손해 또는 기형 자 궁 골목 안에 대 한 태아 검사.
  14. 순서와 자 궁 뿔에는 태아의 위치를 문서화 합니다. 주입을 위한 원하는 위치에 도달할 때까지 배아를 자 궁 골목 안에 신중 하 게 설정 합니다.
  15. 시각적으로 검사 하는 사출 사이트 (예를 들어, 뇌 심)와 염료 침투는 stereomicroscope에서 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 1-2 µ L를 주사.
  16. 주입 된 배아를 문서화 하 고 복 부 구멍으로 다시 주입된 태아와 자 궁 뿔 장소.
  17. 복 부 구멍으로 PBS (37 ° C)의 몇 방울 똑. 복 벽 (사용 폴 리아 미드 6 0 크기의 봉합)과 피부 (사용 폴 리아 미드 3 0 크기의 봉합), Halsted의 모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선)를 사용 하 여 봉합 하 여 캐비티를 닫습니다. 또는 사용 하 여 간단한 중단된 패턴 또는 스테인리스 봉합/스테이플 복 부 구멍 그리고 피부를 닫습니다.

2입니다. 격리 된 조직 Telemacrophotography

  1. 버퍼의 준비
    1. 녹이는 14.95 g Na2HPO4 의 KH24 감동 200 rpm에서 증류수 1 L의 2.18 g Sörensen의 버퍼 (1 리터)를 준비 합니다. 관류의 임신 강아지 및 새끼는 출생에서 기간 사용 바늘의 적절 한 크기 복 부 또는 intragastric 주입에 대 한 하 고 터미널 나트륨 pentobarbital 마 취 농도 180 mg을 초과 하지 않는 다는 것을 확인 / 몸 무게의 킬로그램입니다.
    2. 75 ° C에 증류수 500ml를가 열 하 여 Mugnaini의 고정 솔루션 (5 L)를 준비 하 고 200 rpm, 5의 200 µ L 추가의 감동 아래 paraformaldehyde 분말 50 g을 추가 N NaOH, Sörensen의 버퍼의 추가 1, 500 mL, 1750 mL의 증류수 그리고 25%도 500 mL. 최대 5000 mL 증류수에 채우십시오. 이 마지막 버퍼를 사용 하 여 재 관류에 대 한.
      참고: 후드 Mugnaini의 고정 솔루션을 준비, 보호 안경을 착용 하 고 연기를 피하십시오. 관류의 더 나은 시각화에 대 한 메 틸 렌 블루 (0.05 g/L)를 추가 합니다.
  2. 마우스 관류 및 조직 분리
    1. Transcardially perfuse (배아 연구)의 경우 transduced 배아 또는 표준 절차6,7에 따라 원하는 나이 (예를 들어, 출생 후 하루 24)에 태어난된 transduced 술집 임신 쥐 11,12,13,14,15,,1617, 복 터미널 sodium pentobarbital을 사용 하 여 마 취 (200 mg/kg의 몸 무게).
    2. 마우스 transcardially 주입 덤플링 솔루션 (500 U) 쥐를 고취 26 G, 바늘으로 하 고, 고정, 전에 1을 사용 하 여 시체에서 피를 제거 하 고 그들에 게 40 ° C prewarmed Mugnaini의의 30 mL와 함께 transcardially를 perfuse에 PBS의 10 mL와 함께 transcardially 고정 솔루션입니다.
      참고: 성인 쥐에 대 한 복 부 대동맥14를 통해 대체 역행 관류를 수행 합니다.
    3. (예를 들어, 뇌 또는 척수)의 perfused 조직 분리 하 고 후 위 4 ° c.에 다른 24 h에 대 한 Mugnaini의 고정 솔루션의 적어도 10 mL에 조직
    4. 조직을 실 온에서 3 h에 대 한 PBS의 10 ml 씻으십시오.
  3. Agarose, 문서에 포함 하 고 단면
    1. 재현할 수 단면 각도8,,910특별 한 프레임에 고립 된 조직 (예를 들어, 뇌)를 조정 합니다. 또는, 조정 가능한 절단 두께 vibratome를 사용 합니다.
    2. 신경 조직 프레임에 배치 하 고 telemacrography에 대 한 조직 조정 좌표를 문서화 합니다.
    3. 3% 낮은 녹는 agarose 포함 매체 준비: Sörensen의 버퍼의 100 ml에서 agarose의 3 세대를 추가 하 고 90 ° c 물 욕조에 섞어가 열
    4. 조직을 포함 하는 프레임에 3 %agarose (30 ° C)를 붓는 다. 따뜻한 금속 블록과 프레임을 커버 하 고 경화 될 때까지 기다립니다. 경화, 동안 포함 된 조직 및 그것의 좌표 프레임 내에 이미지를 telemacrographic 장치를 사용 합니다.
    5. 절단 간격에 해당 하는 첫 번째 프레임의 좌표와 agarose 임베디드 조직 프레임으로 전송.
    6. 원하는 두께 (예를 들어, 1.5 m m)의 섹션으로 얇고 진동 면도날으로 장치 내장된 조직 컷 ( 재료의 표참조).
      참고: 면도날의 활공을 높이기 위해 내장된 조직에 글 리세 린 몇 방울 똑.
    7. PBS의 각 조직 섹션 이미지와 폴더에 이미지를 수집 합니다.

