Summary

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per costruire su scala di laboratorio bolla colonna fotobioreattori e li usa per cultura microalghe. Esso fornisce inoltre un metodo per la determinazione del tasso di crescita della cultura e del contenuto di lipidi neutri.

Abstract

C’è notevole interesse per lo studio delle microalghe per applicazioni di ingegneria come la produzione di biocarburanti, prodotti di alto valore e per il trattamento dei rifiuti. Come la maggior parte nuovi sforzi di ricerca iniziano a scala di laboratorio, c’è la necessità di metodi economici per la coltura di microalghe in maniera riproducibile. Qui, comunichiamo un approccio efficace alla cultura microalghe in fotobioreattori su scala di laboratorio e per misurare la crescita e il contenuto di lipidi neutri di quello alghe. Anche per istruzioni su come impostare il sistema di fotobioreattore. Anche se gli organismi di esempio sono specie di clorella e Auxenochlorella, questo sistema può essere adattato per coltivare una vasta gamma di microalghe, tra cui co-colture di alghe con specie non-alghe. Colture di riserva prima sono coltivate in bottiglie per la produzione di inoculo per il sistema di fotobioreattore. Inoculo di alghe è concentrato e trasferito in fotobioreattori per la coltivazione in modalità batch. I campioni sono raccolti ogni giorno per le letture di densità ottica. Alla fine della cultura batch, le cellule vengono raccolte da centrifuga, lavata e liofilizzati per ottenere una concentrazione finale di peso a secco. La concentrazione finale di peso a secco viene utilizzata per creare una correlazione tra la densità ottica e la concentrazione di peso a secco. Un metodo modificato di Folch viene successivamente utilizzato per estrarre i lipidi totali dalla biomassa liofilizzata e l’estratto viene analizzato per il suo contenuto di lipidi neutri usando un’analisi di micropiastre. Questo saggio è stato pubblicato in precedenza ma passaggi protocollo sono stati inclusi qui per evidenziare i passaggi critici della procedura cui frequentemente si verificano errori. Il sistema di bioreattore descritto qui riempie una nicchia tra coltivazione semplice boccetta e bioreattori commerciale completamente controllato. Replica anche con solo 3-4 biologico per il trattamento, il nostro approccio alla coltura di alghe porta a strette deviazioni standard nelle analisi del lipido e di crescita.

Introduction

L’applicazione di microalghe in ingegneria e biotecnologia ha attirato grande interesse negli ultimi anni. Microalghe sono allo studio per l’utilizzo in acque reflue trattamento1,2,3,4, biocarburanti produzione5,6,7,8e la produzione di prodotti nutraceutici e altri prodotti di alto valore9,10. Le alghe sono anche essendo geneticamente modificate al prezzo maggiore nel tentativo di migliorare la propria forma per ingegneria specifiche applicazioni11,12. Di conseguenza, c’è grande interesse nella sperimentazione con organismi industrialmente rilevanti nelle impostazioni controllate. Lo scopo di questo metodo è di comunicare un approccio efficace alla microalghe cultura in un ambiente di laboratorio controllato e per misurare la crescita e il contenuto di lipidi neutri di quello alghe. Migliorando la crescita tariffe e contenuto di lipidi neutri di microalghe sono stati identificati come due principali strozzature verso la commercializzazione dei biocarburanti alghe13.

Una vasta gamma di approcci sono stati utilizzati per le alghe di cultura per scopi sperimentali. In generale, questi approcci possono essere suddivisi tra coltivazione all’aperto su larga scala e su scala ridotta coltivazione indoor. Coltivazione all’aperto in fotobioreattori e stagni aperti è appropriato per la sperimentazione volta a scalare i processi che hanno già dimostrati a scala di laboratorio (ad esempio, per testare scale-up di un nuovo ceppo di alta-lipidico delle alghe)14. Tuttavia, la coltivazione su piccola scala indoor è opportuno durante lo sviluppo di ceppi di alghe nuove o migliorate o effettuando esperimenti volti a comprendere meccanismi biologici. In questi ultimi casi, per prendere in giro i cambiamenti sottili nel comportamento biologico è necessaria un’elevata di controllo sperimentale. A tal fine, colture axeniche sono spesso necessari al fine di ridurre al minimo i fattori biotici complessi connessi con altri organismi (per esempio batteri, altre alghe) che inevitabilmente crescono in grandi impianti all’aperto. Anche quando lo studio di interazioni tra le alghe e altri organismi, abbiamo trovato che uso di condizioni sperimentali altamente controllato è disponibile quando si esaminano scambio molecolare tra organismi15,16,17.

