Summary
Hier presenteren we een protocol om te bouwen van lab-schaal zeepbel kolom photobioreactors en ze gebruiken om cultuur microalgen. Het biedt ook een methode voor de bepaling van de groeisnelheid van de cultuur en de neutrale vetgehalte.
Abstract
Er is aanzienlijke interesse in de studie van microalgen voor waterbouwkundige toepassingen zoals de productie van biobrandstoffen, hoogwaardige producten, en voor de behandeling van afval. Zoals de meeste nieuwe onderzoeksinspanningen op laboratoriumschaal beginnen, is er behoefte aan een kosteneffectieve methoden voor het kweken van microalgen op een reproduceerbare wijze. Hier, communiceren we een effectieve benadering van cultuur microalgen in laboratoriumschaal photobioreactors en de groei en de neutrale vetgehalte van die algen te meten. Instructies vindt u ook op het instellen van het photobioreactor-systeem. Hoewel de organismen voorbeeld soorten Chlorella en Auxenochlorella zijn, kan dit systeem worden aangepast om het kweken van een breed scala van microalgen, met inbegrip van co culturen van algen met niet-algen soorten. Stamculturen worden eerst gekweekt in flessen te produceren van entmateriaal voor het photobioreactor-systeem. Algen entmateriaal is geconcentreerd en overgedragen aan photobioreactors voor de teelt in de batchmodus. Monsters worden dagelijks verzameld voor de gemeten optische dichtheid. Aan het einde van de batch-cultuur, cellen worden geoogst door centrifuge, gewassen, en gedroogd tot een droge eindgewicht verwachte concentratie aan bevriezen. De droge eindgewicht concentratie wordt gebruikt voor het maken van een correlatie tussen de optische dichtheid en de concentratie van het drooggewicht. Een gemodificeerde Folch methode wordt vervolgens gebruikt om totale lipiden uittreksel uit de gevriesdroogde biomassa en het extract is vehiculumcontrolegroep haar neutrale vetgehalte met behulp van een microplate-assay. Deze bepaling heeft eerder gepubliceerd maar protocol stappen waren hier om te markeren van kritische stappen in de procedure waar fouten vaak voorkomen. Het systeem van de bioreactor hier beschreven vult een niche tussen eenvoudige kolf teelt en volledig gecontroleerde commerciële bioreactoren. Zelfs met slechts 3-4 biologische repliceert per behandeling, onze benadering van het kweken van algen leidt tot strakke standaarddeviaties in de groei en lipide testen.
Introduction
De toepassing van microalgen in engineering en biotechnologie heeft aangetrokken veel belangstelling in de afgelopen jaren. Microalgen worden bestudeerd voor gebruik in afvalwater behandeling,1,2,3,4, biobrandstof productie5,6,7,8, en de productie van nutraceuticals en andere hoogwaardige producten9,10. Algen zijn ook wordt genetisch gemodificeerde tegen grotere prijzen in een poging om hun geschiktheid voor specifieke technische toepassingen11,12te verbeteren. Er is dus grote belangstelling voor experimenten met industrieel relevante organismen in gecontroleerde instellingen. Het doel van deze methode is een doeltreffende benadering van cultuur microalgen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving communiceren en voor het meten van de groei en de neutrale vetgehalte van die algen. Verbetering van groei tarieven en neutrale vetgehalte van microalgen zijn geïdentificeerd als twee grote knelpunten richting van commercialisering van algen biobrandstoffen13.
Een breed scala van benaderingen zijn gebruikt om cultuur algen voor experimentele doeleinden. In het algemeen, kunnen deze benaderingen worden verdeeld tussen grootschalige outdoor teelt en kleinschalige binnen kweek. Outdoor teelt in photobioreactors en open vijvers is geschikt voor experimenten gericht op schaalvergroting van processen die reeds hebben bewezen op laboratoriumschaal (bijvoorbeeld voor het testen van schaal-up van een nieuwe hoge-lipide-stam van algen)14. Echter binnen kleinschalige teelt geschikt bij het ontwikkelen van nieuwe of verbeterde algen stammen is of het uitvoeren van experimenten gericht op het begrip biologische mechanismen. In deze laatste gevallen moet een hoge mate van experimentele controle plagen uit subtiele veranderingen in de biologische werking. Te dien einde zijn een culturen vaak nodig om te minimaliseren van de complexe biotische factoren die samenhangen met andere organismen (bijvoorbeeld bacteriën, en andere algen) die onvermijdelijk in grootschalige outdoor systemen groeien. Zelfs bij de studie van interacties tussen algen en andere organismen, die we hebben gevonden dat gebruik van hoogst-gecontroleerde experimentele omstandigheden nuttig is bij de behandeling van moleculaire uitwisseling tussen organismen15,16,17.
Binnen de categorie van kleinschalige indoor algen teelt en een aantal benaderingen zijn gebruikt. Misschien is de meest voorkomende benadering groeien algen in conische kolven op een shaker tafel onder een lichte bank18,19. Uitwisseling van zuurstof en CO2 vindt plaats door passieve diffusie door middel van een stekker schuim in de top van de kolf. Sommige onderzoekers hebben deze set-up via actieve beluchting van de kolven20verbeterd. Een andere aanpak is het kweken van algen in flessen, gemixt door roer bar en actieve beluchting. Ondanks hun eenvoud, hebben we vonden dat het gebruik van flacons en flessen vaak tot een inconsistente resultaten van biologische replicaat-organismen leidt. Vermoedelijk is dit te wijten aan de positie effecten - verschillende posities krijgen verschillende hoeveelheden van het licht, die ook van invloed op interne reactor temperaturen. Dagelijkse rotatie van reactoren naar nieuwe posities kan helpen, maar is niet het probleem verlichten omdat bepaalde fases van de groei van algen (bijvoorbeeld vroeg exponentiële) zijn gevoeliger voor positionele effecten dan anderen (bijvoorbeeld log fase).