3. 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 격리 된 조직 준비

참고: 후드 아래 떨고 플랫폼에 단단히 closable 뚜껑 유리 접시에 외피의 모든 추가 단계를 수행 합니다.

  1. PBS에서 2 x 30 분 조직 단면도 씻어. 실 온에서 2 h의 2% 수성 오스뮴 tetroxide 솔루션 (OsO4) 섹션을 품 어.
    주의: 오스뮴 tetroxide 독성 이며 그것은 피부와 접촉할 때 유해할 수 있습니다.
  2. PBS에서 2 x 30 분 osmicated 섹션을 씻어.
  3. 10-15 분 동안 실 온에서 30%, 50%, 70% 에탄올에 섹션을 품 어 (옵션: 4 ° C에서 70% 에탄올에서 밤새 품 어).
  4. 이미지 왼쪽 및 45 °의 각도로 오른쪽에서 샘플에 적용 되는 LED RGB 빛8,9,10 (2 x 15w)에서 70% 에탄올에 osmicated 표본. 검은 요리와 지루한 검은 백그라운드를 사용 하 여 산란 하 고 조명 하는 동안 빛의 반사를 최소화 하기 위해.
    주의: 이미징 동안 건조 섹션을 허용 하지 않습니다.
  5. 시리즈는 폴더에서 이미지를 수집 하 여 좌표 섹션 이미지의 아틀라스를 만듭니다.
  6. 100% 에탄올 (2 x 30 분)과 상 온에서 100% 프로필 렌 산화물 (2 x 30 분)에서 표본 품 어.
    주의: 솔루션을 변경 하는 동안 건조 섹션을 허용 하지 않습니다.
  7. 부드럽게 유리 바 교 반 하면서 수 지의 260 mL 유리 용기 무수 물 dodecenylsuccinic의 240 mL 믹스. 이질성, 거품, 및 얼룩에 대 한 정기적으로 확인 합니다. 아주 부드럽게, 적어도 45 분 동안 손으로 저 어.
  8. 수 지/프로필 렌 산화물 1: 2와 1: 1의 비율로 준비 하 고 추가 3% 가속기 (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. 1:2 단계에서 3.8 2 h를 누른 1:1 포함 솔루션에서 단계에서 3.8 2 h에 대 한 실 온에서 회전 바퀴에 솔루션을 포함 조직 품 어.
  10. 조직 평면 폴 리 프로필 렌 요리에서, 신선한 수 지 3% 가속기를 포함 하는 조직 커버 놓고 12 24 h에 대 한 65-85 ° C에서 임베디드 조직 치료 합니다.
  11. 포함 된 조직 실내 온도에 아래로 냉각 하 고 폴 리 프로필 렌 요리에서 수 지 포함 견본을 제거.

