Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/59106
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biosystems Engineering, Auburn University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבנות מעבדה-סולם בועה עמודה photobioreactors ולהשתמש בהן כדי microalgae תרבות. הוא מספק גם שיטה לקביעת שיעור הצמיחה תרבות ותוכן השומנים נייטרלי.

Abstract

יש עניין משמעותי במחקר של microalgae ליישומים הנדסיים כגון הייצור של דלק ביולוגי, מוצרים בעלי ערך גבוה, ועל לטיפול של פסולת. כמו רוב מאמצי מחקר חדש להתחיל בקנה מידה מעבדה, יש צורך שיטות חסכונית culturing microalgae באופן לשחזור. כאן, אנו מתקשרים גישה יעילה microalgae התרבות במעבדה-מידה photobioreactors, וכדי למדוד את הצמיחה ואת תוכן שומני נייטרלי של אצות הזה. הוראות כלולות גם על כיצד להגדיר את המערכת photobioreactor. למרות האורגניזמים דוגמה מינים של כלורלה , Auxenochlorella, ניתן להתאים מערכת זו לטפח מגוון רחב של microalgae, כולל תרבויות המשנה של אצות עם מינים שאינם אצות. תרבויות מניות קודם גדלים בקבוקים כדי לייצר inoculum של המערכת photobioreactor. אצות inoculum מרוכז, הועבר photobioreactors לטיפוח במצב אצווה. דוגמאות נאספים מדי יום עבור המקראות צפיפות אופטית. בקצה של התרבות אצווה, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה, שטף, להקפיא מיובש בריכוז סופי משקל יבש. הריכוז הסופי משקל יבש משמשת ליצירת מתאם בין הצפיפות האופטית ריכוז משקל יבש. שיטה Folch ששונה משתמשים לאחר מכן לחלץ סה כ שומנים ביומסה הליחה, התמצית הוא לבדיקה לתוכן נייטרלי השומנים שלה באמצעות וזמינותו של microplate. זה וזמינותו שפורסם בעבר אבל פרוטוקול צעדים נכללו כאן כדי להדגיש שלבים קריטיים בהליך שבו מתרחשות לעתים קרובות שגיאות. מערכת ביוריאקטור המתוארים כאן ממלא את הנישה שלו בין טיפוח פשוטה את הבקבוק שבשליטת מלא מסחרית ריאקטורים. מעתיק. אפילו עם רק 3-4 ביולוגית לכל טיפול, גישת culturing אצות מוביל חזק סטיות תקן ב מבחני וצמיחה של השומנים.

Introduction

היישום של microalgae הנדסה וביוטכנולוגיה משכה עניין רב בשנים האחרונות. Microalgae נלמדים לשימוש בשפכים טיפול1,2,3,4, biofuel הייצור5,6,7,8, ו ייצור בריאותיים, אחרים9,מוצרים בעלי ערך גבוה10. אצות הן גם להיות מהונדסים גנטית במחירים גדול במאמץ לשפר את כושר ספציפי הנדסי יישומי11,12. כתוצאה מכך, יש עניין רב בניסויים עם תעשייתי הרלוונטיות האורגניזמים בהגדרות מבוקרת. מטרת שיטה זו היא לתקשר גישה יעילה microalgae תרבות בסביבה מעבדתית מבוקרת, וכדי למדוד את הצמיחה ואת תוכן שומני נייטרלי של אצות הזה. שיפור צמיחת המחירים ותוכן השומנים נייטרלי microalgae זוהו שני צווארי בקבוק המפתח לכיוון מסחור של דלק ביולוגי אצה13.