Aan de andere kant van het spectrum van technologische geavanceerdheid zijn volledig gecontroleerde commerciële photobioreactors. Deze systemen voortdurend controleren en aanpassen van de omstandigheden in de reactor voor het optimaliseren van de groei van algen. Ze hebben programmeerbare verlichting, real-time temperatuurregeling en pH-control. Helaas, ze zijn duur en typisch kosten duizenden dollars per reactor. Meest wetenschappelijke en technische tijdschriften vereisen biologische replicatie van resultaten, waardoor de aankoop van meerdere bioreactoren. Wij presenteren hier een zeepbel kolom reactor systeem dat de kloof tussen de eenvoudige (kolf) en geavanceerde (volledig gecontroleerde bioreactor) benaderingen voor lab-schaal algen teelt bruggen. Bubble kolommen kunnen stijgende gasbellen gas uitwisseling en meng de reactor. Deze aanpak biedt een zekere mate van controle over de verlichting en de temperatuur, maar doet dit op een manier die rendabel. Bovendien hebben we gevonden dit systeem zeer consistente resultaten van biologische replicaat-organismen, vermindering van het vereiste aantal biologische replicatieonderzoeken noodzakelijk zijn voor het verkrijgen van statistisch significante resultaten in vergelijking met de kolf of fles aanpak. Ook hebben we dit systeem gebruikt te kweken mengsels van algen en bacteriën21. Naast de teelt van algen schetsen we een procedure voor het meten van de neutrale vetgehalte in de gekweekte algen. De laatste methode is gepubliceerd elders22, maar ook hier de procedure om te bieden stapsgewijze instructies voor het met succes gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. installatie van Bubble kolom Photobioreactors
- Bouw van een aantal ontlucht deksels van de kunststof deksels die kwam met de 1 L glazen flessen en kruising buizen (Zie Figuur 1 voor schema en foto's). Deksels voor de luchtbevochtiger, mengen elke fles reactor, val en elke air lift photobioreactor te bouwen.
- Boorgaten ¼" in het deksel: 2 gaten zijn nodig voor bioreactor en luchtbevochtiger deksels; 3 gaatjes zijn nodig voor de mengen val.
- Slip een ¼" O-ring over de draden van een 1/8" panel mount Luer montage en schuif deze in de ¼" gat geboord in het deksel (figuur 1A).
- Slip een tweede ¼" O-ring over de draden zodat het deksel is ingeklemd tussen de twee O-ringen. Glijden van een tegenmoer op de draden en draai om op te lossen van het panel mount Luer in plaats.
- Magnetisch slot ringen op de blootgestelde mannelijke Luer projecteren vanuit het deksel. Herhaal de stappen 1.1.2-1.1.4 voor elk gat in het deksel.
- Voor deksels die zal worden gebruikt op bubble kolom en fles reactoren, hechten 1/8" vrouwelijke Luer aan barb hulpstukken aan 1.5" stukken van 1/8" ID PVC buis. Bevestig deze aan elk van de blootgestelde mannelijke Luer-armaturen op de deksel.
- Een terugslagklep (wijzend uit de buurt van de deksel) verbinden met het vrije uiteinde van één van de 1/8" stukken.
Opmerking: Dit zal dienen als de poort van de uitlaat voor de bioreactor. - Een mannelijke Luer verbinden met Weerhaak passend om het tweede stuk van 1/8" slang projecteren vanuit het deksel. Vastklikken van de roterende lock ring en zet een 0,2 mm luchtfilter daartoe vast.
Opmerking: Dit zal dienen als de perszijde van de reactor.
Figuur 1. Schema en foto's voor de bouw van de bioreactoren. (A) Schematische voor de bouw van de bioreactor deksels (B) foto van het geassembleerde bioreactor deksel, en (C) foto van het geassembleerde deksel, gebruikt voor de luchtbevochtiger. Merk op dat de luchtbevochtiger-hulpstukken moeten worden gecoat in waterdichte siliconen om een luchtdichte zegel met het deksel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Monteren van het uitvoeringssysteem lucht (Zie figuur 2A en 2B voor een schema en de foto).
- 1/8" NPT draad aan barb hulpstukken aan de inhammen en de afzetmogelijkheden op de achterkant van elke rotameter koppelen.
Opmerking: 200-2.500 cm3/min rotameters zijn voor lucht druk modulatie stroomopwaarts van de luchtbevochtiger, 100 en 1000 cm3/min rotameters zijn voor fles reactoren, 50-500 cm3/min rotameters zijn voor air lift bioreactoren en 5-50 cm3/ min rotemeters zijn voor CO2 stroom verordening. Het is aanbevolen om mount rotameters op een vast oppervlak (bijvoorbeeld plastic folie) zodat ze niet tijdens operatie vallen. - De compressor is uitgeschakeld, dan ¼" ID flexibel PVC buizen verbinden met de bron van samengeperste lucht met een slangklem. De slang diameter aftreden op 1/8" ID PVC flexibele buis met behulp van een ¼" vrouwelijke barb montage en een 1/8" mannelijke barb montage.
- Sluit het vrije uiteinde van de buis 1/8"-ID aan de inlaat van een 200-2.500 cm3/min rotameter.
Opmerking: De uitlaat van deze rotameter zal voeden de luchtbevochtiger fles via ID buis 1/8". - Sluit de 1/8" slang aan een inham aan een geventileerde deksel (gebruik een vrouwelijke Luer aan barb passend om de verbinding te maken). Sluit een tweede bagagestuk van 1/8" slang aan de binnenkant van het panel mount passend.
Opmerking: Dit stuk zal hangen naar beneden in de luchtbevochtiger en Bel air door het water. - Hechten 1/8" vrouwelijke Luer barb fittingen aan beide uiteinden van een stuk van 1/8" ID buis en gebruiken van dit stuk de uitlaat van de luchtbevochtiger verbinden met de inlaat van de mengen val.
- Op dezelfde wijze als 1.2.5, door de uitlaat van de CO2 -regulator te verbinden door een tweede poort op de mengen val.
- Bouwen van een variëteit met 1/8" slang en 1/8" meerpoortige barb (Zie Figuur 2 C) lucht worden meegenomen bij de rotameter banken.