4. 정량 분석에 대 한 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수 선택

  1. 관심의 영역을 매핑
    1. 관심 (예를 들어, 해 마 또는 소 뇌)의 영역을 선택 하 고이 지역에 있는 아틀라스 (3.5 단계)에서 이미지를 선택 하 여 섹션 아틀라스에서 영역을 지역화.
    2. 섹션 이미지에 관심 분야의 경계를 스케치 하 고 찾기/첨가 수 지 표본에 지역 경계.
    3. 스크래치 마크는 미세 바늘 게이지 (26 G, 1)를 사용 하 여 수 지 표본에 관심 (예를 들어, 해 마 또는 소 뇌)의 영역의 테두리.
    4. 트리밍에 대 한 수 지를 부드럽게 하거나, 또는 트리밍 장치를, 얇은 잎, 또는 사 포를 사용 하는 오븐에서 85 ° C를 수 지 표본 열.
    5. 면도날으로 수 지 표본에서 관심 영역을 삭제할 ( 재료의 표참조). 접착제 (직경 8 mm)와 1 cm의 길이 예를 들어, 필요한 구경의 아크릴 유리의 바에는 견본을 탑재 합니다. 세미-ultrathin 단면화 및 탑재 된 견본을 정돈 한다.
    6. Semithin (0.75 µ m) 준비와 ultrathin (70 nm)는 ultramicrotome를 사용 하 여 잘린된 영역 섹션: 0.75 µ m 두께 1.5 m m/s 및 70 nm 두께 0.7 m m/s에 그것을 설정.
    7. 유리 캐리어 semithin 섹션을 수집 하 고 1% 톨루이와 섹션 (4 분)에 대 한 PBS에 블루 얼룩.
    8. 섹션 이온된 수에 여러 번 씻는 다. 얼룩진된 섹션 4 x를 사용 하 여 가벼운 현미경 검사 (0.1 ∞의 나 /-), 10 (0.22 ∞/0.17의 없음), x 40 (0.65 ∞/0.17의 없음), x (1.25 ∞/0.17의 없음) 목표 x 100.
    9. 니켈 격자에 ultrathin 섹션을 수집 합니다. 180에 가장을 격자를 주제로 kV 및 3, 200 x, 6, 000 x, 및 8, 000 배 확대.
  2. TEM 분석
    1. 양적 TEM 분석 (예를 들어, 소포 및 미토 콘 드리 아 또는 myelinated 및 nonmyelinated 축 삭 boutons)에 대 한 관심의 ultrastructural 매개 변수를 선택 하 고 이러한 매개 변수 3, 500 x, x 6000 및 8000 x 배율 TEM 이미지.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

쥐의 안정적이 고 빠른 마 취에 대 한 수많은 안전 매개 변수 고려 되었다, 하 고 마 취 단위의 최적화 된 작업 영역 적절 한 (그림 1A)으로 판명. 단위는 쥐와 쥐와 같은 작은 동물에 성공적인 수술에 필요한 정밀 액체 isoflurane 및 주위 공기의 혼합을 제어 하도록 설계 되었습니다. 공기와 isoflurane 원하는 설정에 따라 기화 기에 혼합 하 고 동물 (그림 1A)에 상자에 또는 마스크를 통해 전달 됩니다. 폐품 수집 및 생성 될 수 있습니다 어떤 잉여 isoflurane 가스는 안전한 작업 환경을 제공 합니다. 가스는 수집 하 고 카트리지 (그림 1A)에 있는 활성 탄을 통과.

악기 (그림 1B)의 최적화 된 집합 임신 쥐에 신속 하 게 수술을 수행 하는 과학자를 허용 한다. 소수 성 특성을 가진 간단한 파라핀 영화 절제 (그림 1B) 후 건조에서 복 부 점 막을 수 없습니다. 은닉 배아 자 궁 뿔 파라핀 필름에 노출 되 고 태아 그림 1C방식으로 매겨집니다. 지역화, 일단 태아는 얇은 모 세관 (그림 1D)를 통해 바이러스의 주입에 대 한 올바른 위치에 조정 됩니다. 주사 주입된 바이러스 혼합 (그림 1D)에 포함 된 관통 염료의 확산 형태를 관찰 하 여 시각적으로 제어 됩니다. Utero에서 주사 후 자 궁 뿔 (참조, 예를 들어 루 츠 외.5 실험에 필요한 (예를 들어, 출생 및 출생 후 하루 24 도달)까지 무대까지 주입 된 배아의 개발을 허용 하는 복 부 구멍에 다시 배치 됩니다. ,6 , 크 라우 스 외.7). 시 냅 스가 소성에 대 한 연구, 발달 또는 성인 후기를 사용 하는 것이 좋습니다.

