Summary
Her presenterer vi en protokoll for å konstruere lab skala boble kolonnen photobioreactors og bruke dem til kultur mikroalger. Det gir også en metode for bestemmelse av kultur vekst og nøytrale lipid innhold.
Abstract
Det er betydelig interesse i studiet av mikroalger for tekniske applikasjoner som produksjon av biodrivstoff, høy verdi produkter, og for behandling av avfall. Som de fleste nye forskningsinnsats begynner på laboratoriet skala, er det behov for kostnadseffektive metoder for dyrking av mikroalger på en reproduserbar måte. Her kommuniserer vi en effektiv tilnærming til kultur mikroalger i laboratoriet skala photobioreactors, og å måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Instruksjonene finnes også på hvordan du setter opp photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismene Chlorella og Auxenochlorella, kan dette systemet tilpasses for å dyrke en rekke mikroalger, inkludert co kulturer av alger med ikke-alger arter. Lager kulturer dyrkes først i flasker for å produsere inoculum for photobioreactor-systemet. Alger inoculum er konsentrert og overført til photobioreactors for dyrking i satsvis modus. Eksempler er samlet daglig for optisk densitet målingene. På slutten av batch kultur, celler er høstet av sentrifuge, vasket, og fryse tørket å få en endelig tørrvekt konsentrasjon. Siste tørrvekt konsentrasjonen brukes til å lage en sammenheng mellom optisk densitet og tørr vekt konsentrasjonen. En modifisert Folch metode brukes deretter til å hente totalt lipider fra frysetørket biomasse og ekstrakt er assayed for sin nøytrale lipid innhold ved hjelp av en microplate analysen. Denne analysen er publisert tidligere, men protokollen skritt ble tatt her for å markere viktige trinnene i fremgangsmåten hvor ofte oppstår. Bioreactor systemet beskrevet her fyller en nisje mellom enkel kolbe dyrking og fullt kontrollert kommersielle bioreactors. Selv med bare 3-4 biologiske replikerer per behandling, vår tilnærming til dyrking alger fører til tett standardavvik i vekst og lipid analyser.
Introduction
Anvendelsen av mikroalger i ingeniørfag og bioteknologi har tiltrukket stor interesse i de senere år. Mikroalger blir undersøkt for bruk i avløpsvann behandling1,2,3,4, biodrivstoff produksjon5,6,7,8, og produksjon av nutraceuticals og andre høy verdi produkter9,10. Alger er også genetisk endres til høyere priser i et forsøk på å forbedre deres egnethet for bestemte tekniske programmer11,12. Dermed er det stor interesse eksperimentering med industrielt relevante organismer i kontrollerte innstillinger. Formålet med denne metoden er å kommunisere effektiv tilnærming til kultur mikroalger i et kontrollert laboratoriemiljø og måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Forbedre vekst priser og nøytrale lipid innhold av mikroalger har blitt identifisert som to viktige flaskehalser mot kommersialisering av alger biodrivstoff13.
En rekke tilnærminger har blitt brukt til kultur alger for eksperimentelle formål. Generelt, kan disse metodene deles mellom store utendørs dyrking og småskala innendørs dyrking. Utendørs dyrking i photobioreactors og åpne dammer er egnet for eksperimentering å skalere opp prosesser som er allerede påvist i laboratoriet skala (f.eks å teste skalaen opp av en ny høy-lipid stamme av alger)14. Men innendørs småskala dyrking er egnet når utvikle nye eller forbedrede alger stammer eller utføre eksperimenter sikte på å forstå biologiske mekanismer. I disse siste tilfellene, er en høy grad av eksperimentelle kontroll nødvendig å tease ut subtile endringer i biologisk atferd. Derfor, er axenic kulturer ofte nødvendig for å minimere de komplekse biotiske faktorene assosiert med andre organismer (f.eks bakterier, andre alger) som uunngåelig vokse i store utendørs systemer. Selv når studere interaksjoner mellom alger og andre organismer, har vi funnet at bruk av svært-kontrollerte eksperimentelle forhold er nyttig når undersøke molekylær utveksling mellom organismer15,16,17.
Innenfor kategorien av småskala innendørs Algedyrking har en rekke tilnærminger brukt. Kanskje er den mest brukte metoden å dyrke alger i Erlenmeyer flasker i en shaker tabell under en lys bank18,19. Utveksling av oksygen og CO2 foregår ved passiv spredning gjennom en skum plugg i toppen av flasken. Noen forskere har forbedret dette oppsettet gjennom aktiv lufting av flasker20. En annen tilnærming er å dyrke alger på flasker, mikset av rør bar og aktive lufting. Til tross for sin enkelhet, har vi funnet at bruk av kolber og flasker fører ofte til inkonsekvente resultater blant biologiske gjentak. Antagelig dette skyldes posisjon effekter - forskjellige posisjoner motta ulike mengder av lys, som også påvirker interne reaktoren temperaturer. Daglig rotasjon av reaktorer til nye plasseringer kan hjelpe, men ikke avhjelpe problemet fordi visse stadier av alger vekst (f.eks tidlig eksponentiell) er mer følsomme for posisjonelle effekter enn andre (f.eks Logg fase).