Opmerking: Deze rotameters zal worden gebruikt voor de levering van de bioreactoren. Vermijd bouw van meer dan 6 rotameters in serie. In plaats daarvan gebruik parallelle banken van rotameters uit te breiden van het systeem. Zorgen dat de vraag van de totale stroom voor alle reactoren minder dan 2500 cm3/min is (of anders een grotere rotameter nodig zullen zijn voor de luchtbevochtiger). - De uitlaat (3rd poort) van de mengen val sluit aan op de nieuw gebouwde rotameter banken met behulp van 1/8" buizen en een 1/8" female naar barb Luer.
- Sluit van voldoende lange 1/8" slang aan de outlets van elke rotameter in de rotameter bank voor de levering van de lucht naar de bioreactoren. Label de uiteinden van de buis, alsmede de rotameters in de bank.
- Toepassing waterdichte siliconen rond alle havens op de luchtbevochtiger en mengen van Val deksels om ervoor te zorgen dat ze worden luchtdicht.
- 1/8" NPT draad aan barb hulpstukken aan de inhammen en de afzetmogelijkheden op de achterkant van elke rotameter koppelen.
Figuur 2. Schema en foto's voor het samenstellen van de zeepbel kolom systeem. (A) Schematische voorstelling van de beluchting systeem (B) foto van de luchtbevochtiger, mengen van de val, en rotameter bank, en (C) foto van de variëteiten gebruikt de rotameter banken om elkaar te verbinden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Instellen van aquaria, roer platen en licht (Figuur 3).
Let op: Dit systeem vereist een groot aantal verkooppunten en voldoende circuit capaciteit ter ondersteuning van alle onderdelen. Vermijd rijgen samen meerdere stekkerdozen en verlengkabels in een serieschakeling mode want dit een elektrische gevaren is. Gebruik van GFI type verkooppunten en stekkerdozen wordt sterk aangemoedigd als gevolg van de aanwezigheid van water in het systeem.- Regelen van de laag-profiel Magneetroerders op een vlak oppervlak dat sterk genoeg is om te houden van het gewicht van water gevulde aquaria.
- Kleine houten of plastic blokken plaats (die iets groter dan de platen van de roer) rond de omtrek van de roer platen ter ondersteuning van het gewicht van de vissentanks.
Let op: Vermijd plaatsen de vissentanks rechtstreeks op de platen van de roer als het gewicht hen verpletteren zal. - Plaats de vissentanks over de roer-platen en blokken ondersteuning en de tanks met water vullen.
- Knip een stukje van een stijve kunststof blad om te passen op de top van de vissentank zoals een deksel. Gaten in deze dekking te glijden in en uit de kruising buizen snijden. Ook een gat voor de vis tankverwarming.
- Schik de fluorescerende licht banken naast de vissentank om horizontale verlichtingssterkte van de bioreactoren. Steek de lichte bank in een lichte timer instellen van een dag/nacht-cyclus.
Figuur 3. Systeem schema voor de fles bioreactoren (links) en de photobioreactors van de kolom van de zeepbel (rechts). Dit cijfer is gewijzigd van Higgins et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. voorbereiding van microalgen entmateriaal
- Microalgen entmateriaal verkrijgen bij een cryo-bewaard, vergulde of vloeibare cultuur.
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat cryopreserved organismen worden verguld vóór het gebruik als entmateriaal om ervoor te zorgen dat cellen levensvatbaar zijn en dat de resulterende cultuur een is. Agar medium (bv., ATCC #5 Sporulerende agar)21 is een rijk medium dat werkt goed voor de heropleving van de soorten Chlorella en Auxenochlorella uit cryo-opslag. - 2.4 L anorganisch medium die geschikt is voor de soorten met name microalgen voor te bereiden.
Opmerking: Voorbeelden zijn N8 middellange23 voor soorten Chlorella, N8-NH4 middelgrote21 voor soorten Auxenochlorella. Gebruik van een medium geschikt is voor de algen stam is een van de belangrijkste stappen op weg naar robuuste algengroei waarborgen. - Aliquoot 2.4 L anorganisch medium even in drie 1 L glazen flessen, toevoegen roer bars tot elke fles en monteren van de geventileerde deksels (Figuur 1) voor elke fles. Dubbel te controleren dat de beluchting-buis aan de inlaat kant en elke fles is heeft een roer-bar in.
- Autoclaaf de voorraad flessen met behulp van een vloeibare sterilisatie cyclus (121 ° C) voor 30 min. autoclaaf 100 mL gedeïoniseerd water (dH2van O) en sommige 1,5 mL buizen op hetzelfde moment, die later zal worden gebruikt voor de beplating. Toestaan dat de middellange-tot koel 's nachts. Anderzijds de reactor tot kamertemperatuur afkoelen en vervolgens gedurende 2 uur voorafgaand aan de inoculatie beluchten.
- Inoculeer microalgen uit een plaat of een vloeibare cultuur in de voorraad flessen in een bioveiligheid kabinet (BSC). Steriele techniek gebruiken om een culturen in de volgende stappen.
- Voeg 20 mL gesteriliseerde met autoclaaf dH2O naar een centrifugebuis steriele 50 mL. Gebruik een steriele wegwerp 10 µL-lus om te kiezen van verschillende enkele kolonies van de plaat uit stap 2.1. Dompel de lus in de tube van 50 mL en wassen van de algen-cellen in de 20 mL van gesteriliseerde met autoclaaf dH2O. Shake de tube 50 mL om een homogene microalgen oplossing te maken.
- Pipetteer van microalgen 6 mL in elke voorraad fles met een steriele serologische pipet 10 mL. Swirl de fles mixen van de microalgen gelijkmatig in het medium.
- Gebruik een 2 mL steriele serologische pipet te trekken 1 mL monsters uit elke voorraad fles en overdracht in steriele 1,5 mL buizen.