후 원하는 단계에서 동물의 transcardial 관류, 신경 조직 (예를 들어 뇌와 척수 그림2에서)는 배치 좌표와 투명 한 플라스틱 프레임에 고 agarose (그림 2 에 포함 된 A, B)입니다. 절단 후, 모든 섹션은 이미지 (그림 2C, E, G)와 다음 osmicated. Osmication 70% 또는 80% 에탄올에 외피 후에, 단면도 다시 방해 빛 telemacrography8,,910을 사용 하 여 몇 군데. 조직 섹션은 필요한 강도 높은 조명 동안 흩어져 방사선을 최소화 하는 무딘 검은 주변에 배치 되어야 합니다. 섬유 책자 및 조직의 다른 지역 대비 어두운 조직 배경, 무지개 빛깔의 색상을 반영 하 고 조직 표면의 특히 컬러 패턴 나온다 (그림 2D, F, H). 모든 무지개 빛깔의 이미지는 nonosmicated 이미지와 겹쳐 있다 그리고, 포함 단계의 예상된 좌표, 함께 그들은 조직 지형 탐색 지도 생성. 다음, 조직은 더 탈수 되 고 수 지에 포함 합니다. 네비게이션의 지도에 따라, 관심 분야는 선택 하 고 추가 가장에 대 한 처리-예를 들어 마 (지층 lucidum), 소 (과 립 세포 층), 뇌와 척수 (지 삭 조) 그림 3A1-c 4에에서 표시 됩니다 .

해 마와 소 뇌, 이끼 낀 섬유 시 냅 스 대형 연 접 boutons (그림 3A1-B5)를 포함 하 여, 다른 시 냅 스에 비해 독특한 ultrastructural 특성 전시 알려져 있습니다. 그들은 이전 처리 단계 동안 무지개 빛깔의 탐색 지도의 도움으로 쉽게 지역화할 수 있습니다. 그들의 횡단 프로 파일에는 boutons 소포 및 미토 콘 드리 아의 광대 한 번호를 포함 하 고 매우 자주 여러 수지상 쪽이 (그림 3A4, A5, B4, B5)로 묶습니다. 이러한 프로필의 TEM 이미지 cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 및 bouton 프로필 내의 미토 콘 드리 아의 수, 시 냅 스 연락처 및 연락처 사이트의 숫자의 길이의 정량화를 허용합니다.

척수, 지 삭 조 oligodendroglia에 의해 myelinated는 많은 axonal 섬유를 포함 되어 있습니다. 횡단 섹션에 지 삭 조 횡단 섹션 (그림 3C1, C2)에 척수의 후부 두 뿔 사이 찾을 수 있습니다. 가장 이미지에 cross-sectioned myelinated 축 삭 라운드 나타나고 축 삭을 둘러싼 myelin 덮개 lamellae (그림 3C3, C4) 구성 됩니다. 수 초를 myelin lamellae의 두께 포함 하 여 cross-sectioned axonal 지역의 부 량 뿐만 아니라 프로필 영역 밖으로 실행 될 수 있다 cross-sectioned 미토 콘 드리 아의 정량화.

준비 된 아틀라스와 ultrastructural 매개 변수 마이크로그래프 가장 이미지 도움이 되지 않습니다만 치료의 다른 조건에 따라 형태학 neuroplasticity의 비교에 대 한 뿐만 아니라 때 같은 지역 내에서 매개 변수 사이 비교 필요 (예를 들어, 비교 마18 에 시 냅 스의 다른 종류, 다른 종 [그림 4]의 해당 구조).