På motsatt side av spekteret av teknologisk raffinement er fullstendig kontrollert kommersielle photobioreactors. Disse systemene kontinuerlig overvåke og justere forhold i reaktoren å optimalisere algene oppblomstringen. De har programmerbare belysning, sanntid temperaturkontroll og pH-kontroll. Dessverre de er dyre og vanligvis koster flere tusen dollar per reaktoren. Mest vitenskapelige og tekniske tidsskrifter krever biologiske replikering av resultater, nødvendiggjør kjøp av flere bioreactors. Vi presenterer her en boble kolonnen reaktoren system som broer skillet mellom enkel (kolbe) og sofistikert (fullt kontrollert bioreactor) tilnærminger for lab skala Algedyrking. Boble kolonnene bruker stigende gassboblene å lette gassutveksling og bland reaktoren. Denne tilnærmingen gir en viss grad av kontroll over lys og temperatur, men gjør det på en måte som er kostnadseffektiv. Videre har vi funnet dette systemet å gi svært konsekvente resultater blant biologiske gjentak, redusere antall biologiske gjentak nødvendig for å få statistisk signifikante resultater sammenlignet med kolbe eller flaske tilnærming. Vi har også brukt dette systemet til vellykket dyrke blandinger av alger og bakterier21. I tillegg til Algedyrking skissere vi en prosedyre for å måle nøytral lipid innholdet i kulturperler alger. Sistnevnte har vært publisert andre steder22, men vi inkluderer fremgangsmåten her for å gi trinnvise instruksjoner for hvordan du bruker den med hell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oppsett av boble kolonnen Photobioreactors
- Konstruere en rekke ventilerte dekslene fra plast dekslene som kom med 1 L glassflasker og hybridisering rør (se figur 1 for skjematisk og bilder). Konstruere lokk luftfukter, blande felle, hver air lift photobioreactor og hver flaske reaktoren.
- Bore ¼" hull i lokket: 2 hull er nødvendig for bioreactor og luftfukter lokk; 3 hull er nødvendig for miksing fellen.
- Ta en ¼" O-ring over trådene av en 1/8†panel mount Luer passende, og skyv dette inn i ¼" hull boret på lokket (figur 1A).
- Ta en andre ¼" O-ring over trådene slik at lokket er klemt mellom de to O-ringene. Ta en låsemutteren på trådene og stram for å løse panel mount Luer i stedet.
- Fest lås ringene på den synlige mannlige Luer ut fra lokket. Gjenta trinn 1.1.2-1.1.4 for hvert hull i lokket.
- For lokk som skal brukes på boble kolonne og flaske reaktorer, fest 1/8†kvinnelige Luer til barb beslag til 1,5" stk 1/8†ID PVC rør. Fest dette til hver av synlige mannlige Luer beslag på lokket.
- Koble en tilbakeslagsventil (peker fra lokket) til gratis slutten av en av 1/8†stykker.
Merk: Dette vil tjene som eksos porten for bioreactor. - Koble en mannlig Luer til barb passer til andre stykke 1/8†rør eller lokket. Klikk roterende låseringen på plass og fest en 0.2 mm luftfilter til dette.
Merk: Dette vil tjene som innløp port for reaktoren.
Figur 1. Skjematisk og bilder for å konstruere bioreactors. (A) skjematisk for byggingen av bioreactor lokk (B) bilde av sammensatte bioreactor lokket, og (C) bilde av sammensatte lokket brukes i luftfukter. Merk at luftfukteren er modulbasert bør være belagt i vanntett silikon å sikre en lufttett forsegling med lokk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Montere luft leveringssystem (se figur 2A og 2B for en skjematisk og bilde).
- Fest 1/8†NPT tråden barb tilbehør til innganger og utganger på baksiden av hver rotameter.
Merk: 200-2500 cm3/minutt rotameters er for luften trykk modulering oppstrøms av luftfukter, 100-1000 cm3/minutt rotameters er for flaske reaktorer, 50-500 cm3/min rotameters er air lift bioreaktorer og 5-50 cm3/ min rotemeters er CO2 flyt regulering. Det anbefales å montere rotameters på en fast overflate (f.eks plast ark) så de ikke faller under drift. - Slå av komprimert luft kilde, og koble ¼" ID fleksible PVC rør til trykkluft kilden med en slange klemme. Trinn ned slangen diameteren til 1/8†ID PVC fleksible rør bruker en ¼" kvinnelige barb montering og en 1/8†mannlige til barb passer.
- Koble gratis slutten av 1/8†ID slangen i innløpet til en 200-2500 cm3/minutt rotameter.
Merk: Utløpet av denne rotameter vil mate luftfukter flasken via 1/8†ID rør. - Koble 1/8†rør til en innløpet til ventilerte lokk (bruk en kvinnelig Luer å barb passende å lage). Koble deretter en andre del av 1/8†rør på innsiden av montere panel montering.
Merk: Dette stykket vil henge ned i luftfukter og boble luft gjennom vannet. - Fest 1/8†kvinnelige Luer barb beslag i hver ende av en 1/8†ID rør og bruke dette stykket koble utløpet av luftfukter i innløpet til miksing fellen.
- På samme måte som 1.2.5, koble utløpet av CO2 regulator til en annen port på blande fellen.
- Konstruere en manifold bruker 1/8-tommers rør og 1/8†multiport barb (se figur 2 C) for å skaffe luft i rotameter bankene.