Opmerking: Micropipetten worden niet aanbevolen voor deze stap als gevolg van het risico van besmetting. Draai de geventileerde deksels op voorraad flessen. - Plaats van de voorraad flessen op roer platen (~ 150 rpm) en aanpassen van lucht debiet, CO2en verlichting niveau, afhankelijk van de soort. Draaien de positie van de voorraad fles iedere dag.
- Verdun de 1 mL monsters opgehaald tijdens stap 2.6 (100-fold verdunning in steriel water werkt meestal goed) en plaat op een rijke agar medium verspreid.
Opmerking: Deze platen kunnen worden gebruikt om te controleren voor gevallen van besmetting zo goed als fungeren als een bron van toekomstige algen entmateriaal voor verdere experimenten. - Monsters te nemen van de flessen (in het BSC) om de twee dagen om te controleren de groei van de microalgen.
Leg monsters in een 96-Wells-microplate in drievoud (200 µL) en meet de optische dichtheid (OD) bij 550 nm en 680 nm elke twee dagen tot OD bereikt 0,2-0,3 (die meestal vereist 5-7 dagen). - Stop de incubatie en plaats van de voorraad flessen op een bankje voor 24-48 h om de cellen van de algen te regelen door de zwaartekracht.
Opmerking: De vaste cellen zal vervolgens gebruikt worden om te enten van de zeepbel kolom photobioreactors. Indien een snellere cel collectie is gewenst, kunnen cellen worden gecentrifugeerd bij niet meer dan 1.000 x g voor het verzamelen van cellen.
3. teelt van microalgen in Bubble kolom Photobioreactors
- Eergisteren bioreactor inoculatie, bereid passende media en transfer 200 mL (of gewenste volume) aan de zeepbel kolom photobioreactor buizen (kruising buizen). Autoclaaf buizen met media en ontlucht deksels in plaats.
Opmerking: Als afvalwater gebruikt als een groeimedium, autoclaaf de lege bioreactoren en steriele gefiltreerd afvalwater toe te voegen (indien een cultuur is gewenst). - De voorraad vaste microalgen concentreren door het verwijderen van het supernatans dat met behulp van een vacuümpomp. Laat van minder dan 100 mL medium in elke fles maar voorkomen dat vaste algen verwijderen.
Opmerking: Deze procedure binnen een BSC voeren en volg steriele techniek. Een eenvoudige vacuüm apparaat kan worden geconstrueerd met behulp van een vacuüm kolf of fles. Past een steriele serologische pipet op het einde van de buis. - Schorten en de algen drijfmest overbrengen in steriele 50 mL centrifuge buizen. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min verder concentreren algen.
- Verwijder in het BSC, genoeg supernatans dat om een totaal volume van ~ 80 mL van algen concentraten voor 12 photobioreacters. Vermijd stofzuigen uit de pellet. Het concentraat wat over algen overbrengen in een steriele container (of het gebruikte algen voorraad fles).
- Voeg 6 mL algen drijfmest in elk photobioreactor met een steriele 10 mL serologische pipet.
- Steriele filter (0,2 mm spuit of vacuüm filter) en voeg de juiste bedragen van alle andere stoffen (bijvoorbeeld vitamine voorraden) die niet kunnen gesteriliseerde met autoclaaf worden.
- Swirl bioreactoren mixen van algen in het medium.
- Een 2 mL monster trekken door elke bioreactor met behulp van een serologische pipet en overdracht aan een tube 2 mL. Verzamelen een 2 mL monster (in een BSC) elke 24 uur om de voortgang van de cultuur. Controleer de steekproef voor het gebruik van pH strips test en pas de reactor, zo nodig met ofwel 3 M NaOH of 3 M HCl.
- Draai de bioreactor deksels en plaats alle bioreactoren in het vis tank waterbad. De beluchting, CO2en verlichting naar het passende niveau voor de soorten aanpassen. Draai de bioreactor positie elke dag na bemonstering (stap 3.8).
- Breng 200 µL van elk monster cultuur in drievoud wells van een 96 goed microplate. Meten van de optische dichtheid (OD) bij 550 nm en 680 nm.
- Op de laatste dag van de periode van de cultuur, meet u OD onder verschillende verdunningsfactoren (bijvoorbeeld een 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x en 32 x) om een correlatie tussen de Franse overzeese departementen en de werkelijke drooggewicht na de oogst (stap 4).
- Centrifugeer het monsterbuisje 2 mL bij 12.000 x g gedurende 5 min.
- De bovendrijvende vloeistof filteren door 0,2 µm niet-steriele injectiespuit filter en bewaar het supernatant (en pellet indien nodig) op Nee hoger dan-20 ° C voor lange termijn opslag en latere analyses van veranderingen in de samenstelling van de media.
4. oogsten en vriesdrogen van Microalgal biomassa
- Meten van een vaste hoeveelheid algen cultuur van elke bioreactor met een gegradueerde cilinder (bijvoorbeeld 160 mL van een bioreactor dat oorspronkelijk ingeperkt 200 mL van medium) en breng in centrifuge flessen. Spoel de gegradueerde cilinder met dH2O tussen elke meting.
- Centrifugeer bij 4,696 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant door zorgvuldig stofzuigen het uit.
- De pellets overbrengen in gelabelde 50 mL tubes. Spoel de centrifuge flessen met dH2O, en de inhoud van de overdracht aan de 50 mL tubes. Zorg ervoor dat het totale buis-volume niet hoger is dan 45 mL.
- Wassen van de algen pellets met dH2O te verwijderen van zouten.
- Centrifugeer de 50 mL tubes bij 4,696 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Voeg 40 mL dH2O toe aan elke buis 50 mL; Vortex te mengen. Centrifugeer nogmaals bij 4,696 x g gedurende 5 min en weggeworpen.
- Herhaal nogmaals stap 4.4.2.
- Label en weegt leeg 15 mL centrifuge buizen op een 4-decimaal evenwicht (label zowel het deksel en de buis en wegen samen). Weeg één tube per algen cultuur. Weeg elke tube van 15 mL tweemaal om te minimaliseren van de fout.