Figure 1
그림 1 : Utero에서 변환에 대 한 준비. (A) Isoflurane 마 취 설치: 1) 유도 챔버 초기 마 취; 2) 펌프; 3) 마 취 단위; 4) 라우팅 스위치 밸브; 5) 마 취 공급 튜브; 6) 청소 단위; 7) 호흡 마스크; 8) 온수 수술 테이블; 9) 쌍 안 stereoscope 빛 소스; 10) 제어 장치입니다. (B) 수술 장비: 1) 전기 면도기; 2) 눈 윤 활 유; 3) 고정 테이프; 4) 위생 패드; 5) 아이리스 포 셉 (10 cm, 곡선, 톱니); 6 및 7) 아이리스가 위 (11 cm, 직선, 텅스텐 카바 이드); 8) Dumont 핀셋 (#3, 12 cm, 직선, 0.2 m m x 0.12 m m); 9) 바가 위 (8 cm, 직선); 10 및 11) 마이크로-모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선); 12) 파라핀 영화; 13) 마이크로 스푼; 14) 면봉; 15와 16) Halsted의 모기 hemostatic 집게 (12.5 cm, 직선); 17 및 18) 봉합 (크기 6-0와 3-0); 19) 주사기; 20) 흡 인기 튜브 어셈블리 보정된 microcapillary 펫에 대 한. 배아 일 (전자) 14.5에서 자 궁 뿔 내 배아의 체계적인 번호의 (C) 체계: L = 왼쪽; R = 오른쪽. 주입의 (D) 전략: 첫 번째 및 두 번째 뇌 심으로 (나ve 와 IIve, 각각), 4 심 (IVve), 및 척수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Telemacrography에 의해 고립 된 조직의 문서. (A B) Agarose, 큐 벳을 사용 하 여 좌표 시스템 (격자)에서 뇌와 척수를 포함. 절단 후, 섹션 telemacrography 및 간섭 반영 대상이 이미징 빛. (C-F) 두뇌의 횡단 및 화살 섹션입니다. 스케일 바 = 5 mm; co = 피 질; 세인트가; = 디 diencephalon; = 나 = mesencephalon; 안녕하세요 = 해 마; ped = pedunculi cerebri; ce = 소 뇌; 모 수 질 oblongata =. 척수의 자 궁 경관 세그먼트의 횡단 섹션 (Gh 조) 눈금 막대 = 1 밀리미터; a h r = 오른쪽 앞쪽 경적; ahL = 왼쪽된 앞쪽 경적; df = 지 삭 조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 소성 매개 변수의 지형 및 ultrastructural id. (A1) 거꾸로 간섭 해 마의 빛 macrograph. 지층 lucidum (sl)에서 이끼 낀 섬유 boutons의 지역 강조 표시 됩니다. pcl 피라미드 셀 레이어; = gcl과 립 세포 층을 =. 눈금 막대 = 500 µ m. (A2) 빛 microphotograph (100 x 목표)의 semithin (0.75 µ m) 지층 lucidum 보여주는. 별표 많은 수지상 제도 (검은 화살표)를 둘러싸고 있는 이끼 낀 섬유 boutons의 영역을 나타냅니다. 톨루이 블루/OsO4 얼룩. 눈금 막대 = 50 µ m. (A3) 전송 전자 현미경 사진 낮은 확대율에서 보여주는 이끼 낀 섬유 boutons (별표) 모 수석 (D)를 둘러싼. 사각형 하나의 이끼 섬유 bouton 포함 되어 있습니다. 눈금 막대 2 µ m. (A4) 전송 전자 현미경 사진 (MFB) 하나의 이끼 섬유 bouton의 횡단면 프로필의 =. (파란색) 쪽이 고 횡단면 bouton 영역 (보라색)가 강조 표시 됩니다. m = mitochondrion; s = 쪽이. 눈금 막대 = 200 nm. (A5) 시 냅 스 소포는 MFB 내부입니다. 눈금 막대 = 100 nm. (B1) 소 뇌의 간섭 빛 macrograph를 거꾸로. 이끼 낀 섬유 boutons를 포함 하는 립 세포 레이어 (gcl)의 영역 표시 됩니다. mcl = 분자 층; h = hilus. 눈금 막대 = 500 µ m. (B2) 빛 microphotograph (100 x 목표)의 semithin (0.75 µ m)과 립 세포 층 Purkinje 세포 (PC)에 대 한 경계의 영역을 보여주는. 