Merk: Disse rotameters skal brukes til å levere bioreactors. Unngå å opprette mer enn 6 rotameters i serien. I stedet bruk parallelle bredden av rotameters for å utvide systemet. Kontroller at den totale flyt etterspørselen etter alle reaktorene er mindre enn 2500 cm3/minutt (eller annet et større rotameter vil være nødvendig oppstrøms luftfukter). - Koble uttaket (3rd porter) av miksing felle nybygde rotameter bankene bruker 1/8†rør og en 1/8†kvinnelige til barb Luer.
- Koble langt nok 1/8†rør til uttak av hver rotameter i rotameter banken å levere luft i bioreactors. Etiketten endene av slangen samt rotameters i banken.
- Bruk vanntett silikon rundt alle porter luftfukter og miksing felle lokk for å sikre de lufttett.
- Fest 1/8†NPT tråden barb tilbehør til innganger og utganger på baksiden av hver rotameter.
Figur 2. Skjematisk og bilder for montering boble kolonnen systemet. (A) skjematisk av lufting systemet (B) bilde av luftfukter, blande felle, og rotameter bank, og (C) bilde av manifolder brukes til å koble rotameter bankene sammen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Sette opp fisken tank, rør platene og lys (Figur 3).
Advarsel: Dette systemet krever et stort antall uttak og krets kapasitet til å støtte alle komponenter. Unngå strenger sammen flere forgrenere og skjøteledninger i en kjede mote fordi dette er en elektrisk fare. Bruk av GFI type uttak og grenuttak er svært oppmuntret av vann i systemet.- Ordne lavprofils magnetiske stirrers på jevnt underlag som er sterk nok til å holde vekten av fylt med vann fisken tank.
- Plasser små tre eller plast blokker (som er litt høyere enn rør platene) rundt omkretsen av rør platene vekten av fisken tank.
FORSIKTIG: Unngå å plassere fisken tank direkte på rør platene som vekten skal knuse dem. - Legg fisken tank over rør platene og støtte blokker og fylle tankene med vann.
- Cut et stykke stiv plast ark til å passe på fisken tank som et lokk. Skjære hull i dette dekker å skyve hybridisering rørene ut. Også skjære hull for fisken tank Varmeapparat.
- Ordne fluorescerende lys bredden ved siden av fisken tank å gi vannrett belysning av bioreactors. Plugg lett banken i en lys timer for å stille en dag/natt syklus.
Figur 3. Systemet skjematisk for flaske bioreactors (venstre) og boble kolonnen photobioreactors (høyre). Dette tallet har blitt endret fra Higgins et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. utarbeidelse av mikroalger Inoculum
- Få mikroalger inoculum fra en cryo bevarte, forkrommet eller flytende kultur.
Merk: Det anbefales at cryopreserved organismer være belagt før bruk som inoculum å sikre at cellene er levedyktig og at den resulterende kulturen er axenic. Agar medium (f.eks., ATCC #5 sporulating agar)21 er en rik medium som fungerer bra for å gjenopplive arter av Chlorella og Auxenochlorella fra cryo-lagring. - Forberede 2,4 liter mineral mediet som passer for bestemt mikroalger arten.
Merk: Eksempler N8 middels23 for arter av Chlorella, N8-NH4 mellomstore21 for arter av Auxenochlorella. Bruk av et medium som passer for alger belastningen er en av de viktigste trinnene mot sikre robust algene oppblomstringen. - Aliquot 2,4 L mineral middels like i tre 1 L glassflasker, legge rør barer til hver flaske og montere ventilerte lokkene (figur 1) for hver flaske. Dobbeltsjekke som lufting røret innløpet side og hver flaske har en røre bar.
- Autoclave lager flasker med en flytende sterilisering syklus (121 ° C) for 30 min. Autoclave 100 mL deionisert vann (dH2O) og noen 1,5 mL rør på samme tid, som senere brukes for plating. Tillate mellomlang til kule overnatting. Alternativt avkjøle reaktoren til romtemperatur, og deretter aerate for 2t før vaksinering.
- I en biosafety kabinett (BSC), vaksinere mikroalger fra en plate eller axenic flytende kultur i lager flaskene. Bruke steril teknikk for å opprettholde axenic kulturer i fremgangsmåten.
- Legge til 20 mL autoklaveres dH2O i et sterilt 50 mL sentrifuge rør. Bruk en steril 10 µL disponibel loop for å plukke flere enkelt kolonier fra platen fra trinn 2.1. Dyppe loopen i 50 mL tube og vask alger cellene i det 20 mL autoklaveres dH2O. riste 50 mL tube å lage en homogen mikroalger løsning.
- Pipetter 6 mL av mikroalger løsning i hver lager flaske med en 10 mL steril serologisk pipette. Swirl flasken å blande mikroalger jevnt til medium.
- Bruk en 2 mL steril serologisk pipette for å trekke 1 mL prøver fra hvert lager flaske og overføre til bakteriefri 1.5 mL rør.
Merk: Mikropipetter anbefales ikke for dette trinnet på grunn av risikoen av forurensning. Stram ventilerte lokkene på lager flasker. - Plasser lager flaskene på rør plater (~ 150 rpm) og justere air flow rate, CO2og belysning nivåer som passer for arten. Rotere lager flaske plasseringen hver dag.