- Na de laatste wash, verwijder het supernatant en 7,5 mL dH2O toevoegen aan elke tube van 50 mL. Vortex en overdracht de algen slurries in de vooraf gewogen 15 mL tubes. Spoel de 50 mL tubes met aanvullende dH2O en transfer van vloeistof naar de 15 mL tubes. Te voorkomen dat meer dan 12 mL voor totale volume in de 15 mL tubes.
- Centrifugeer de 15 mL tubes bij 4,696 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Het bevriezen van de buizen met pellets bij-80 ° C gedurende ten minste 30 min ter voorbereiding van trekkers.
- Freeze droog 's nachts of totdat gedroogd.
- Wegen en registreren van de gevriesdroogde 15 mL buisjes met algen.
5. lipide extractie met behulp van een gemodificeerde Folch methode24
- Weeg 20 mg gevriesdroogd algenbiomassa in een 2 mL schroefdop polypropyleen buis (selectievakje fabrikant label om ervoor te zorgen dat product is geschikt voor kraal extracties).
- Voeg 1,5 mL Folch oplosmiddel (2:1 chloroform/methanol) aan elke 2 mL-buis (die bevat 20 mg gevriesdroogd algen). Giet ~0.5 mL zirconia/kiezelzuur parels (0.5 mm) in elke buis tot vloeistofniveau in buis 2 mL bereikt.
Let op: Omgaan met chloroform en methanol in een zuurkast en Vermijd inademen van dampen of huidcontact. - Meng de algen monsters in de molen van een kraal voor 20 s met een snelheid van 6,5 m/s. overdracht buizen aan ijs voor 30 s om te relaxen van monsters. Herhaal vijfmaal meer volledig uitpakken lipiden.
- Het homogenaat wordt gefiltreerd door een 5 mL-spuit met een roestvrij stalen draad mazen schijf (#60 mesh) stam uit de kralen, verzamelen filtraat op in een tube van 15 mL.
- Wassen van de kralen met 1,5 mL Folch oplosmiddel, vloeistof door te duwen met de spuit als dit nodig is. Herhaal deze wassing twee meer tijden en verzamel alle filtraat in de tube van 15 mL, opbrengst een eindvolume van ongeveer 6 mL.
- Voeg 1.2 mL 0,9% (m/v) NaCl oplossing aan het Folch extract in de tube van 15 mL en vortex te goed mengen.
Opmerking: Indien nodig, meer Folch oplosmiddel kan worden gebruikt om te wassen kralen (gebruik 0,2 x het volume van de totale wassen van 0.9% NaCl-oplossing voor het opwekken van fase-separatie zichtbaar). - Centrifugeer de 15 mL tubes bij 6.000 x g gedurende 5 min. Record het onderste chloroform (groen) fase volume tot de dichtstbijzijnde 0,1 mL met behulp van lijnen aan de zijkant van de tube van 15 mL. Overdracht van de fase van de bodem naar een glazen ampul (met het deksel) met behulp van een glazen pipet van Pasteur.
- Bewaar de lipide bij-20 ° C of -80 ° C als er plannen bestaan om via dit extract voor analyse van de vetzuren.
6. neutrale lipide Assay met een Microplate-methode (aangepast van Higgins et al. 201422)
- Bereiden van stamoplossingen. Bereiden van 10 mL 1 mg/mL plantaardige olie standaard in chloroform en opgeslagen bij-20 ° C.
Opmerking: Elke plantaardige olie kan worden gebruikt in deze test want het is niet gevoelig voor de soorten vetzuren. 10 mL van 200 µg/mL Nile Red oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) voor te bereiden en op te slaan in het donker bij kamertemperatuur. - Verwarm droge microplate blok tot 55 ° C in een zuurkast. Terwijl dit is Verwarming, Verdun de lipide extracten en plantaardige olie standaard 3 katernen met methanol.
Opmerking: Deze verdunning kan worden gewijzigd op basis van het vetgehalte van de algen, maar dit niveau werkt goed voor de meeste Chlorella. - Voeg voor elk verdunde monster, 80 µL aan een 96 goed polypropyleen microplate in viervoud.
Let op: Gebruik van polystyreen plasticware wordt niet aanbevolen voor gebruik met organische oplosmiddelen. - Breng voor de oplosmiddelblanco, 80 µL van 2:1 methanol/chloroform in viervoud. Toevoegen voor normen, 10, 30, 60, 90 en 120 µL van de verdunde plantaardige olie standaard in viervoud.
- Plaats de microplate in een dry block kalibrator kachel bij 55 ° C gedurende 20-30 minuten totdat alle oplosmiddel verdampt. Terwijl het oplosmiddel verdampt, bereiden de werking Nile Red oplossing (noodzaak 200 µL van 1 µg/ml oplossing per plaat goed). Als voorbeeld vereist twaalf monsters en een volledige reeks van normen 16 mL 1.0 µg/mL oplossing; bereiden door oplossend 80 µL van de voorraad van 200 µg Mo/mL (in DMSO) in 16 mL dH2O.
- Verwijder de microplate uit het blok van de verwarming en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 30 µL van isopropylalcohol aan elk putje en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Controleer alle Pipetteer kanalen zijn de oplossing mengen en resuspending van de lipiden, opbrengst van een homogene groene vloeistof.
- Voeg 200 µL van Nijl Red oplossing (1 µg/mL) voor elk goed, Pipetteer omhoog/omlaag 10 keer te mengen. Laat de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Terwijl we wachten, bereid een 50% bleekwater oplossing door het mengen van bleekwater (6% hypochloriet) met dH2O. 20 µL per putje nodig zijn. Voorbereiding van 3 mL 50% bleekwater is voldoende voor 12 monsters en een volledige reeks van normen.
- 20 µL van bleekwater oplossing toevoegen aan elke microplate goed en Pipetteer op en neer 5 keer naar meng goed. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 30 min, lees fluorescentie in de monsters elke 5-10 min op 530 nm excitatie/575 nm emissie met auto cutoff ingesteld op 570 nm totdat het signaal van algen monsters stabiliseert. 60 min totaal incubatietijd is meestal voldoende.