별표는 많은 소 뇌과 립 신경 (CGN)으로 둘러싸인 이끼 낀 섬유 boutons의 영역을 나타냅니다. 톨루이 블루/OsO4 얼룩. 눈금 막대 50 µ m. (B3) 전송 전자 현미경 사진 MFBs의 영역을 보여주는 낮은 확대율에서 =. 사각형에는 단일 MFB 포함 되어 있습니다. 눈금 막대 2 µ m. (B4) 전송 전자 현미경 사진의 소 뇌과 립 세포 층 내에서 버섯 모양의 MFB의 횡단면 프로필 =. 횡단면 bouton 영역 (보라색) 및 소포 없는 쪽이 (블루) 강조 표시 됩니다. 눈금 막대 = 1 µ m. (B5) 미토 콘 드리 아 (바이올렛)와 시 냅 스 소포는 MFB 내부. 눈금 막대 = 150 nm. (C1) 척수의 간섭 빛 macrograph를 거꾸로. 무 겁 게 myelinated 축 삭을 포함 하는 등 삭 조 (df)의 지역 강조 표시 됩니다. a h r 및 ahL = 오른쪽 및 왼쪽 앞쪽 경적, 각각; phR 및 phL 후부 경적의 왼쪽과 오른쪽 =를 각각. 눈금 막대 = 500 µ m. (C2) 빛 microphotograph (100 x 목표)의 semithin (0.75 µ m)와 무 겁 게 myelinated 축 삭 (도끼) nonmyelinated 섬유 (별표)에서 명확 하 게 구별할 수 있는 농축 등 삭 조를 보여주는. ct = 결합 조직. 톨루이 블루/OsO4 얼룩. 눈금 막대 = 50 µ m. (C3) 전송 전자 현미경 사진 myelinated 및 nonmyelinated 축 삭 (도끼, 보라색)의 횡단면 단면도의. 내 수 초를 =. 눈금 막대 = 200 nm. (C4) 사각형은 myelin lamellae와 nonmyelinated 섬유 높은 확대, 무 겁 게 myelinated 축 삭을 보여줍니다. Microtubules (mt)와 미토 콘 드리 아 (m) axonal 섬유 내에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 다른 동물 모델 매개 변수 ultrastructural가 소성의 예. (A) 상어의 뇌에서 이끼 낀 섬유 boutons. 눈금 막대 = 400 nm. 붉은 털 원숭이의 해 마에 (B) 이끼 낀 섬유 bouton. 눈금 막대 = 200 nm. (C)는 고양이의 신경 근육 학 분기점. 눈금 막대 = 300 nm. (D)는 phalanger의 동위 reticularis substantia nigra에 시 냅 스 boutons. 별표 표시 postsynaptic 밀도 (PSD, 삽입: 화살촉 블랙). 사각형 확대 PSD를 보여줍니다. 눈금 막대 = 400 nm. (E) A nonmyelinating는 마우스의 척수 신경 절에 많은 axonal 섬유를 둘러싼 Schwann 세포 (SC) 주변에 무 겁 게 myelinated 섬유를 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 300 nm. 모든 패널에 대해: ax = 축 삭; D = 모 수석; m = mitochondrion; MFB 이끼 낀 섬유 bouton; = MF = 이끼 낀 섬유; 나 = myelin 덮개; s = 척추; sa = 척추 기구; sv = 시 냅 스 소포. 연락처 사이트 (postsynaptic 밀도) 별표 표시 됩니다. 횡단면 영역 보라색과 파란색 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utero에서 변환의 중요 한 단계는 주입. 정확한 주입 뇌 심 또는 관심의 다른 영역으로 경험 및 실습 기술 필요합니다. 얇은 microcapillary 팁, 덜 조직 손상이 발생할 수 있습니다; 그러나,이 사출 압력을 증가 하는 비용입니다. Utero electroporation19,20,,2122, 달리 utero에서 변환 후 삽입 된 배아의 생존 율은 아주 높다. 자 궁 경적의 모든 배아 배아 자 궁 뿔의 뿌리에 위치 하 고 자 궁 낭 내에서 재조정 해야 하는 경우에 주입 수 있습니다. 사출 및 분석의 발달 단계는 과학적 질문에 적용할 수 있습니다.

