Summary

Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à construire le laboratoire bulle colonne photobioréacteurs et utilisez-les pour la culture micro-algues. Il fournit également une méthode pour déterminer le taux de croissance de la culture et de la teneur en lipides neutres.

Abstract

Il y a des intérêts importants dans l’étude des microalgues pour applications d’ingénierie tels que la production de biocarburants, produits à haute valeur et pour le traitement des déchets. Comme la plupart des nouveaux efforts recherche commencent à l’échelle du laboratoire, on a besoin de méthodes rentables pour la culture des microalgues de façon reproductible. Ici, nous communiquons une approche efficace de la culture de microalgues dans des photobioréacteurs de laboratoire et pour mesurer la croissance et la teneur en lipides neutres de cette algue. Instructions figurent également sur la façon de mettre en place le système Photobioréacteur. Bien que les organismes de l’exemple sont les espèces de Chlorella et Auxenochlorella, ce système peut être adapté pour cultiver une large gamme de microalgues, y compris des cultures d’algues avec des espèces non-algues. Cultures mères sont tout d’abord cultivés dans des bouteilles pour produire l’inoculum pour le système Photobioréacteur. Inoculum algues est concentrée et transféré dans les photobioréacteurs pour la culture en mode batch. Les échantillons sont recueillis pour les lectures de densité optique. À la fin de la culture de lot, les cellules sont récoltées par centrifugeuse, lavé et lyophilisé pour obtenir une concentration finale de poids sec. La concentration en poids sec final sert à créer une corrélation entre la densité optique et la concentration de matière sèche. Une méthode de Folch modifiée est ensuite utilisée pour extraire les lipides totaux de la biomasse lyophilisée et l’extrait est analysé pour sa teneur en lipides neutres à l’aide d’un test de la microplaque. Cet essai a été publié précédemment mais les étapes du protocole ont été inclus ici pour mettre en évidence les étapes critiques de la procédure où les erreurs se produisent fréquemment. Le système de bioréacteur décrit ici comble un créneau entre culture simple fiole et bioréacteurs commerciales entièrement contrôlé. Même avec seulement 3-4 biologique réplicats par traitement, notre approche de la culture d’algues conduit à des écarts serrés dans les essais de croissance et de lipides.

Introduction

L’application des microalgues dans l’ingénierie et de la biotechnologie a suscité un grand intérêt ces dernières années. Les microalgues sont étudiées pour une utilisation dans le traitement des eaux usées traitement1,2,3,4, biofuel production5,6,7,8et le production de nutraceutiques et d’autres produits de haute valeur9,10. Algues sont également génétiquement modifiés à des taux plus élevés dans le but d’améliorer leur condition physique spécifique engineering applications11,12. Par conséquent, il y a beaucoup d’intérêt dans l’expérimentation avec des organismes industriellement pertinentes en milieu contrôlé. Le but de cette méthode est de communiquer une approche efficace de la culture de microalgues dans un environnement de laboratoire contrôlées et de mesurer la croissance et la teneur en lipides neutres de cette algue. Améliorer la croissance taux et teneur en lipides neutres des micro-algues ont été identifiés comme les deux principaux goulets d’étranglement vers la commercialisation des biocarburants algues13.

Un large éventail d’approches ont été utilisés à des algues de culture à des fins expérimentales. En général, ces approches peuvent être divisés entre culture extérieure à grande échelle et de la culture en intérieur à petite échelle. Culture en plein air dans des photobioréacteurs et étangs ouverts est appropriée pour l’expérimentation vise à intensifier les processus qui ont déjà été éprouvées à l’échelle laboratoire (par exemple, pour tester l’intensification d’une nouvelle souche haute-lipide d’algues)14. Cependant, culture en intérieur à petite échelle est appropriée lors du développement de souches d’algues nouveaux ou améliorés ou des expériences visant à comprendre les mécanismes biologiques. Dans ces derniers cas, un haut-niveau de contrôle expérimental est nécessaire pour isoler les changements subtils de comportement biologique. À cette fin, les cultures axéniques doivent souvent afin de minimiser les facteurs biotiques complexes associés avec d’autres organismes (p. ex. bactéries, algues) qui poussent inévitablement dans les systèmes extérieurs à grande échelle. Même lorsque l’étude des interactions entre les algues et autres organismes, nous avons trouvé qu’utilisation des conditions expérimentales très contrôlé est utile lorsqu’on examine les échanges moléculaires entre organismes15,16,17.