- Maak een ijklijn voor de plantaardige olie-normen (in het bereik van 0-40 ng olie per putje).
Opmerking: Een lineaire passen geschikt voor lage (< 30 ng/putje) olie concentraties en een veelterm passen mogen worden gebruikt als de standaard groter is dan 30 ng/putje. Gebruik deze correlatie te kwantificeren van de neutrale lipiden in de steekproef putten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze procedure levert een tijdsverloop van algen optische dichtheid gegevens bij OD 550 nm (figuur 4A). De optische dichtheid en het droge gewicht concentratie gegevens kunnen worden gecorreleerd (figuur 4B). Dit wordt bereikt door de eerste berekening van de concentratie van de algen droge eindgewicht na de freeze-drying stap. Vervolgens kan de optische dichtheid van de cultuur seriële verdunning (uitgevoerd op de laatste dag van de bemonstering) en de werkelijke drooggewicht concentraties gecorreleerd worden. Voor lage cel concentraties, kan een lineaire correlatie worden gebruikt terwijl voor hogere concentraties van de cel, een tweede orde polynoom correlatie kan worden gebruikt. Het is aanbevolen om het maken van een aparte correlatie voor elke cultuur-voorwaarde. Tot slot, de correlatie kan worden toegepast op het gegevenstype van de optische dichtheid van het cursus tijd te verkrijgen een drooggewicht groeicurve (figuur 4C). In dit voorbeeld experiment, was Auxenochlorella protothecoides (UTEX 234125) gekweekt onder vier voorwaarden: een controleculturen geteeld op verse N8-NH4 middelgrote21, in co-cultuur met de bacteriën Azospirillum brasilense, in middelgrote aangevuld met 50 mg/L van indool-3-azijnzuur en aan besteed middellange van A. brasilense. A. brasilense is bekend voor de productie van indool-3-azijnzuur, een hormoon, dat bevordert ook de groei in sommige microalgen bevorderen plantengroei. Echter bij 50 mg/L, de IAA behandeling volledig geremd A. protothecoides groei. Bijgevolg, optische dichtheid gegevens beschikbaar was, maar de hoeveelheid algen onvoldoende was om de concentratie van een nauwkeurige drooggewicht. In dit geval de correlatie voor de cultuur kan worden toegepast of optische dichtheid gegevens kunnen rechtstreeks worden gerapporteerd. Omdat OD gegevens verzameld bij beide 550 nm en 680 nm absorptie, ofwel dataset kan worden gebruikt voor de correlatie tussen OD en drooggewicht. OD 550 wordt meestal gebruikt omdat het bijna geheel uitsluit van de extinctie van chlorofyl26, dus onderdrukken bias van wijzigingen in de inhoud van de chlorofyl. In tegenstelling, OD 680 omvat de extinctie van chlorofyl en hoge ratio's van OD 680/550 geven hoge chlorofyl inhoud in de algen. Figuur 4 d toont een reeks van twaalf algen culturen groeien in de zeepbel kolom photobioreactors. Zelfs met slechts drie biologische replicaten per behandeling, werden strakke standaarddeviaties bereikt, rekening houdend met de hoge gevoeligheid voor verschillen tussen behandelingen.
Figuur 4. Algengroei resulteert in een zeepbel kolom photobioreactors. (A) de optische dichtheid (550 nm) toont de groeicurve van Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341) culturen laat logaritmische groei op 120 uren invoeren. Controleculturen zijn geteeld op verse N8-NH4 medium, behandeling 1 is mede culturen van A. protothecoides en Azospirillum brasilense gegroeid op verse N8-NH4 medium, behandeling 2 is een A. protothecoides geteeld op N8-NH4 medium aangevuld met 50 mg/L indool-3-azijnzuur (IAA), en behandeling 3 is een A. protothecoides geteeld op de drager van de verbruikte van A. brasilense. Het gebruikte medium werd voorbereid door het kweken van A. brasilense voor 96 uur op N8-NH4 medium aangevuld met 2 gram per liter appelzuur. Cellen werden verwijderd, en het medium was opnieuw aangevuld met ammonium om te herstellen van het eerste niveau, pH werd aangepast, en het medium was steriele gefilterde (0.2 μm). Merk op dat de behandeling van 50 mg/L IAA volledig geremd algengroei. (B) correlatie curven tussen OD 550 nm en droge eindgewicht concentratie met behulp van een tweede orde polynoom pasvorm. Geen correlatie weergegeven voor behandeling 2 omdat geen algen kunnen worden geoogst aan het einde van de periode van de cultuur. (C) toepassing van de polynoom correlatie met de optische dichtheid gegevens levert een groeicurve met drooggewicht concentratie op de y-as. De controle cultuur correlatie werd toegepast op de gegevens van de OD voor behandeling 2. Foutbalken zijn standaarddeviaties op basis van 3 biologische repliceert. (D) foto van de zeepbel kolom photobioreactors kort na inoculatie van de cultuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Neutrale lipide gegevens weergegeven voor twee voorbeeld experimenten in Figuur 5. Deze test is aangetoond dat het correleren goed met neutrale lipide inhoud, met name triacyglycerol (TAG). Dit kan worden gezien door het vergelijken van de neutrale lipide assay (figuur 5A) naar een overeenkomstige dunne laag chromatografie plaat (figuur 5B). Dezelfde trend kan worden gezien in het tweede experiment (figuur 5C en 5 D). In al deze experimenten, was canola-olie gebruikt als een standaard en resulteerde in een lineaire correlatie (R2 van 0.98 voor het eerste experiment en 0.99 voor de tweede) tussen fluorescentie en canola olie massa in de put. Merk op dat alle monsters hebt laag vetgehalte, dan het hoogste punt of twee op de standaard kan worden neergezet. Deze correlatie kan worden gebruikt voor het berekenen van de hoeveelheid neutrale lipide (µg) in elk van de algen monster putten. De olie massa kan worden vervolgens geconverteerd naar een concentratie in het extract van de lipide toegepast op de microplate goed. Deze waarde wordt vermenigvuldigd met de verdunningsfactor gebruikt (bijvoorbeeld 3 x) te verkrijgen de neutrale vetgehalte van de oorspronkelijke Folch extracten. Deze concentratie wordt vervolgens vermenigvuldigd met het volume van de extractieoplossing (moet dicht bij 4 mL) en vervolgens gedeeld door de totale massa van de biomassa van de algen gebruikt voor lipide-extractie (moet dicht bij 20 mg). Het resultaat is het neutrale vetgehalte van de microalgen.