- Fortynne 1 mL prøver innhentet under trinn 2.6 (100-fold fortynning i sterilt vann fungerer vanligvis bra) og spre plate på en rik agar medium.
Merk: Disse platene kan brukes til å se etter forekomster av forurensning også som tjener som en kilde til fremtidige alger inoculum for ytterligere eksperimenter. - Ta prøver fra flasker (i BSC) hver to dager for å sjekke mikroalger veksten.
Sett prøvene i en 96-brønnen microplate i tre eksemplarer (200 µL) og måle optisk tetthet (OD) på 550 nm og 680 nm hver to dager til OD når 0,2-0,3 (som vanligvis krever 5-7 dager). - Stopp inkubering og plassere lager flaskene på en benk 24-48 h å tillate alger cellene å avgjøre ved gravitasjon.
Merk: Utlignede cellene vil bli brukt neste å vaksinere boble kolonnen photobioreactors. Hvis en rask celle samling ønskes, kan celler være sentrifugeres på mer enn 1000 x g å samle celler.
3. dyrking av mikroalger i boble kolonnen Photobioreactors
- Dagen før bioreactor inoculation, forberede mediefil og overføre 200 mL (eller ønsket volum) å boble kolonnen photobioreactor rør (hybridisering rør). Autoclave rør med media og ventilerte lokkene på plass.
Merk: Hvis du bruker avløpsvann som en vekst medium, autoklav tomt bioreaktorer og legge sterilt-filtrert avløpsvann (hvis axenic kultur er ønsket). - Konsentrere utlignede mikroalger lager ved å fjerne nedbryting bruk av en vakuumpumpe. La mindre enn 100 mL medium i hver flaske, men unngå fjerne utlignede alger.
Merk: Utføre denne prosedyren i en BSC og følg steril teknikk. En enkel vakuum apparater kan konstrueres et vakuum kolbe eller flaske. Passe en steril serologisk pipette på enden av slangen. - Suspendere og overføre til alger slurry til sterilt 50 mL sentrifuge rør. Sentrifuger 1000 x g i 5 min å konsentrere alger.
- BSC, fjerne nok nedbryting for å oppnå et totalt volum på ~ 80 mL av alger konsentrater for 12 photobioreacters. Unngå vacuuming ut pellet. Overføre alger konsentrat til en sterile containeren (eller brukte alger lager flasken).
- Legge til 6 mL av alger slurry i hver photobioreactor med en bakteriefri 10 mL serologisk pipette.
- Sterilt filter (0.2 mm sprøyte eller vakuum filter) og legge til passende mengder av alle stoffer (f.eks vitamin aksjer) som ikke kan autoklaveres.
- Swirl bioreaktorer å blande alger til medium.
- Trekke en 2 mL prøve fra hver bioreactor bruker serologisk pipette og overføring til en 2 mL tube. Samle en 2 mL prøve (i en BSC) hver 24 h kultur fremdriften. Sjekk prøven for pH bruk test strimler og justere reaktoren etter behov med enten 3 M NaOH eller 3 M HCl.
- Snurp bioreactor lokkene og plassere alle bioreaktorer i vannbad fisken tank. Justere lufting, CO2og belysning til riktig nivå for arten. Rotere plasseringen bioreactor hver dag etter (trinn 3.8).
- Bruke 200 µL av hver kultur prøve i tre eksemplarer wells fra en 96 godt microplate. Måle optisk tetthet (OD) på 550 nm og 680 nm.
- På den siste dagen i perioden kultur, måle OD under ulike fortynning faktorer (f.eks en 1 x 2 x, 4 x, 8 x, 16 x og 32 x) til å etablere en sammenheng mellom OD og den faktiske tørr vekten etter innhøsting (trinn 4).
- Sentrifuge 2 mL eksempel røret på 12.000 x g i 5 min.
- Filtrere nedbryting gjennom 0,2 µm ikke-sterilt sprøyten og lagre nedbryting (og pellets hvis nødvendig) uten høyere enn 20 ° C for langtidslagring og senere analyser av endringer i media komposisjon.
4. høste og Frysetørring av Microalgal biomasse
- Mål et fast volum av alger kultur fra hver bioreactor med en uteksaminert sylinder (f.eks 160 mL fra en bioreactor som opprinnelig inneholdt 200 mL medium) og overføre til sentrifuge flasker. Skyll den uteksaminert sylinderen med dH2O mellom hver måling.
- Sentrifuge 4,696 x g for 5 min. forkaste nedbryting av nøye støvsuging den ut.
- Overføre pellets til merket 50 mL rør. Skyll den sentrifuger flasker med dH2O og overføre innhold til 50 mL rør. Kontroller totale tube volumet ikke overstiger 45 mL.
- Vask alger pellets med dH2O fjerne salter.
- Sentrifuge 50 mL rør 4,696 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Legge til 40 mL dH2O til hver 50 mL tube; Vortex å blande. Sentrifuge igjen 4,696 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Gjenta trinn 4.4.2 igjen.
- Etiketten og veie tom 15 mL sentrifuge rør på en 4-desimal balanse (etiketten både lokket og rør og veie dem sammen). Veie en tube per alger kultur. Veie hver 15 mL tube to ganger for å redusere feil.
