Vi præsenterer her, en protokol for at konstruere lab-skala boble kolonne photobioreactors og bruge dem til kultur mikroalger. Det giver også en metode til bestemmelse af kultur vækstrate og neutral lipid indhold.
Der er betydelig interesse for studiet af mikroalger til engineering applikationer såsom fremstilling af biobrændsel, højværdiprodukter, og til behandling af affald. Som de fleste nye forskningsindsats begynder på laboratoriet skala, er der behov for omkostningseffektive metoder til dyrkning mikroalger på en reproducerbar måde. Her, kommunikerer vi en effektiv tilgang til kultur mikroalger i laboratoriet-skala photobioreactors, og at måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Vejledningen er også medtaget på hvordan man opsætter photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismer er arter af Chlorella og Auxenochlorella, kan dette system tilpasses for at dyrke en bred vifte af mikroalger, herunder Co kulturer af alger med ikke-alger. Stock kulturer dyrkes først i flasker til at producere inokulum for photobioreactor system. Alger inokulum er koncentreret og overført til photobioreactors til dyrkning i batch-mode. Prøver indsamles dagligt for absorbansaflæsningerne. For enden af batch kultur celler er høstet af centrifuge, vasket, og fryse tørrede at opnå en endelig tørvægt koncentration. Den endelige tørvægt koncentration bruges til at skabe en sammenhæng mellem den optiske tæthed og tørvægt koncentration. En modificeret Folch metode bruges efterfølgende til at udtrække samlede indhold af lipider fra den frysetørrede biomasse og ekstraktet er analyseret for sin neutrale lipid indhold ved hjælp af en mikrotiterplade assay. Denne analyse har været offentliggjort tidligere, men protokollen trin indgik her for at fremhæve vigtige trin i den procedure, hvor der ofte opstår fejl. Den bioreaktor system beskrevet her udfylder en niche mellem simple kolbe dyrkning og fuldt kontrolleret kommercielle bioreaktorer. Selv med kun 3-4 biologiske replikater per behandling, vores tilgang til dyrkning af alger fører til stramme standardafvigelser i vækst og lipid-assays.
Anvendelsen af mikroalger i ingeniør- og bioteknologi har tiltrukket sig stor interesse i de seneste år. Mikroalger er undersøgt til brug i spildevand behandling1,2,3,4, biobrændstof produktion5,6,7,8, og den produktion af nutraceuticals og andre høje værdi produkter9,10. Alger er også er genetisk modificerede til højere priser i et forsøg på at forbedre deres egnethed til specifikke tekniske applikationer11,12. Der er derfor stor interesse i eksperimenter med industrielt relevante organismer i kontrolleret indstillinger. Formålet med denne metode er at kommunikere en effektiv tilgang til kultur mikroalger i et kontrolleret laboratoriemiljø og måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Forbedre vækst priser og neutral lipid indhold af mikroalger er blevet identificeret som to centrale flaskehalse mod kommercialisering af alger biobrændstoffer13.
En bred vifte af tilgange har været brugt til kultur alger til forsøgsformål. Generelt er kan disse tilgange opdeles mellem store udendørs dyrkningen og små indendørs dyrkning. Udendørs dyrkningen i photobioreactors og åben damme er egnet til eksperimenter med henblik på optrapning af processer, der allerede er blevet påvist i laboratoriet målestok (f.eks., at teste skala-up af en ny high-lipid stamme af alger)14. Dog, indendørs små dyrkning er relevant ved udviklingen af nye eller forbedrede alger stammer eller udføre eksperimenter til formål at forstå biologiske mekanismer. I disse sidstnævnte tilfælde kræves en høj grad af eksperimentelle kontrol at drille subtile ændringer i biologiske opførsel. Med henblik herpå, er axenic kulturer ofte nødvendige for at minimere de komplekse biotiske faktorer i forbindelse med andre organismer (fx bakterier og andre alger), der uundgåeligt vokser i store udendørs systemer. Selv når man studerer interaktioner blandt alger og andre organismer, har vi fundet, at brug af stærkt kontrollerede forsøgsbetingelser er nyttigt, når undersøge molekylære udveksling mellem organismer15,16,17.