Figuur 5. Neutrale lipide gegevens verkregen uit culturen van Chlorella sorokiniana (UTEX 2714). (A) neutraal vetgehalte (% droog gewicht) voor algen in experimenteren 1 in welke algen werden geteeld voor 120 uur. De cultuur was een en gekweekte op verse N8 middellange23, behandeling 1 was een co cultuur van C. sorokiniana A. brasilense op vers medium N8, behandeling 2 was vers N8 medium aangevuld met 50 mg/L IAA en behandeling 3 werd besteed worden overgedragen door A. brasilense. Het gebruikte medium was bereid door kweken A. brasilense voor 96 uur in N8 medium aangevuld met 2 gram per liter appelzuur, verwijderen van cellen, ter aanvulling van verloren nitraat, pH, aanpassen en steriele filteren van het medium (0.2 μm). In tegenstelling tot de A. protothecoides, deed de 50 mg/L IAA C. sorokiniana groei niet remmen. (B) TLC plaat afbeelding voor experiment 1 weergegeven: relatieve TAG overvloed. (C) neutraal vetgehalte (% droog gewicht) voor algen in de experiment 2 die had de dezelfde behandelingen als experiment 1 maar de cellen zijn geoogst na 72 uur van groei. (D) TLC plaat afbeelding voor experiment 2 weergegeven: relatieve TAG overvloed. Foutbalken zijn standaarddeviaties op basis van 3 biologische repliceert. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Ook is het verstandig om te berekenen van de variatiecoëfficiënt (standaardafwijking gedeeld door het gemiddelde) van de ruwe fluorescentie lezingen over alle technische replicaat-organismen in de neutrale lipide-bepaling. Ervan uitgaande dat technische replicatieonderzoeken werden uitgevoerd in de microplate in viervoud zoals opgemerkt in de procedure, de variatiecoëfficiënt meestal niet groter is dan 10%. Hoge coëfficiënten van variatie zijn meestal het resultaat van slechte mengen (met name bij de toevoeging van isopropylalcohol) en mogelijk onjuist gebruik van de meerkanaalspipet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste overweging bij het kweken van algen is een goed begrip van de specifieke behoeften van het organisme of groep van organismen. De algen Cultuurstelsel hier beschreven kan worden gebruikt om de cultuur van een breed scala van algen, maar de specifieke abiotische factoren (temperatuur, media, pH, licht intensiteit, CO2 -niveau, beluchting tarief) moeten worden aangepast aan de behoeften van het organisme. Opmerking de hier beschreven parameters werden gebruikt voor de teelt van Chlorella en Auxenochlorella. Deze organismen zijn van industriële belang omdat ze verdraagzaam aan hoge nutriënt, licht en temperatuur niveaus27 zijn. Echter lichtniveaus kunnen worden verminderd door verwijdering van de TL-lampen en de dag/nacht cyclus kan worden aangepast om aan te geven van de seizoensgebondenheid. Ook de boilers draaibaar omhoog of omlaag om het besturingselement de temperatuur van het water bad op het systeem. Terwijl het systeem hier beschreven zulk een eigenschap niet in dienst doet, is het mogelijk te koelen van de vis tank waterbaden onder kamertemperatuur door middel van een goedkope koelsysteem. Plaats een emmer water in een kleine koelkast en gebruik een water van de pomp naar pomp met variabele snelheid van de koudwater emmer naar de vissentank en terug. Hoe sneller het pompen tarief, hoe kouder het vis tank reservoir zal worden.
Maar het Cultuurstelsel algen over het algemeen consistente resultaten biedt, zijn er een paar belangrijke valkuilen die u moeten overwegen. De eerste is water spoelen die in het geval optreedt dat de beluchting systeem een plotselinge verlies van druk ervaringen (bijvoorbeeld een geblazen montage of een lucht compressor mislukking). Druk in de luchtbevochtigers zal water van de luchtbevochtiger achterwaarts door de slang, onder meer door de rotameter duwen. Het installeren van een upstream val of terugvoer preventer kan helpen. Merk op dat spoelen niet de bioreactoren zelf beïnvloeden zullen omdat ze bij atmosferische druk werken. Routine-inspectie van de leidingen en fittingen kan helpen verlichten van systeemfouten. Een andere belangrijke overweging is het routinematig inspecteren en vervangen van de luchtfilters en controleren van de kleppen op de bioreactoren. Zorg ervoor dat het volgen van de aanbevelingen van de fabrikant voor het aantal autoclaaf cycli toegestane. Dit is vooral belangrijk als het onderhoud van een culturen is essentieel voor het experiment. Ten slotte, is het aanbevolen om te kopen of bouwen van een autoclaaf rek voor veilig transport van de bioreactoren tussen de waterbaden, autoclaaf en bioveiligheid kabinet. Een roestvrij stalen draadrek kan dit doel dienen.
Het systeem van de bioreactor hier beschreven heeft verscheidene beperkingen. Een belangrijke beperking is de noodzaak om de reactoren in een kast van de bioveiligheid met behulp van steriele techniek. De reactoren ontbreekt aan een anti-spoelen bemonstering poort, vereisen dat de gebruiker om de reactor naar een bioveiligheid kabinet aan monster zonder besmetting van de cultuur. Ook eisen dat de reactoren handmatige pH lezing en aanpassing die potentieel voor menselijke fouten introduceert.