- Etter siste vask, forkaste nedbryting, og legge 7,5 mL av dH2O til hver 50 mL tube. Vortex og overføre rør alger slam i det pre vektet 15 mL. Skyll 50 mL rør med ekstra dH2O og overføre væske til 15 mL rør. Unngå å overskride 12 mL av totalt volum i 15 mL rørene.
- Sentrifuge 15 mL rør 4,696 x g i 5 min og Dekanter nedbryting. Fryse rør med pellets ved-80 ° C i minst 30 min i forberedelse til Frysetørring.
- Fryse tørke over natten eller til tørket.
- Veier og registrere fryse tørket 15 mL rør med alger.
5. lipid utvinning bruker en endret Folch metoden24
- Veie ut 20 mg av fryse-tørket algehelse biomasse til en 2 mL skrukork polypropylen tube (Sjekk produsenten etiketten til produktet er egnet for perle utdrag).
- Legge til 1,5 mL Folch løsemiddel (2:1 kloroform/metanol) til hver 2 mL tube (som inneholder 20 mg av fryse-tørket alger). Hell ~0.5 mL zirconia/silica perler (0,5 mm) i hver rør til væskenivået i rør når 2 mL.
FORSIKTIG: Håndtere kloroform og metanol i avtrekksvifte og unngå puster røyk eller hudkontakt. - Homogenize alger prøvene i en perle mill for 20 s med en hastighet på 6,5 m/s. rør til is for 30 å chill prøver. Gjenta fem ganger for å trekke fullt lipider.
- Filtrere homogenate gjennom en 5 mL sprøyte som inneholder en rustfritt stål wire netting disk (#60 mesh) å stamme ut perler, samle filtratet i en 15 mL tube.
- Vask perler med 1,5 mL Folch løsemiddel, presser væske gjennom med sprøyten som nødvendig. Gjenta denne vask to ganger og samle alle filtratet i 15 mL tube, gir et endelig antall ca 6 mL.
- Legge til 1,2 mL 0,9% (w/v) NaCl løsning Folch ekstrakt i 15 mL tube og vortex å bland godt.
Merk: Eventuelt flere Folch løsemiddel kan brukes å vaske perler (Bruk 0,2 x totale vask volumet 0,9% NaCl løsning å indusere fase separasjon). - Sentrifuge 15 mL rør 6000 x g for 5 min. post nederst kloroform (grønn) fase volumet til den nærmeste 0,1 mL med linjer på siden av 15 mL tube. Overføre bunnen fase til en hetteglass (med lokk) med et glass Pasteur pipette.
- Lagre lipid på 20 ° C eller (-80 ° C hvis det er planer om å bruke dette ekstrakt for fettsyrer analyse).
6. nøytral Lipid analysen med en Microplate metode (tilpasset fra Higgins et al. 201422)
- Klargjør lager løsninger. Forberede 10 mL 1 mg/mL vegetabilsk olje standard i kloroform og lagre på 20 ° C.
Merk: Alle vegetabilsk olje kan brukes i denne analysen fordi den ikke er følsom for typene fettsyrer. Forberede 10 mL av 200 µg/mL Nilen rød løsning i dimethyl sulfoxide (DMSO) og lagre i mørket ved romtemperatur. - Forvarm tørr microplate blokk til 55 ° C i avtrekksvifte. Mens dette er oppvarming, fortynne lipid ekstrakter og vegetabilsk olje standard 3-fold med metanol.
Merk: Dette fortynning kan endres avhengig av lipid innhold av alger, men dette fungerer godt for de fleste Chlorella. - For hver utvannet prøve, legge til 80 µL en 96 godt polypropylen microplate i quadruplicate.
FORSIKTIG: Bruk av polystyren plasticware anbefales ikke for bruk med organiske løsemidler. - Løsemiddelet tomt, gjelde 80 µL av 2:1 metanol/kloroform i quadruplicate. For standarder, legge 10, 30, 60, 90 og 120 µL av utvannet vegetabilsk olje i quadruplicate.
- Sett microplate i en tørr blokk ovn ved 55 ° C i 20-30 minutter til alle løsemiddel har fordampet. Mens løsemiddelet fordamper, forberede arbeider Nilen rød løsning (trenger 200 µL av 1 µg/ml løsning per plate godt). Som et eksempel krever tolv prøver og et komplett sett av standarder 16 mL 1.0 µg/mL løsning; forberede ved å løse opp 80 µL av 200 µg/mL aksjer (i DMSO) i 16 mL dH2O.
- Fjerne microplate fra oppvarming blokken og la avkjøles til romtemperatur. Legg 30 µL av isopropyl alkohol i hver brønn og bland av pipettering opp og ned. Kontroller alle pipette kanaler blande løsningen og resuspending lipider, gir en homogen grønn væske.
- Legge til 200 µL av Nilen rød løsning (1 µg/mL) til hver Vel, Pipetter opp/ned 10 ganger å blande. Inkuber platen i 5 minutter ved romtemperatur. Mens du venter, kan du forberede en 50% bleike løsning av blander blekemiddel (6% hypokloritt) med dH2O. 20 µL per brønn er nødvendig. Utarbeidelse av 3 mL 50% blekemiddel er tilstrekkelig for 12 prøver og et komplett sett av standarder.
- Legge til 20 µL av bleike løsning i hver microplate godt og Pipetter opp og ned 5 ganger bland godt. Inkuber 30 min ved romtemperatur.