Inden for kategorien af mindre indendørs alger dyrkning, har været brugt en vifte af tilgange. Måske er den mest almindelige metode at dyrke alger i Erlenmeyerkolben kolber på en shakerbord under en lys bank18,19. Udvekslingen af ilt og CO2 finder sted ved passiv diffusion gennem en skum prop i toppen af kolben. Nogle forskere har forbedret dette set-up gennem aktive beluftning af kolberne20. En anden metode er at dyrke alger i flasker, mixet af rør bar og aktive beluftning. Trods deres enkelhed, har vi fundet, at brug af flasker og flasker ofte fører til inkonsistente resultater blandt biologiske replikater. Formentlig skyldes holdning effekter – forskellige positioner modtager forskellige mængder af lys, som også berører intern reaktor temperaturer. Daglige rotation af reaktorer til nye stillinger kan hjælpe, men ikke afhjælpe problemet, fordi visse faser af algevækst (fx tidligt eksponentiel) er mere følsomme over for positionelle effekter end andre (fx log fase).
På den modsatte side af spektret af teknologisk sofistikerede er fuldt kontrolleret kommercielle photobioreactors. Disse systemer løbende overvåge og justere forholdene i reaktoren til at optimere algevækst. De programmerbare lys, real-time temperaturkontrol og pH kontrol. Desværre, de er dyre og koster typisk flere tusinde dollars pr. reaktor. Mest videnskabelige og tekniske tidsskrifter kræver biologiske replikering af resultater, hvilket kræver køb af flere bioreaktorer. Vi præsenterer her en boble kolonne reaktor system at broer kløft mellem simple (kolbe) og sofistikerede (fuldt kontrolleret bioreaktor) tilgange til lab-skala alger dyrkning. Boble kolonner bruger stigende gasbobler til at lette gasudveksling og bland reaktoren. Denne fremgangsmåde giver en vis grad af styring af belysning og temperatur men gør det på en måde, der er omkostningseffektive. Desuden har vi fundet dette system til at give meget ensartede resultater blandt biologiske replikater, at reducere det nødvendige antal biologiske replikater nødvendige for at opnå statistisk signifikante resultater i forhold til metoden kolbe eller flaske. Vi har også brugt dette system med succes dyrker blandinger af alger og bakterier21. Foruden alger dyrkning skitsere vi en procedure til måling af neutrale lipid indhold i de dyrkede alger. Sidstnævnte metode har været offentliggjort andetsteds22, men vi omfatter proceduren her for at give en trinvis vejledning til, hvordan du anvender det med succes.
Den vigtigste overvejelse ved dyrkning af alger er en forståelse af de specifikke behov i organismen eller gruppe af organismer. Algerne dyrkning system beskrevet her kan bruges til kultur en bred vifte af alger, men de specifikke abiotiske faktorer (temperatur, medier, pH, lysintensitet, CO2 niveau, beluftning sats) skal tilpasses til behovene, som skadegøreren. Bemærk de parametre, der beskrives her blev anvendt til dyrkning af Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismer er af industr…
The authors have nothing to disclose.
Support af denne forskning blev leveret af USDA National Institute for fødevarer og landbrug Hatch projekt ALA0HIGGINS og Auburn University kontorer i Provst, Vice President for forskning og af Samuel Ginn College of Engineering. Støtte blev også leveret fra NSF give CBET-1438211.
Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
Check valves | VWR | 89094-714 | |
Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
Light timer | Walmart | 556393626 | |
Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
Supplies and reagents for culturing algae | |||
0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
Equipment | |||
Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
Vortex mixer | VWR | 10153-838 |