מגוון רחב של גישות שימשו התרבות אצות למטרות ניסוי. באופן כללי, גישות אלה ניתן לחלק בין טיפוח חיצונית בקנה מידה גדול טיפוח מקורה בקנה מידה קטן. חיצונית בטיפוח photobioreactors ובריכות פתוחות מתאימה עבור ניסויים מכוונים קנה מידה את התהליכים כבר הוכחו בקנה מידה מעבדה (למשל, כדי לבדוק את הסולם של מתח גבוה-השומנים החדש של אצות)14. אולם, טיפוח בקנה מידה קטן מקורה מתאים בעת פיתוח זנים חדשים או משופרים אצות או ביצוע ניסויים שמטרתם להבין מנגנונים ביולוגיים. במקרים אלה האחרונים, רמה גבוהה של שליטה ניסויית נדרש לבדוק שינויים עדינים התנהגות ביולוגית. לשם כך, תרבויות axenic נדרשים לעיתים קרובות על מנת לצמצם את הגורמים ביוטיים מורכבים הקשורים אורגניזמים אחרים (למשל חיידקים, אצות אחרות) אשר גדלים באופן בלתי נמנע במערכות חיצוניות בקנה מידה גדול. גם כאשר הלומדים אינטראקציות בין אצות ואורגניזמים אחרים, מצאנו כי תנאי ניסוי מבוקר מאוד שימושי כאשר בוחנים exchange מולקולרי בין אורגניזמים15,16,17.

בקטגוריה של טיפוח אצות מקורה בקנה מידה קטן, שימשו מגוון של גישות. אולי הגישה הנפוצה ביותר היא לגדל אצות Erlenmeyer המבחנות על שולחן שאכר מתחת הבנק אור18,19. החליפין של חמצן ו- CO2 מתקיים על ידי דיפוזיה פסיבית דרך פקק קצף בחלק העליון של הבקבוק. יש חוקרים שיפרו את הגדרת דרך לערבב פעיל מתוך מבחנות20. גישה אחרת היא לטפח אצות בקבוקים, מיקס על ידי ובר מערבבים לערבב פעיל. למרות הפשטות שלהם, מצאנו כי השימוש מימיות ובקבוקי מובילה לעיתים קרובות תוצאות לא עקביות בין משכפל ביולוגי. ככל הנראה זאת בשל המיקום אפקטים - עמדות שונות לקבל כמויות שונות של אור, אשר גם להשפיע על הכור הפנימי טמפרטורות. הסיבוב היומי של כורים למיקומים חדשים יכול לעזור אבל לא להקל על הבעיה כי בשלבים מסוימים של גידול אצות (למשל, מוקדם מעריכית) רגישים יותר להשפעות מיקומיים יותר מהאחרים (למשל, שלב יומן).

בצד השני של הספקטרום של תחכום טכנולוגי נמצאים בשליטה מלאה photobioreactors מסחרי. מערכות אלו ללא הרף לעקוב ולהתאים את התנאים לכור כדי למטב את גידול אצות. יש להם תאורה הניתן לתכנות, בקרת טמפרטורה בזמן אמת ושליטה pH. למרבה הצער, הם יקרים, בדרך כלל עלות כמה אלפי דולרים לכל כור. כתבי עת מדעיים והנדסיים ביותר דורשים שכפול הביולוגי של תוצאות, המחייב רכישת ריאקטורים מרובים. אנו מציגים כאן מערכת הכור בועה עמודה הגשרים את הפער בין פשוטה (הבקבוק) מתוחכם (בשליטה מלאה ביוריאקטור) מתקרב לטיפוח אצות בקנה מידה מעבדה. אכסדרת בועות להשתמש בעליה בועות גז כדי להקל על חילוף הגזים ומערבבים את הכור. גישה זו מספקת מידה מסוימת של שליטה תאורה וטמפרטורה אך עושה זאת באופן חסכוני. יתר על כן, מצאנו את מערכת זו להניב תוצאות עקביות גבוהה בקרב משכפל ביולוגי, הפחתת את המספר הנדרש של משכפל ביולוגי הדרושים על מנת להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית לעומת הגישה את הבקבוק או בקבוק. השתמשנו גם מערכת זו לטפח בהצלחה תערובות של אצות, חיידקים21. בנוסף טיפוח אצות, אנחנו חלוקה לרמות הליך למדידת את תכולת השומנים נייטרלי האצות בתרבית. השיטה השנייה כבר שפורסם במקומות אחרים22, אך אנו כוללים את ההליך פה לספק הוראות שלב אחר שלב כיצד להעסיק אותו בהצלחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. כיוונון של בועה עמודה Photobioreactors