- Etter 30 min, lese fluorescens i prøvene hvert 5-10 min på 530 nm eksitasjon/575 nm utslipp med auto cutoff satt til 570 nm til signalet fra alger prøver stabiliserer. 60 min totale inkubasjon er vanligvis tilstrekkelig.
- Opprette en kalibreringskurven for vegetabilsk olje standarder (i området 0-40 ng/oljebrønn).
Merk: En lineær passer fungerer godt for lav (< 30 ng/vel) olje konsentrasjoner og en polynom passer kan brukes hvis standard overstiger 30 ng/godt. Bruk denne sammenhengen til å kvantifisere den nøytrale lipid i brønnene som eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne prosedyren gir en gang løpet av alger optisk tetthet data på OD 550 nm (figur 4A). Optisk tetthet og tørr vekt konsentrasjon data kan være korrelert (figur 4B). Dette oppnås ved første beregning av den endelige tørrvekt alger konsentrasjonen etter fryse-tørking trinn. Neste, den optiske densitet for kultur føljetong fortynning (utføres på den siste dagen av sampling) og de faktiske tørrvekt konsentrasjonene kan samsvares. For lav celle konsentrasjoner, kan en lineær sammenheng brukes mens høyere celle konsentrasjoner, en andre orden polynom sammenheng kan brukes. Det anbefales å opprette en egen sammenheng for hver kultur betingelse. Endelig kan korrelasjonen brukes gang kurs optisk tetthet data å få en tørr vekt vekstkurve (figur 4C). I denne eksempel eksperimentet, Auxenochlorella protothecoides (UTEX 234125) ble kultivert under fire betingelsene: axenic kontroll kulturer dyrket på fersk N8-NH4 mellomstore21, i co kultur med bakterier Azospirillum brasilense, i medium supplert med 50 mg/L av indol-3-eddiksyre og brukt på middels fra A. brasilense. A. brasilense er kjent for å produsere indol-3-eddiksyre, en plantevekst fremme hormon, som også fremmer veksten i noen mikroalger. Men på 50 mg/L hemmet IAA behandling helt A. protothecoides vekst. Følgelig optisk tetthet data var tilgjengelig, men mengden av alger var nok til å få en nøyaktig tørrvekt konsentrasjon. I dette tilfellet sammenhengen for kontroll kultur kan brukes eller optisk tetthet data kan rapporteres direkte. Fordi OD data var samlet på begge 550 nm og 680 nm absorbansen, enten datasett kan brukes til sammenhengen mellom OD og tørr vekt. Vanligvis blir OD 550 brukt fordi det nesten helt utelukker absorbansen klorofyll26, dermed undertrykke bias fra endringer i klorofyll innhold. Derimot OD 680 inkluderer absorbansen av klorofyll og høye prosenter av OD 680 550 angir høy klorofyll innhold i alger. Figur 4 d viser et sett med tolv alger kulturer vokser i boble kolonnen photobioreactors. Selv med bare tre biologiske gjentak per behandling, ble stramt standardavvik oppnådd, tillater for høy følsomhet for forskjeller mellom behandlingene.
Figur 4. Algene oppblomstringen resulterer i boble kolonnen photobioreactors. (A) optisk densitet (550 nm) vekstkurve av Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341) viser kulturer inn sent logaritmisk vekst på 120 timer. Kontroll kulturer ble dyrket på fersk N8-NH4 medium, behandling 1 er co kulturer av A. protothecoides og Azospirillum brasilense dyrket på fersk N8-NH4 medium, behandling 2 er axenic A. protothecoides dyrket på N8-NH4 medium med 50 mg/L indol-3-eddiksyre (IAA), og behandling 3 er axenic A. protothecoides vokst på brukte medium fra A. brasilense. Brukte mediet ble utarbeidet av dyrking A. brasilense 96 timer på N8-NH4 medium med 2 finans eplesyre. Cellene ble fjernet, og mediet var re supplert med ammonium å gjenopprette sitt første nivå, pH ble justert, og medium var sterilt filtrerte (0,2 μm). Merk at 50 mg/L IAA behandling helt hemmet algene oppblomstringen. (B) korrelasjon kurver mellom OD 550 nm og endelige tørrvekt konsentrasjon bruker en andre orden polynom passform. Ingen sammenheng vises for behandling 2 fordi ingen alger kan høstes ved slutten av perioden kultur. (C) bruk av polynom korrelasjonen optisk tetthet data gir en vekstkurve med tørr vekt konsentrasjon på y-aksen. Kontroll kultur korrelasjon ble brukt OD data for behandling 2. Feilfelt er standardavvik basert på 3 biologiske replikerer. (D) bilde av boble kolonnen photobioreactors etter kultur vaksinering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Nøytral lipid data vises for to eksempel eksperimenter i figur 5. Denne analysen har vist seg å korrelere med nøytral lipid innhold, spesielt triacyglycerol (TAG) innhold. Dette kan sees ved å sammenligne nøytral lipid analysen (figur 5A) til en tilsvarende tynt lag kromatografi plate (figur 5B). Den samme trenden kan sees i andre eksperimentet (figur 5C og 5 D). I alle disse eksperimentene, var rapsolje brukt som standard og resulterte i en lineær sammenheng (R2 0,98 for første eksperimentet og 0,99 for andre) mellom fluorescens og raps olje masse i brønnen. Merk at hvis alle prøver har lav lipid innhold, det høyeste punktet eller to på standard kan være droppes. Denne sammenhengen kan brukes til å beregne antall nøytral lipid (µg) i hver av alger utvalg. Olje masse kan deretter konverteres til en konsentrasjon i lipid utdrag på microplate godt. Multipliseres denne verdien med fortynningsfaktoren (f.eks 3 x) å få nøytral lipid innholdet i den opprinnelige Folch ekstrakter. Denne konsentrasjonen er deretter multipliseres med volumet av ekstraktet (bør være nær 4 mL) og deretter dividert med den totale massen alger biomasse brukes for lipid utvinning (bør være nær 20 mg). Resultatet er nøytral lipid innholdet av mikroalger.
