Här presenterar vi ett protokoll för att konstruera lab-skala bubbla kolumn photobioreactors och använda dem till kultur mikroalger. Det ger också en metod för bestämning av kultur tillväxttakt och neutrala fettinnehållet.
Det finns betydande intresse i studien av mikroalger för tekniska applikationer såsom produktion av biobränslen, produkter med högt värde, och för behandling av avfall. Som de flesta nya forskningsinsatser börjar på laboratorieskala, finns det ett behov av kostnadseffektiva metoder för att odla mikroalger i ett reproducerbart sätt. Här, kommunicerar vi en effektiv strategi för kultur mikroalger i laboratorieskala photobioreactors och att mäta tillväxt och neutrala fettinnehållet i de algerna. Instruktioner finns också på hur du ställer in photobioreactor systemet. Även om exempel organismerna är arter av Chlorella och Auxenochlorella, kan detta system anpassas för att odla ett brett utbud av mikroalger, inklusive samtidig kulturer av alger med icke-alger arter. Beståndet kulturer odlas först i flaskor att producera inokulum för photobioreactor system. Alger inokulum är koncentrerad och överförs till photobioreactors för odling i batch-läge. Prover tas dagligen för Absorbansavläsningar. I slutet av batch kultur, celler skördas av centrifug, tvättas, och frysa torkade att erhålla en slutlig torrvikt koncentration. Den slutliga torrvikt koncentrationen används för att skapa ett samband mellan den optiska densiteten och torrvikt koncentrationen. En modifierad Folch metod används därefter att extrahera sammanlagda mängden lipider från den frystorkade biomassan och extraktet har analyserats för dess neutrala fetthalten med en mikroplattan-analys. Denna analys har publicerats tidigare men protokollstegen ingick här Markera kritiska steg i förfarandet där fel inträffar ofta. Bioreaktor systemet beskrivs här fyller en nisch mellan enkel kolv odling och fullt kontrollerade kommersiella bioreaktorer. Även med bara 3-4 biologiska replikerar per behandling, vår metod för att odla alger leder till snäva standardavvikelser i tillväxt och lipid analyserna.
Tillämpningen av mikroalger i teknik och bioteknik har rönt stort intresse under de senaste åren. Mikroalger studeras för användning i avloppsvatten behandling1,2,3,4, biobränsle produktion5,6,7,8, och produktion av nutraceuticals och andra värdefulla produkter9,10. Alger är också att vara genetiskt modifierade på större priser i ett försök att förbättra deras lämplighet för särskilda engineering program11,12. Följaktligen finns det stort intresse för experiment med industriellt relevanta organismer i kontrollerade miljöer. Syftet med denna metod är att kommunicera en effektiv strategi för kultur mikroalger i kontrollerad laboratoriemiljö och att mäta tillväxt och neutrala fettinnehållet i de algerna. Att förbättra tillväxten priser och neutrala fettinnehållet i mikroalger har identifierats som två viktiga flaskhalsar mot kommersialisering av alger biobränslen13.
En rad olika metoder har använts för att kultur alger i experimentsyfte. Dessa strategier kan i allmänhet delas mellan storskalig utomhus odling och småskalig inomhus odling. Utomhus odling i photobioreactors och öppna dammar är lämplig för experiment som syftar till att skala upp processer som har redan visat på laboratorieskala (t.ex. att testa skala upp av en ny hög-lipid stam av alger)14. Men inomhus småskalig odling är lämpligt när du utvecklar nya eller förbättrade alger stammar eller utföra experiment som syftar till att förstå biologiska mekanismer. I dessa senare fall krävs en hög grad av experimentell kontroll att locka fram subtila förändringar i biologiska beteende. Därför krävs ofta axenic kulturer för att minimera de komplexa biotiska faktorer som förknippas med andra organismer (t.ex. bakterier, andra alger) som oundvikligen växer i stora utomhus-system. Även när man studerar interaktionen mellan alger och andra organismer, har vi funnit att användningen av mycket-kontrollerade försöksbetingelser är till hjälp när man undersöker molekylära utbyte mellan organismer15,16,17.
Inom kategorin småskaliga inomhus Algodling, en uppsättning strategier har använts. Kanske är den vanligaste metoden att odla alger i Erlenmeyer-kolvar på ett skakbord under en ljus bank18,19. Utbytet av syre och CO2 sker genom passiv diffusion genom en skum plugg i toppen av kolven. Vissa forskare har förbättrat detta upplägg genom aktiv luftning av kolvar20. En annan metod är att odla alger i flaskor, mixad av uppståndelse bar och aktiv luftning. Trots sin enkelhet, har vi funnit att användningen av kolvar och flaskor ofta leder till inkonsekventa resultat bland biologiska replikat. Förmodligen detta är på grund av position effekter – olika positioner får olika mängder av ljus, vilket även påverkar interna reaktorn temperaturer. Dagliga rotation av reaktorer till nya positioner kan hjälpa men inte lindra problemet eftersom vissa stadier av alger tillväxt (t.ex. tidigt exponentiell) är mer känsliga för positionella effekter än andra (t.ex. log fas).
På motsatta sidan av spektrumet av teknisk finess är fullt kontrollerade kommersiella photobioreactors. Dessa system kontinuerligt övervaka och justera villkoren i reaktorn att optimera algtillväxt. De har programmerbar belysning, realtid temperaturkontroll och pH-kontroll. Tyvärr, de är dyra och vanligtvis kosta flera tusen dollar per reaktor. Den vetenskapliga och tekniska tidskrifter kräver biologiska replikering av resultat, vilket kräver inköp av flera bioreaktorer. Vi presenterar här en bubbla reaktorn pelarsystem som överbryggar klyftan mellan det enkla (kolv) och sofistikerade (fullt kontrollerade bioreaktor) närmar sig för lab-skala alger odling. Bubbla kolumner Använd stigande gasbubblor att underlätta gasutbyte och blanda reaktorn. Detta tillvägagångssätt ger en viss kontroll över belysning och temperatur men gör det på ett sätt som är kostnadseffektivt. Dessutom har vi funnit detta system att ge konsekvent resultat bland biologiska replikat, minska antalet krävs för biologiska replikat som krävs för att få statistiskt signifikanta resultat jämfört med metoden kolv eller flaska. Vi har också använt detta system att framgångsrikt odla blandningar av alger och bakterier21. Utöver Algodling beskriva vi ett förfarande för att mäta den neutrala fetthalten i de odlade algerna. Den senare metoden har varit publicerad någon annanstans22, men vi inkludera den här proceduren för att ge anvisningar för hur man använder det framgångsrikt.
Viktigaste när odla alger är en förståelse för de särskilda behoven hos den organism eller grupp av organismer. Alger odling systemet beskrivs här kan användas till kultur ett brett utbud av alger men de särskilda abiotiska faktorerna (temperatur, media, pH, ljusintensitet, CO2 -nivå, luftning rate) måste anpassas till behoven hos organismen. Observera de parametrar som beskrivs här användes för odling av Chlorella och Auxenochlorella. Dessa organismer är av industriellt intres…
The authors have nothing to disclose.
Stöd för denna forskning lämnades av USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk Hatch projektet ALA0HIGGINS och Auburn University kontor profossen, Vice President för forskning och i Samuel Ginn College of Engineering. Stöd gavs också av NSF bevilja CBET-1438211.
Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
Check valves | VWR | 89094-714 | |
Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
Light timer | Walmart | 556393626 | |
Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
Supplies and reagents for culturing algae | |||
0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
Equipment | |||
Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
Vortex mixer | VWR | 10153-838 |