  1. לבנות סט של העפעפיים פרקו מן עפעפיו פלסטיק שהגיע עם בקבוקי זכוכית 1 ליטר וצינורות הכלאה (לקבלת מפרטים טכניים ותמונות, ראה איור 1 ). לבנות מכסים עבור מעשיר, ערבוב מלכודת כל photobioreactor מעלית אויר, כל בכור בקבוק.
    1. קודחים חורים ¼" המכסה: 2 חורים יש צורך העפעפיים ביוריאקטור ומכשיר האדים; 3 חורים יש צורך המלכודת ערבוב.
    2. להחליק ¼" o-ring על הנושאים של 1/8" לוח זכוכית הר התאמה והחלק הזה לתוך החור ¼" בתלמידים את המכסה (איור 1 א').
    3. להחליק השני ¼" o-ring מעל החוטים כך המכסה דחוקה בין שני O-הטבעות. להחליק שם באום אל החוטים והדק לתקן זכוכית הר את החלונית במקום.
    4. הצמד טבעות מנעול על גבי חשופה זכר סכינים סטריליים מקרין המכסה. חזור על צעדים 1.1.2-1.1.4 עבור כל חור במכסה.
    5. על העפעפיים אשר ישמש על כורים העמודה ואת הבקבוק בועה, לצרף 1/8" הנשי סכינים סטריליים כדי בארב אביזרי כדי 1.5" חתיכות של מזהה PVC לצנרת 1/8. צרף אלה לכל אחד המדידות סכינים סטריליים הגברי החשוף על המכסה.
    6. להתחבר שסתום הסימון (הצבעה מן המכסה) סוף חינם אחד 1/8" חתיכות.
      הערה: זה ישמש היציאה פליטה ביוריאקטור.
    7. להתחבר עם סכינים סטריליים זכר בארב הולם את החלק השני של "1/8 צינורות מקרין המכסה. במקומו בנקישה את טבעת מנעול סיבוב והדקו מסנן אוויר 0.2 מ מ הזה.
      הערה: זה ישמש היציאה כניסת עבור הכור.