Figur 5. Nøytral lipid data Hentet fra avlinger av Chlorella sorokiniana (UTEX 2714). (A) nøytral lipid innhold (% tørrvekt) for alger i eksperiment 1 i alger som var vokst i 120 timer. Kontroll kulturen var axenic og kultivert på fersk N8 middels23behandling 1 var en co kultur for C. sorokiniana og A. brasilense på fersk N8 medium, behandling 2 var frisk N8 medium med 50 mg/L IAA og behandling 3 ble brukt mediet A. brasilense. Brukte mediet ble utarbeidet av dyrking A. brasilense 96 timer i N8 medium med 2 finans eplesyre, fjerne celler, supplere tapt nitrat, justere pH, og sterile filtrering mediet (0,2 μm). I motsetning til A. protothecoides, 50 mg/L av IAA ikke hemme C. sorokiniana vekst. (B) TLC plate bilde for eksperiment 1 viser relativ TAG overflod. (C) nøytral lipid innhold (% tørrvekt) for alger i eksperimentet 2 som hadde de samme behandlingene som eksperiment 1 men cellene ble høstet etter 72 timer med vekst. (D) TLC plate bilde for eksperimentet 2 viser relativ TAG overflod. Feilfelt er standardavvik basert på 3 biologiske replikerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det er også lurt å beregne variasjonskoeffisienten (standardavvik delt middelverdien) av rå fluorescens målinger over alle tekniske replikat i nøytral lipid analysen. Forutsatt tekniske gjentak ble utført i microplate i quadruplicate som nevnt i prosedyren, bør variasjonskoeffisienten vanligvis ikke overstige 10%. Høy koeffisienter variasjon er vanligvis et resultat av dårlig blanding (spesielt i tillegg av isopropyl alkohol) og potensielt feil bruk av flerkanals pipette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigste hensynet når dyrking alger er en forståelse av behovene til organisme eller gruppe organismer. Algene dyrking systemet beskrevet her kan brukes å kulturen en rekke alger men bestemte abiotiske faktorer (temperatur, media, pH, lysintensitet, CO2 -nivå, lufting rate) må justeres for organismen. Merk parameterne som beskrives her ble brukt til dyrking av Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismene er industrielle interessante fordi de er tolerante høyt næringsinnhold, lys og temperatur nivåer27. Men lysnivåer kan reduseres gjennom fjerning av lysrør og dag/natt syklus kan justeres for å representere sesongvariasjoner. Vann varmeovner kan likeledes slås opp eller ned kontroll bad temperaturen på systemet. Mens systemet beskrevet her ikke ansette slik funksjon, er det mulig å chill fisken tank vann bad under romtemperatur gjennom et lavprisalternativ kjølesystem. Plasser en bøtte med vann i et lite kjøleskap og bruke en variabel hastighet for å pumpe vann fra kaldt vann bøtte til fisken tank og tilbake. Jo raskere pumping ofte, blir det kaldere fisken tank reservoaret.
Selv om alger dyrking systemet generelt gir konsistente resultater, er det noen viktige ting som bør vurderes. Først er vann siphoning som oppstår i tilfelle at lufting systemet opplever et plutselig tap av press (f.eks en blåst passende eller en luften kompressoren feil). Press i luftfukter vil presse luftfukter vann bakover gjennom slangen, inkludert gjennom rotameter. Installerer en oppstrøms felle eller tilbakestrømming tilbakeslagsventilen kan hjelpe. Merk at siphoning ikke innvirkning bioreaktorer seg fordi de opererer med lufttrykk. Rutinemessig inspeksjon av rør og fittings kan hjelpe lindre systemfeil. En annen viktig faktor er rutinemessig undersøke og erstatte luftfiltre og sjekke ventiler på bioreactors. Sørg for å følge produsentens anbefaling for antall autoklav sykluser tillatte. Dette er spesielt viktig hvis vedlikehold av axenic kulturer er avgjørende for eksperimentet. Til slutt, det anbefales å kjøpe eller bygge et autoclavable rack for trygg transport av bioreaktorer mellom vann bad, autoklav og biosikkerhet kabinett. En rustfritt stål wire rack kan tjene dette formålet.
Bioreactor systemet beskrevet her har flere begrensninger. En nøkkel begrensning er behovet for å håndtere reaktorene i et biosikkerhet skap med steril teknikk. Reaktorene mangler en anti-siphoning prøvetaking port, at brukeren må flytte reaktoren til en biosafety CAB utvalg uten forurensende kulturen. Reaktorene også kreve manuell pH lesing og justering som introduserer potensialet for menneskelige feil.