Dans la catégorie des cultures d’algues indoor à petite échelle, un éventail d’approches ont été utilisées. Peut-être l’approche la plus courante consiste à cultiver des algues dans des flacons Erlenmeyer sur un tableau de dispositif trembleur sous une lumière banque18,19. Échange d’oxygène et de CO2 se déroule par diffusion passive grâce à un bouchon de mousse dans la partie supérieure du ballon. Certains chercheurs ont amélioré ce set-up une aération active des flacons20. Une autre approche consiste à cultiver des algues dans des bouteilles, mixés par barre de remuer et aération active. Malgré leur simplicité, nous avons trouvé que l’utilisation de flacons et bouteilles conduit souvent à des résultats incohérents entre les réplicats biologiques. C’est sans doute en raison des effets de position – différentes positions reçoivent des quantités différentes de la lumière, qui affectent également les températures internes de réacteur. La rotation quotidienne de réacteurs vers de nouvelles positions peuvent aider mais n’allège pas le problème car certaines étapes de la croissance des algues (par exemple, au début exponentielle) sont plus sensibles aux effets de position que d’autres (par exemple, la phase logarithmique).

À l’opposé du spectre de la sophistication technologique sont photobioréacteurs commercial entièrement contrôlé. Ces systèmes en permanence surveillent et ajuster les conditions dans le réacteur afin d’optimiser la croissance des algues. Ils ont d’éclairage programmable, régulation de température en temps réel et contrôle du pH. Malheureusement, ils sont coûteux et coûtent généralement plusieurs milliers de dollars par réacteur. Plus de revues scientifiques et d’ingénierie nécessitent réplication biologique des résultats, ce qui nécessite l’achat de plusieurs bioréacteurs. Nous présentons ici un système de réacteur de colonne de bulles qui comble le fossé entre les simples (fiole) et sophistiqué (entièrement contrôlée par bioréacteur) s’approche pour la culture d’algues-l’échelle du laboratoire. Colonnes de bulles permet de faciliter les échanges gazeux et de mélanger le réacteur hausse des bulles de gaz. Cette approche fournit un degré de contrôle sur l’éclairage et la température, mais le fait d’une manière peu onéreuse. En outre, nous avons trouvé ce système pour donner des résultats très cohérents entre les réplicats biologiques, réduisant le nombre de réplicats biologiques nécessaires afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs par rapport à l’approche de la fiole ou une bouteille. Nous avons également utilisé ce système pour cultiver avec succès des mélanges d’algues et de bactéries21. En plus de culture d’algues, nous décrivons une procédure pour mesurer la teneur en lipides neutres dans les algues cultivées. Cette dernière méthode a été publiée ailleurs22, mais nous incluons la procédure ici pour fournir des instructions pour savoir comment employer avec succès.

Protocol

1. installation de bulle colonne photobioréacteurs Construire un jeu de couvercles ventilés des couvercles en plastique fourni avec les bouteilles de verre de 1 L et les tubes d’hybridation (voir Figure 1 schéma et photos). Construire des couvercles pour l’humidificateur, piège, chaque air lift Photobioréacteur et chaque réacteur bouteille de mélange. ¼” trous dans le couvercle : 2 trous sont nécessaires pour les couvercles bioréacteur et humidificateur ; 3 …

Representative Results

Cette procédure donne une évolution temporelle des données de densité optique algues à OD 550 nm (Figure 4 a). La densité optique et le poids sec concentration les données peuvent être corrélés (Figure 4 b). Ceci est accompli en premier calcul de la concentration d’algues poids sec final après l’étape de lyophilisation. Ensuite, la densité optique de la dilution en série culture (effectuée le dernier jour de l?…

Discussion

Le facteur le plus important lorsque la culture d’algues est une compréhension des besoins spécifiques de l’organisme ou groupe d’organismes. Les algues, système de culture décrite ici peut être utilisé pour un large éventail d’algues mais des facteurs abiotiques (température, médias, pH, intensité lumineuse, teneur en CO2 , taux d’aération) la culture doivent être ajustés aux besoins de l’organisme. Notez les paramètres décrits ici ont été utilisés pour la culture de la Chlor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dans cette recherche, a appuyé par USDA National Institute of Food, Agriculture Hatch projet ALA0HIGGINS et les bureaux de l’Université Auburn de la prévôté, vice-président pour la recherche et le Samuel Ginn College of Engineering. A également appuyé par la NSF accorder CBET-1438211.

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35×300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24×2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

References

  1. Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
  2. Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
  3. Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
  4. Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
  5. Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
  6. Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
  7. Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae–A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
  8. Branyikova, I., et al. Microalgae – Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
  9. Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
  10. Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
  11. Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
  12. Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
  13. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  14. Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
  15. Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
  16. Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
  17. Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
  18. Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
  19. Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
  20. Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
  21. Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
  22. Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
  23. Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
  26. Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochemistry. , 578-730 (2012).
  27. de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -. P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
  28. Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. . Annual International Meeting of the ASABE. , (2018).

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Cite This Article
Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

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