All’interno della categoria di coltivazione su piccola scala coperta di alghe, una gamma di approcci sono stati utilizzati. Forse l’approccio più comune è far crescere alghe in matracci di Erlenmeyer su una tabella di shaker sotto una luce banca18,19. Scambio di ossigeno e CO2 avviene per diffusione passiva attraverso una spina di schiuma nella parte superiore del pallone. Alcuni ricercatori hanno migliorato questo set-up attraverso aerazione attiva delle boccette20. Un altro approccio è quello di coltivare alghe in bottiglie, mixate da ancoretta e aerazione attiva. Nonostante la loro semplicità, abbiamo trovato che l’uso di bottiglie e boccette spesso porta a risultati incoerenti tra repliche biologiche. Presumibilmente questo è dovuto gli effetti di posizione – diverse posizioni ricevono diverse quantità di luce, che riguardano anche le temperature interne del reattore. Rotazione giornaliera dei reattori in nuove posizioni può aiutare ma non risolve il problema perché alcune fasi di crescita delle alghe (per esempio, presto esponenziale) sono più sensibili agli effetti posizionali rispetto ad altri (ad es., fase di log).

Sul lato opposto dello spettro di sofisticazione tecnologica sono completamente controllati commerciale fotobioreattori. Questi sistemi continuamente monitorare e regolare le condizioni nel reattore per ottimizzare la crescita delle alghe. Hanno illuminazione programmabili, controllo della temperatura in tempo reale e controllo del pH. Purtroppo, sono costosi e in genere costano diverse migliaia di dollari al reattore. Più riviste scientifiche e ingegneristiche richiedono la replica biologica dei risultati, rendendo necessario l’acquisto di più bioreattori. Presentiamo qui un sistema di reattore bolla colonna che colma il divario tra la semplice (pallone) e sofisticato (completamente controllato bioreattore) si avvicina per la coltivazione delle alghe su scala di laboratorio. Bolla colonne utilizzare delle bollicine di gas per facilitare lo scambio di gas e mescolare il reattore. Questo approccio fornisce un certo grado di controllo sull’illuminazione e temperatura ma lo fa in un modo che è conveniente. Inoltre, abbiamo trovato questo sistema per produrre risultati altamente coerenti tra replicati biologici, riducendo il numero delle ripetizioni biologici necessari al fine di ottenere risultati statisticamente significativi rispetto all’approccio fiasco o bottiglia. Abbiamo anche utilizzato questo sistema per coltivare con successo miscele di alghe e batteri21. Oltre alla coltivazione delle alghe, descriviamo una procedura per misurare il contenuto di lipidi neutri nelle alghe coltivate. Il metodo di quest’ultimo è stato pubblicato altrove22, ma includiamo la procedura qui per fornire istruzioni dettagliate su come impiegare con successo.

Protocol

1. installazione di bolla colonna fotobioreattori Costruire un set di coperchi ventilati dai coperchi di plastica che è venuto con le bottiglie di vetro 1L e tubi di ibridazione (vedere la Figura 1 per schema e foto). Costruire coperchi per l’umidificatore, trappola, ogni fotobioreattore ascensore aria e ogni bottiglia reattore di miscelazione. ¼” fori nel coperchio: 2 fori sono necessari per coperchi bioreattore e umidificatore; 3 fori sono necessari per la trappola di m…

Representative Results

Questa procedura produce un corso di tempo dei dati di densità ottica algali a OD 550 nm (Figura 4A). La densità ottica e il peso a secco la concentrazione di dati possono essere correlata (Figura 4B). Questa operazione viene eseguita dal primo calcolo della concentrazione di alghe di peso secco finale dopo il passaggio di liofilizzazione. Successivamente, la densità ottica della diluizione seriale di cultura (eseguita l’ultim…

Discussion

La considerazione più importante quando la coltura di alghe è la comprensione delle esigenze specifiche dell’organismo o del gruppo di organismi. Il sistema di coltivazione qui descritto può essere utilizzato per una vasta gamma di alghe ma gli specifici fattori abiotici (temperatura, media, pH, intensità luminosa, livello di CO2 , tasso di aerazione) della coltura di alghe devono essere adattati alle esigenze dell’organismo. Nota i parametri descritti qui sono stati utilizzati per la coltivazione di c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il supporto per questa ricerca è stato fornito dallo USDA National Institute of Food e agricoltura Hatch progetto ALA0HIGGINS e gli uffici di Università Auburn del Prevosto, il Vice Presidente per la ricerca e la Samuel Ginn College di ingegneria. Supporto è stato fornito anche da NSF concedere CBET-1438211.

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35×300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24×2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

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Cite This Article
Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

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