Figure 1
איור 1. מפרטים טכניים ותמונות לבניית ריאקטורים. (A) מפרטים טכניים עבור בנייה של ביוריאקטור העפעפיים (B) צילום של המכסה ביוריאקטור התאספו, ו (ג) צילום של המכסה שהורכב המשמש מעשיר. שימו לב כי המדידות מכשיר אדים צריך להיות מצופה סיליקון מים הוכחה כדי להבטיח של החותם אטום עם המכסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. להרכיב מערכת משלוח אוויר (ראה איור 2A ו- 2B מפרטים טכניים, צילום).
    1. 1/8 NPT חוט לצרף אביזרי בארב אינלטס, שקעים בגב כל רוטמטר.
      הערה: 200-2,500 ס מ3/min rotameters הן עבור אוויר בלחץ אפנון במעלה הזרם מעשיר, rotameters /min3ס מ 100-1, 000 הן עבור בקבוק כורים, 50-500 ס מ3/min rotameters נועדו ריאקטורים מעלית אויר ו- 5-50 ס מ3/ rotemeters מין הן עבור CO2 זרימה רגולציה. מומלץ הר rotameters על משטח קבוע (למשל יריעת פלסטיק) הם לא אפול במהלך המבצע.
    2. . כבה את המקור אוויר דחוס ולאחר מכן להתחבר ¼" מזהה גמיש PVC צינורות המקור אוויר דחוס עם מהדק צינור. לרדת את קוטר צינור כדי 1/8 פלייר מזהה PVC גמיש אבובים באמצעות של ¼" הנקבה. בארב התאמה ו 1/8" זכר ל התאמה בארב-
    3. חבר את הקצה ללא תשלום של 1/8 פלייר מזהה הצנרת לים של רוטמטר /min3ס מ 200-2,500.
      הערה: בשקע של רוטמטר זה יזין את הבקבוק מעשיר באמצעות מזהה לצנרת 1/8.
    4. לחבר את 1/8" אבובים על מעין שקע בחופו כדי מכסה פרקו (שימוש סכינים סטריליים הנשי כדי בארב הולם החיבור). לאחר מכן להתחבר לגוש 1/8" אבובים הפנימי של ההר לוח מתאים.
      הערה: קטע זה לתלות למטה לתוך מכשיר אדים ו בועת אוויר דרך המים.
    5. לצרף 1/8 סכינים סטריליים הנשי בארב אביזרי בכל צד של פיסת מזהה לצנרת 1/8" ולהשתמש יצירה זו כדי להתחבר לשקע מעשיר הים של המלכודת ערבוב.
    6. באותו אופן כמו 1.2.5, להתחבר לשקע של הרגולטורים2 CO נמל השני על המלכודת ערבוב.
    7. לבנות של יריעה באמצעות 1/8" בארב מרובה צנור ו- 1/8" (ראה איור 2 C) להאכיל אוויר לתוך הבנקים רוטמטר.
      הערה: rotameters אלה ישמש כדי לספק את ריאקטורים. הימנע בניית 6 יותר rotameters בסדרה. במקום זאת, השתמש במקביל בנקים של rotameters כדי להרחיב את המערכת. להבטיח כי הדרישה תזרים סה כ כל הכורים הוא פחות מ3ס מ 2,500 /min (או אחר יהיה צורך רוטמטר גדול יותר הזרם של מעשיר).
    8. להתחבר לשקע (פורטרואד 3) של המלכודת ערבוב הבנקים רוטמטר שנבנה מחדש באמצעות 1/8" tubing ו 1/8" הנקבה. בארב סכינים סטריליים.
    9. להתחבר ארוכה דיה 1/8" אבובים לשקעים של כל רוטמטר בגדה רוטמטר לאספקת אוויר ריאקטורים. תווית את הקצוות של הצנרת, כמו גם את rotameters של הבנק.
    10. החל מים הוכחה סיליקון מסביב לכל היציאות על העפעפיים מלכודת כדי להבטיח שהן מוצק מעשיר ולערבב.

Figure 2
באיור 2. מפרטים טכניים ותמונות להרכבת מערכת עמודה בועה. (א) תיאור סכמטי של התמונה מערכת (B) לערבב מעשיר, ערבוב מלכודת, רוטמטר הבנק, ואת התמונה (C) יריעות המשמש להתחברות הבנקים רוטמטר ביחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. להגדיר את מיכלי דגים, מערבבים צלחות, ואורות (איור 3).
    התראה: מערכת זו דורשת מספר רב של חנויות וקיבולת מעגל מספיק כדי לתמוך כל הרכיבים. הימנע stringing יחד מרובים מפצלי חשמל, כבלי אופנה daisy שרשרת כי זה סיכון חשמל. השימוש GFI סוג שקעי חשמל ומפצלי הוא מעודדים בשל נוכחותם של המים במערכת.
    1. לארגן את פרופיל נמוך מטלטלות על משטח ברמה חזקה מספיק כדי להחזיק המשקל של מיכלי דגים מלא מים.
    2. המקום קטן מעץ או פלסטיק בלוקי (מעט גבוה יותר הצלחות מערבבים) מסביב להיקף של הלוחות מערבבים כדי לתמוך את המשקל של דגים.
      התראה: להימנע הצבת מיכלי דגים ישירות על לוחות מערבבים כפי המשקל נמחוץ אותם.
    3. מקם את מיכלי דגים על הצלחות מערבבים תמיכה בלוקים, למלא את מיכלי המים.
    4. לחתוך חתיכה של גיליון פלסטיק נוקשה כדי להתאים מעל האקווריום כמו מכסה. חתכו את הכיסוי הזה להחליק פנימה והחוצה הצינורות הכלאה. גם לחתוך חור בשביל החימום טנק דגים.
    5. לארגן את הבנקים אור פלורסנט ליד האקווריום כדי לספק תאורה אופקי של ריאקטורים. חבר הבנק אור שעון עצר אור כדי להגדיר מחזור יום/לילה.

Figure 3
איור 3. מערכת סכמטי של ריאקטורים בקבוק (משמאל) ו photobioreactors עמודה על בועה (מימין). איור זה שונה מהיגינס. et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. הכנת Microalgae Inoculum

  1. להשיג microalgae inoculum של תרבות לשימור-הקפאה, מצופים או נוזלי.
    הערה: מומלץ כי אורגניזמים cryopreserved להיות מצופה לפני השימוש inoculum כדי להבטיח כי תאים הם קיימא וכי התרבות הנוצרת היא axenic. אגר בינונית (למשל., בקרת האוויר #5 sporulating אגר)21 הוא מדיום עשיר זה עובד היטב עבור להחיות מינים של כלורלה ו Auxenochlorella מהמחסן-הקפאה.
  2. להכין L 2.4 בינוני מינרלים המתאים עבור המין microalgae מסוים.
    הערה: הדוגמאות כוללות N8 בינוני23 מינים של כלורלה, N8-NH4 בינוני21 עבור מינים של Auxenochlorella. השימוש במדיום המתאימה לזן של אצות הוא אחד הצעדים החשובים ביותר כלפי להבטיח צמיחה חזקה אצות.
  3. Aliquot 2.4 L של מינרלים בינוני באופן שווה לתוך שלושה בקבוקי זכוכית 1 ליטר, להוסיף מעוררת ברים כל בקבוק ולהרכיב את המכסים פרקו (איור 1) עבור כל בקבוק. שח כפול זה הצינור לערבב על הצד כניסת ועל כל בקבוק יש בר מערבבים.
  4. אוטוקלב הבקבוקים מניות באמצעות עיקור נוזלי של מחזור (121 מעלות צלזיוס) 30 דקות אוטוקלב 100 מ של מים יונים (dH2O) וצינורות 1.5 mL כמה בו זמנית, אשר מאוחר יותר ישמש עבור ציפוי. לאפשר המדיום כדי לילה מגניב. לחלופין, מגניב הכור לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאוורר כבר שעתיים לפני חיסון.
  5. ב אבטחה cabinet (BSC), לחסן microalgae צלחת או axenic תרבית נוזלית לתוך הבקבוקים מניות. השתמש סטרילי טכניקה כדי לשמור על תרבויות axenic בשלבים הבאים.
    1. הוסף 20 מ של בלוק dH2O שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ. השתמש לולאה חד פעמי סטרילי 10 µL לאסוף מספר מושבות יחיד מהצלחת מהשלב 2.1. טובלים את הלולאה לתוך הצינור 50 מ ל, לרחוץ תאי האצות לתוך mL 20 של בלוק dH2O. לנער הצינור 50 מ ל לעשות פתרון microalgae הומוגנית.
    2. פיפטה 6 מ של פתרון microalgae לתוך כל בקבוק מניות עם פיפטה 10 מ"ל סרולוגית סטרילי. מערבולת מהבקבוק לערבב microalgae באופן שווה לתוך האמצעי.
  6. השתמשו פיפטה סרולוגית סטרילי מ ל 2 לציור 1 מ"ל דגימות מן הבקבוק מניות והעברת כל לתוך צינורות סטרילי mL 1.5.
    הערה: Micropipettes לא מומלץ בשלב זה בשל הסיכון של זיהום. להדק את המכסים פרקו על בקבוקי מניות.
  7. למקם את הבקבוקים מניות על צלחות מערבבים (~ 150 סל ד) ולהתאים את קצב הזרימה של האוויר, CO2, ורמות תאורה בהתאם המין. לסובב את המיקום בקבוק מניות כל יום.
  8. לדלל את הדגימות 1 מ"ל שהתקבל במהלך שלב 2.6 (100-fold לדילול במים סטריליים בדרך כלל עובד היטב) ולהפיץ את הצלחת על גבי מדיום אגר עשיר.
    הערה: הצלחות האלה יכול לשמש כדי לבדוק אם המופעים של זיהום גם כפי לשמש כמקור של אצות בעתיד inoculum עבור עוד ניסויים.
  9. לקחת דגימות מן הבקבוקים (ב BSC) בכל יומיים לבדוק את הצמיחה microalgae.
    למקם את דגימות microplate 96-ובכן שהפקידים (200 µL) ולמדוד את צפיפות אופטית (OD) ב 550 ננומטר, 680 ננומטר בכל יומיים עד OD מגיע ל- 0.2-0.3 (הדורשת בדרך כלל 5-7 ימים).
  10. תפסיק הדגירה ולמקם את הבקבוקים מניות על הספסל במשך 24-48 שעות לאפשר את התאים אצות להתיישב על ידי הכבידה.
    הערה: התאים שיוחסו ישמש הבא לחסן photobioreactors עמודה על בועה. אם אוסף תאים מהירה יותר היא הרצויה, ייתכן centrifuged תאים ב g לא יותר מ- 1,000 x כדי לאסוף תאים.

3. טיפוח Microalgae בתוך בועה עמודה Photobioreactors

  1. יום לפני חיסון ביוריאקטור, הכנת המדיה המתאימה, העברת 200 מ ל (או לנפח הרצוי) כדי photobioreactor עמודה על בועה צינורות (הכלאה צינורות). אוטוקלב צינורות עם מדיית ומכסים פרקו במקום.
    הערה: אם באמצעות בשפכים כמו מדיום הגידול, החיטוי רוקן ריאקטורים ולהוסיף בשפכים סטרילי-מסוננים (אם התרבות axenic רצוי).
  2. לרכז את המניה microalgae שיוחסו על-ידי הסרת את תגובת שיקוע באמצעות משאבה ואקום. להשאיר פחות מ 100 מ של מדיום כל בקבוק אלא למנוע הסרת שיוחסו אצות.
    הערה: לנהל הליך זה בתוך BSC ופעל סטרילי טכניקה. ניתן לבנות מנגנון ואקום פשוטה באמצעות flask ואקום או בקבוק. מתאים על פיפטה סרולוגית סטרילי על הקצה של הצנרת.
  3. להשעות ולהעביר את slurry אצות צינורות צנטריפוגה סטרילי 50 מ. צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות נוספות להתרכז אצות.
  4. ב BSC, הסר את תגובת שיקוע מספיק כדי להשיג את הנפח הכולל של ~ 80 מ של אצות תרכיזים לבעלי 12 photobioreacters. הימנע לשאוב החוצה בגדר. להעביר את תרכיז אצות במיכל סטרילי (או הבקבוק מניות אצות בשימוש).
  5. להוסיף 6 מ של אצות slurry לתוך כל photobioreactor עם פיפטה סרולוגית סטרילי 10 מ"ל.
  6. מסנן סטרילי (0.2 מ מ מזרק או אבק מסנן) ולהוסיף כמויות מתאימות של כל תרכובות אחרות (למשל ויטמין מניות) אשר לא יכול להיות בלוק.
  7. מערבולת ריאקטורים לערבב אצות לתוך האמצעי.
  8. שואבים מדגם 2 מ"ל כל ביוריאקטור באמצעות פיפטה סרולוגית העברת צינור 2 מ"ל. לאסוף דגימה 2 מ"ל (ב BSC) כל 24 שעות כדי לעקוב אחר ההתקדמות תרבות. בדוק המדגם לשימוש pH לבדוק רצועות וכוונן את הכור כנדרש עם 3 או M NaOH או 3 M HCl.
  9. להדק את המכסים ביוריאקטור ומניחים כל ריאקטורים לאמבטיה דגים טנק מים. התאם את לערבב, CO2ו תאורה לרמת המתאימה עבור המין האנושי. לסובב את המיקום ביוריאקטור בכל יום לאחר דגימה (שלב 3.8).
  10. µL 200 של כל תרבות מדגם שהפקידים חלות על בארות microplate טוב 96. למדוד צפיפות אופטית (OD) ב 550 ננומטר, 680 ננומטר.
    1. ביום האחרון של תקופת תרבות, למדוד OD תחת דילול שונים גורמים (למשל, סימן x 1, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x ו- 32 x) להקים מתאם בין OD, ומשקל יבש בפועל לאחר הקטיף (שלב 4).
  11. Centrifuge הצינור מדגם 2 mL ב g x 12,000 במשך 5 דקות.
  12. לסנן את תגובת שיקוע דרך 0.2 µm מזרק שאינו סטרילי מסנן ולאחסן את תגובת שיקוע (וגלולה במידת הצורך) ללא גבוה מ-20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך וניתוחים מאוחר יותר של שינויים בהרכב מדיה.