Het systeem van de bioreactor hier beschreven vult een niche tussen eenvoudige kolf teelt en volledig gecontroleerde bioreactoren. De bioreactor systeem werd ontwikkeld in reactie op de behoefte aan een meer consistente resultaten dan waren haalbaar met behulp van flessen. De gegevens blijkt dat dit systeem consistente groei resultaten genereert wanneer op de juiste manier onderhouden. Merk op dat belucht flessen in de procedure voor de teelt van algen voorraad werkzaam waren, maar dit gebeurde alleen voor de productie van entmateriaal voor het experiment. Dit is acceptabel omdat voorraad flessen voor inoculatie werden samengevoegd en vandaar variabiliteit tussen reactoren niet een probleem is.
Zoals vele algen onderzoekers geïnteresseerd bent in controle van zowel de groei en de neutrale vetgehalte, hebben we onze benadering van het meten van beide parameters hier opgenomen. Gebruik van optische dichtheid te meten van de groei is gebruikelijk en is ongeëvenaard in zijn eenvoud. Echter correlaties tussen droog gewicht en optische dichtheid veranderen in de tijd en afhankelijk van de cultuuromstandigheden. Het is aanbevolen om het produceren van een vergelijking van de correlatie voor elk experimentele behandeling binnen elke experimentele batch. Dit is mogelijk in de voorgestelde procedure omdat gevriesdroogde algen na elke cultuur experiment zal worden verkregen. Een kritische veronderstelling van de extinctie-aanpak is dat de correlatie tussen extinctie en droog gewicht constant in de loop van batch groei houdt. Zolang afwijkingen van deze veronderstelling klein zijn, zal het resultaat redelijk nauwkeurige zijn. De relatieve nauwkeurigheid kan worden beoordeeld door vergelijking van de berekende algen drooggewicht concentratie op moment nul. Ervan uitgaande dat culturen waren goed gemengd en pipetting was nauwkeurig, dat de culturen moeten allemaal de dezelfde dichtheid van de eerste inenting. De optische dichtheid benadering ook kan worden aangevochten als achtergrond extinctie van het medium hoog is (dat wil zeggen, wanneer u werkt met bepaalde zich). Aftrekken van de middellange absorptie (vóór inoculatie) van elke lezing OD kan helpen met dit probleem.
Extractie van lipiden uit de droge algen volgt de gevestigde Folch aanpak21,24; Er zijn echter belangrijke overwegingen. Verschillende algen soorten hebben verschillende celwanden met variërende graden van hardheid. De parels van de zirconia/silica gebruikt hier zijn scherp en zijn ontworpen om sterke, doorboren polysaccharide celwanden. Een zachtere parel-type (bijvoorbeeld glas) of minder kraal verstoring cycli kunnen worden gebruikt op algen met zwakkere celwanden. Echter, een vuistregel is dat de resulterende cel pellet na extractie vrij van pigment zijn moet, die aangeeft dat alle chlorofyl werd gewonnen. Een van de meest voorkomende bronnen van fout tijdens de lipide extractie stap optreedt als gevolg van onjuiste bevriezen drogen. Als het monster in de droger bevriezen smelt voordat het volledig droog is, betekent dit dat het resultaat zal zijn dat er een zeer harde, donkere, wasachtige pellet. Dit is het resultaat van cellen die lysed onder vacuüm voorwaarden van de droger bevriezing. De pellet kan worden afgewogen om te verkrijgen van een droge gewicht, maar het kan niet worden gebruikt voor de extractie van het lipide zoals de wasachtige deeltjes niet in de Folch oplosmiddel breken doen. Om ervoor te zorgen dat vriesdrogen altijd opbrengsten zachte, poederachtige monsters, is het essentieel om te bevriezen van alle monsters tot-80 ° C en snel overbrengen naar de bevriezing droger. Bovendien, met parafilm (met een gat in het stak) in plaats van losgedraaide buis deksels zal ervoor zorgen dat vocht kan worden permanent verwijderd uit de steekproef voordat het ontdooit.
De bepaling van de neutrale lipide beschreven in deze procedure is eerder gepubliceerd en bevat een bespreking van alternatieve lipide assays22. Echter, enkele belangrijke verbeteringen doorgevoerd die procedure sinds de publicatie. Meest in het bijzonder, werd de concentratie van de Nijl-rode voorraadoplossing verhoogd van 0,5 µg/mL tot 1 µg/mL. Het effect van deze wijziging was hogere signaal intensiteit, verbeterde herhaalbaarheid en een eliminatie van de daling van het signaal na verloop van tijd tijdens de incubatieperiode. De resultaten tonen aan dat de test ook met resultaten van kwalitatieve Dunnelaagchromatografie vergelijkt. Deze test werd ontwikkeld en gevalideerd met behulp van verschillende soorten Chlorella en Auxenochlorella , zodat de toepasbaarheid op soorten afwijkt samenstelling is niet vastgesteld. Alle groene pigment moet volledig worden verwijderd uit de bepaling tijdens de incubatie van bleekmiddel, wat leidt tot monsters die duidelijk of zeer bleke geel. Merk ook op dat lipide-extracten die aangetaste (zoals aangegeven door een verandering van groen naar bruin kleur) meestal niet leveren van nauwkeurige resultaten in deze test. Het is dus absoluut noodzakelijk om op te slaan van lipide monsters zonder hoger dan-20 ° C in het donker.
De methoden die hier worden gepresenteerd voor het kweken van algen groei te meten en kwantificeren van de neutrale lipiden zijn nuttig voor een verscheidenheid van waterbouwkundige toepassingen van algen, maar zijn met name geschikt voor onderzoek naar de productie van biobrandstoffen. Deze methoden worden ook gebruikt om te studeren algengroei remming op zich28 , evenals effecten van organisme interactie op de groei en de samenstelling van microalgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Steun voor dit onderzoek werd verzorgd door USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw Hatch Project ALA0HIGGINS en de Auburn University kantoren van de rector, de Vice President voor onderzoek en de Samuel Ginn College of Engineering. Ook werd de steun verleend door NSF verlenen CBET-1438211.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars - long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars - medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100x15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24x2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).