뇌 심에 주입, AAV1 입자는 전체 심 실 시스템을 통해 척수를 통해 배포 됩니다. 해 마와 소 뇌, 적용된 바이러스 성 입자5,,67에 의해 불리고는 같은 표면에 있는 개발 구조는 주류와 접촉을 닫습니다. Bouton 크기, cross-sectioned bouton 지역, 시 냅 스 소포의 숫자, 미토 콘 드리 아의 숫자와 숫자 이러한 구조에서 시 냅 스 연락처의 길이 등의 ultrastructural 매개 변수에서 변경의 분석은에 대 한 우아한 읽어 ultrastructural 소성입니다. 척수6뿐 아니라 다른 뇌 영역, 공부에 utero에서 변환 메서드를 적용할 수 있습니다. 또한, 다른 장기 및 조직 마찬가지로 선택할 수 있습니다 변환 대상으로. 마지막으로, 필요에 따라 다른 종에 의해 자주 사용된 마우스 모델을 교체할 수 있습니다.

조직 조각의 사진 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 수 지에 포함 된 샘플의 아주 정확한 해 부 할 수 있습니다. 정의 때문에 샘플의 공간 오리엔테이션은, 광범위 하 고 시간이 걸리는 절단 생략 되었다. 또한, 중요 한 인접 지역 서로 게 그들의 원래 관계에 보관할 수 있습니다. 사진 설명서 단계의 중요 한 장점은 조직 정착의 품질을 모니터링 하 고 병 적인 변경 인식 하는 가능성 이다. 따라서, 정착의 품질과 자료의 포함 중추적인 중요성의 이다. 아티팩트를 포함 하는 nonsuitable 샘플 추가 처리 전에 아웃소싱 될 수 있습니다.

군데 조직 조각의 현미경 사진 시리즈 도움이 형태학 아틀라스 제공. 또한 희귀 동물을 포함할 수 있습니다, 비교 신경 해부학 연구에 대 한 아틀라스 귀중 한 보관 이다. 조직 조각의 두께의 선택 그리고 제시 된 과학적 질문에 따라 조직 표본 크기에 의해 제한 됩니다. 작은 동물에 대 한 최대 1 m m의 두께 조정 한다. 매우 두꺼운 섹션 (> 5 m m), 오스뮴 tetroxide8,,910의 한정 된 침투 수 용량 때문에 권장 하지 않습니다.

Telemacrophotography 설명서 morphometrical 연구에 대 한 필수적입니다. 그것은 사이드와 프레임의 위쪽 평면 조직 표면의 고정된 상관 관계를 제공 하 고 좌표 공간 시스템에서 주어진된 구조 위치를 정의 합니다. 전기 생리학18 또는 어디 소성, 중생6에서 필수적인 역할, 척수 부상 모델 설명된 방법의 조합이 가능 하다. 신경 해부학 비교 연구, 희귀 동물을 포함 될 수 있습니다 또한, 무지개 빛깔의 조직 아틀라스와 ultrastructural 매개 변수 마이크로그래프 가장 이미지 귀중 한 자산입니다.

자사의 강점에도 불구 하 고 가장 샘플의 두께 크기 때문에 몇 가지 제한이 있다 (70 nm), cross-sectioned 지역 (< 6 m m2), 샘플 준비의 복잡성. 그러나, 표본 정확 하 게 준비 하는 때, 시료의 열 대권 외의 TEM 이미지 어떤 빛 마이크로 기술에 의해 생산 하는 이미지에 비해 우수한 품질의 있습니다. Utero 변환 기술은 주입된 양 및 주입의 지형 지역에 의해 제한 됩니다. 여 지, 기술은 초기 발달 치료에서 및 선 천 성 neuropathological 질병의 구조에 강한 변환 의료 잠재력이 있다. 또한, 가장와 utero에서 변환의 현재 조합 수만 간주 되지 높은-품질 열 대권 외의 기반 neurodevelopmental 진단 뿐만 아니라 선 천 성 질병의 미래 처리를 위한 접근으로.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 그들의 지원 및 동물 관리에 대 한 의료 학부, Ruhr 대학 보 훔에 동물 시설의 동료를 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26 G x 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) - For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor) -
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips -
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon - polyamide
eye lubricant Bepanthene -
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
iris forceps (10 cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor) -
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica - 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH -
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor) -
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon - Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments -
thin vibrating razor blade device Krup - with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips - up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
Ultracut E Reichert-Jung - ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).More

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter