Summary

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om te bouwen van lab-schaal zeepbel kolom photobioreactors en ze gebruiken om cultuur microalgen. Het biedt ook een methode voor de bepaling van de groeisnelheid van de cultuur en de neutrale vetgehalte.

Abstract

Er is aanzienlijke interesse in de studie van microalgen voor waterbouwkundige toepassingen zoals de productie van biobrandstoffen, hoogwaardige producten, en voor de behandeling van afval. Zoals de meeste nieuwe onderzoeksinspanningen op laboratoriumschaal beginnen, is er behoefte aan een kosteneffectieve methoden voor het kweken van microalgen op een reproduceerbare wijze. Hier, communiceren we een effectieve benadering van cultuur microalgen in laboratoriumschaal photobioreactors en de groei en de neutrale vetgehalte van die algen te meten. Instructies vindt u ook op het instellen van het photobioreactor-systeem. Hoewel de organismen voorbeeld soorten Chlorella en Auxenochlorella zijn, kan dit systeem worden aangepast om het kweken van een breed scala van microalgen, met inbegrip van co culturen van algen met niet-algen soorten. Stamculturen worden eerst gekweekt in flessen te produceren van entmateriaal voor het photobioreactor-systeem. Algen entmateriaal is geconcentreerd en overgedragen aan photobioreactors voor de teelt in de batchmodus. Monsters worden dagelijks verzameld voor de gemeten optische dichtheid. Aan het einde van de batch-cultuur, cellen worden geoogst door centrifuge, gewassen, en gedroogd tot een droge eindgewicht verwachte concentratie aan bevriezen. De droge eindgewicht concentratie wordt gebruikt voor het maken van een correlatie tussen de optische dichtheid en de concentratie van het drooggewicht. Een gemodificeerde Folch methode wordt vervolgens gebruikt om totale lipiden uittreksel uit de gevriesdroogde biomassa en het extract is vehiculumcontrolegroep haar neutrale vetgehalte met behulp van een microplate-assay. Deze bepaling heeft eerder gepubliceerd maar protocol stappen waren hier om te markeren van kritische stappen in de procedure waar fouten vaak voorkomen. Het systeem van de bioreactor hier beschreven vult een niche tussen eenvoudige kolf teelt en volledig gecontroleerde commerciële bioreactoren. Zelfs met slechts 3-4 biologische repliceert per behandeling, onze benadering van het kweken van algen leidt tot strakke standaarddeviaties in de groei en lipide testen.

Introduction

De toepassing van microalgen in engineering en biotechnologie heeft aangetrokken veel belangstelling in de afgelopen jaren. Microalgen worden bestudeerd voor gebruik in afvalwater behandeling,1,2,3,4, biobrandstof productie5,6,7,8, en de productie van nutraceuticals en andere hoogwaardige producten9,10. Algen zijn ook wordt genetisch gemodificeerde tegen grotere prijzen in een poging om hun geschiktheid voor specifieke technische toepassingen11,12te verbeteren. Er is dus grote belangstelling voor experimenten met industrieel relevante organismen in gecontroleerde instellingen. Het doel van deze methode is een doeltreffende benadering van cultuur microalgen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving communiceren en voor het meten van de groei en de neutrale vetgehalte van die algen. Verbetering van groei tarieven en neutrale vetgehalte van microalgen zijn geïdentificeerd als twee grote knelpunten richting van commercialisering van algen biobrandstoffen13.

Een breed scala van benaderingen zijn gebruikt om cultuur algen voor experimentele doeleinden. In het algemeen, kunnen deze benaderingen worden verdeeld tussen grootschalige outdoor teelt en kleinschalige binnen kweek. Outdoor teelt in photobioreactors en open vijvers is geschikt voor experimenten gericht op schaalvergroting van processen die reeds hebben bewezen op laboratoriumschaal (bijvoorbeeld voor het testen van schaal-up van een nieuwe hoge-lipide-stam van algen)14. Echter binnen kleinschalige teelt geschikt bij het ontwikkelen van nieuwe of verbeterde algen stammen is of het uitvoeren van experimenten gericht op het begrip biologische mechanismen. In deze laatste gevallen moet een hoge mate van experimentele controle plagen uit subtiele veranderingen in de biologische werking. Te dien einde zijn een culturen vaak nodig om te minimaliseren van de complexe biotische factoren die samenhangen met andere organismen (bijvoorbeeld bacteriën, en andere algen) die onvermijdelijk in grootschalige outdoor systemen groeien. Zelfs bij de studie van interacties tussen algen en andere organismen, die we hebben gevonden dat gebruik van hoogst-gecontroleerde experimentele omstandigheden nuttig is bij de behandeling van moleculaire uitwisseling tussen organismen15,16,17.

Binnen de categorie van kleinschalige indoor algen teelt en een aantal benaderingen zijn gebruikt. Misschien is de meest voorkomende benadering groeien algen in conische kolven op een shaker tafel onder een lichte bank18,19. Uitwisseling van zuurstof en CO2 vindt plaats door passieve diffusie door middel van een stekker schuim in de top van de kolf. Sommige onderzoekers hebben deze set-up via actieve beluchting van de kolven20verbeterd. Een andere aanpak is het kweken van algen in flessen, gemixt door roer bar en actieve beluchting. Ondanks hun eenvoud, hebben we vonden dat het gebruik van flacons en flessen vaak tot een inconsistente resultaten van biologische replicaat-organismen leidt. Vermoedelijk is dit te wijten aan de positie effecten – verschillende posities krijgen verschillende hoeveelheden van het licht, die ook van invloed op interne reactor temperaturen. Dagelijkse rotatie van reactoren naar nieuwe posities kan helpen, maar is niet het probleem verlichten omdat bepaalde fases van de groei van algen (bijvoorbeeld vroeg exponentiële) zijn gevoeliger voor positionele effecten dan anderen (bijvoorbeeld log fase).

Aan de andere kant van het spectrum van technologische geavanceerdheid zijn volledig gecontroleerde commerciële photobioreactors. Deze systemen voortdurend controleren en aanpassen van de omstandigheden in de reactor voor het optimaliseren van de groei van algen. Ze hebben programmeerbare verlichting, real-time temperatuurregeling en pH-control. Helaas, ze zijn duur en typisch kosten duizenden dollars per reactor. Meest wetenschappelijke en technische tijdschriften vereisen biologische replicatie van resultaten, waardoor de aankoop van meerdere bioreactoren. Wij presenteren hier een zeepbel kolom reactor systeem dat de kloof tussen de eenvoudige (kolf) en geavanceerde (volledig gecontroleerde bioreactor) benaderingen voor lab-schaal algen teelt bruggen. Bubble kolommen kunnen stijgende gasbellen gas uitwisseling en meng de reactor. Deze aanpak biedt een zekere mate van controle over de verlichting en de temperatuur, maar doet dit op een manier die rendabel. Bovendien hebben we gevonden dit systeem zeer consistente resultaten van biologische replicaat-organismen, vermindering van het vereiste aantal biologische replicatieonderzoeken noodzakelijk zijn voor het verkrijgen van statistisch significante resultaten in vergelijking met de kolf of fles aanpak. Ook hebben we dit systeem gebruikt te kweken mengsels van algen en bacteriën21. Naast de teelt van algen schetsen we een procedure voor het meten van de neutrale vetgehalte in de gekweekte algen. De laatste methode is gepubliceerd elders22, maar ook hier de procedure om te bieden stapsgewijze instructies voor het met succes gebruiken.

Protocol

1. installatie van Bubble kolom Photobioreactors Bouw van een aantal ontlucht deksels van de kunststof deksels die kwam met de 1 L glazen flessen en kruising buizen (Zie Figuur 1 voor schema en foto’s). Deksels voor de luchtbevochtiger, mengen elke fles reactor, val en elke air lift photobioreactor te bouwen. Boorgaten ¼” in het deksel: 2 gaten zijn nodig voor bioreactor en luchtbevochtiger deksels; 3 gaatjes zijn nodig voor de mengen val. Slip een ¼” O-ring ov…

Representative Results

Deze procedure levert een tijdsverloop van algen optische dichtheid gegevens bij OD 550 nm (figuur 4A). De optische dichtheid en het droge gewicht concentratie gegevens kunnen worden gecorreleerd (figuur 4B). Dit wordt bereikt door de eerste berekening van de concentratie van de algen droge eindgewicht na de freeze-drying stap. Vervolgens kan de optische dichtheid van de cultuur seriële verdunning (uitgevoerd op de laatste dag v…

Discussion

De belangrijkste overweging bij het kweken van algen is een goed begrip van de specifieke behoeften van het organisme of groep van organismen. De algen Cultuurstelsel hier beschreven kan worden gebruikt om de cultuur van een breed scala van algen, maar de specifieke abiotische factoren (temperatuur, media, pH, licht intensiteit, CO2 -niveau, beluchting tarief) moeten worden aangepast aan de behoeften van het organisme. Opmerking de hier beschreven parameters werden gebruikt voor de teelt van Chlorella

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Steun voor dit onderzoek werd verzorgd door USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw Hatch Project ALA0HIGGINS en de Auburn University kantoren van de rector, de Vice President voor onderzoek en de Samuel Ginn College of Engineering. Ook werd de steun verleend door NSF verlenen CBET-1438211.

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35×300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24×2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

References

  1. Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
  2. Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
  3. Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
  4. Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
  5. Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
  6. Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
  7. Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae–A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
  8. Branyikova, I., et al. Microalgae – Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
  9. Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
  10. Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
  11. Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
  12. Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
  13. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  14. Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
  15. Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
  16. Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
  17. Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
  18. Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
  19. Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
  20. Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
  21. Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
  22. Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
  23. Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
  26. Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochemistry. , 578-730 (2012).
  27. de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -. P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
  28. Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. . Annual International Meeting of the ASABE. , (2018).

Play Video

Cite This Article
Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

View Video