Bioreactor systemet beskrevet her fyller en nisje mellom enkel kolbe dyrking og fullt kontrollert bioreactors. Den bioreactor systemet ble utviklet som svar på behov for mer enhetlige resultater enn var oppnåelig med flasker. Dataene viser at dette systemet genererer konsekvent vekstresultater når drevet riktig. Merk at karbonisert flasker var ansatt i prosedyren for dyrking av alger lager, men dette ble gjort bare for å produsere inoculum for eksperimentet. Dette er akseptabelt fordi lager flasker ble samlet for vaksinering og dermed variasjon blant reaktorene er ikke et problem.
Som mange alger forskere er interessert i både vekst og nøytrale lipid innhold, har vi inkludert våre tilnærmingen til å måle begge parameterne her. Bruk av optisk densitet å måle vekst er vanlig praksis og er uten sidestykke i sin enkelhet. Imidlertid sammenhenger mellom tørr vekt og optisk densitet endres over tid og avhenger oppdrettsforholdene. Det anbefales å produsere en korrelasjon ligningen for hver eksperimentell behandling i hver eksperimentelle bunke. Dette er mulig i den foreslåtte prosedyren fordi fryse tørket alger oppnås etter hver kultur eksperiment. En avgjørende forutsetning av optisk densitet tilnærming er at korrelasjonen mellom optisk tetthet og tørr vekt holder konstant i løpet av kjørselen vekst. Så lenge avvik fra denne antakelsen er små, vil resultatet være rimelig nøyaktig. Den relative nøyaktigheten kan vurderes ved å sammenligne den beregnede alger tørrvekt konsentrasjonen ved tidspunkt null. Forutsatt kulturer var godt blandet og pipettering var nøyaktig, alle kulturer bør ha samme første inoculation tetthet. Optisk densitet tilnærming kan også bli utfordret når bakgrunnen absorbansen av mediet er høy (dvs. når du arbeider med visse wastewaters). Subtraksjon av middels absorbansen (før inokulasjon) fra hver OD lesing kan hjelpe med dette problemet.
Utvinning av lipider fra tørr alger følger de veletablerte Folch tilnærming21,24; Det finnes imidlertid viktige hensyn. Forskjellige alger arter har forskjellige cellevegger med varierende grad av seighet. Zirconia/silica perler brukt her er skarp og er utformet til å pierce sterke, polysakkarid cellevegger. En mykere perle type (f.eks glass) eller færre perle avbrudd sykluser kan brukes på alger med svakere cellevegger. En tommelfingerregel er imidlertid at den resulterende celle pellet etter utvinning bør være fri for pigment, som indikerer at alle klorofyll ble pakket ut. En av de vanligste feil under lipid utvinning trinnet skyldes uriktig fryser tørking. Hvis prøven smelter i fryse tørketrommel før det er helt tørr, blir resultatet meget hard, mørk, voksaktig pellets. Dette er resultatet av celler som lysed under vakuum forhold av fryse tørketrommel. Pellet kan veies for å få en tørr vekt, men den kan ikke brukes for lipid utvinning som voksaktig partiklene ikke bryte ned i Folch løsemiddel. For å sikre at Frysetørring alltid gir myk, pulveraktig prøver, er det viktig å fryse alle prøver-80 ° c og raskt overføre dem til fryse tørketrommel. Videre sikrer bruker parafilm (med et hull stakk det) ikke løsnet tube lokk at fuktighet kan kontinuerlig fjernes fra prøven før det thaws.
Nøytral lipid analysen beskrevet i denne fremgangsmåten er publisert tidligere, og inkluderer en drøfting av alternative lipid analyser22. Imidlertid er noen viktige forbedringer gjort for den prosedyren siden utgivelsen. Mest spesielt, ble Nilen rød løsning konsentrasjonen økt fra 0,5 µg/mL til 1 µg/mL. Effekten av denne endringen var høyere signal intensitet, forbedret repeterbarhet, og en eliminering av signal nedgang over tid i inkubasjonstiden. Resultatene viser at analysen sammenligner godt med resultater fra kvalitativ tynt lag kromatografi. Denne analysen er utviklet og godkjent bruker ulike arter av Chlorella og Auxenochlorella så brukbarheten til arter av betydelig ulike sammensetning ikke er fastslått. Alle grønt pigment bør fjernes helt fra analysen under blekemiddel incubation, fører til prøver som er klar eller blek gul. Merk også at lipid ekstrakter som degradert (som indikert av en endring fra grønn til brun farge) vanligvis ikke klarer å levere nøyaktige resultater i denne analysen. Det er derfor viktig å lagre lipid prøver uten høyere enn 20 ° C i mørket.
Metodene presentert her for dyrking alger, måle vekst og kvantifisere nøytral lipider er nyttig for en rekke tekniske programmer av alger, men er spesielt egnet for forskning på biodrivstoffproduksjon. Metodene blir også brukt til å studere alger vekst hemming wastewaters28 samt virkninger organisme interaksjon på vekst og sammensetningen av mikroalger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Støtte for denne forskningen ble levert av USDA National Institute of Food og landbruk Luke prosjektet ALA0HIGGINS og Auburn University kontorene til Prost, direktør for forskning og i Samuel Ginn College of Engineering. Støtte ble også levert av NSF gi CBET-1438211.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars - long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars - medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100x15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24x2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).