4. הקציר, להקפיא ייבוש של ביומסה Microalgal

  1. למדוד את נפח קבוע של אצות התרבות של כל ביוריאקטור עם משורה (למשל, 160 מ ל מ מגיב ביולוגי זה 200 מ ל במקור הכיל בינוני), להעביר לתוך צנטריפוגה בקבוקים. יש לשטוף את משורה עם dH2O בין כל אחת מהמידות.
  2. צנטריפוגה ב 4,696 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע על ידי בקפידה לשאוב אותה החוצה.
  3. להעביר את החבילות צינורות שכותרתו 50 מ. יש לשטוף את צנטריפוגה בקבוקים עם dH2O, ואת העברת התוכן כדי הצינורות 50 מ. ודא שעוצמת הצינור הכולל אינו עולה על 45 מ.
  4. לשטוף את כדורי אצות עם dH2O להסיר את מלחי.
    1. Centrifuge צינורות 50 מ ל- g x 4,696 עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
    2. להוסיף 40 מ ל dH2O כל שפופרת 50 מ; מערבולת לערבב. תגובת שיקוע צנטריפוגה שוב ב- g x 4,696 עבור 5 דקות וזורקים.
    3. חזור על שלב 4.4.2 שוב.
  5. תווית ולשקול ריק 15 מ"ל צנטריפוגה צינורות על איזון 4 מקומות אחרי הנקודה העשרונית (תווית של המכסה וגם צינור, לשקול אותם יחד). שוקלים שפופרת אחת לכל התרבות אצות. שוקלים כל שפופרת 15 מ"ל פעמיים כדי למזער את השגיאה.
  6. לאחר השטיפה האחרונה למחוק את תגובת שיקוע, ולהוסיף 7.5 mL של dH2O כל שפופרת 50 מ. מערבולת והעברה אצות slurries לתוך mL 15 מראש שנשקל צינורות. לשטוף את הצינורות 50 מ ב- dH נוספים2O ולהעביר נוזל צינורות 15 מ"ל. הימנע העולה על 12 מ של הנפח הכולל את החצוצרות שלה 15 מ"ל.
  7. Centrifuge צינורות 15 מ"ל ב g x 4,696 במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע. להקפיא את הצינורות עם כדורי ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות כהכנה ליופיליזציה.
  8. להקפיא יבש למשך הלילה או עד מיובשים.
  9. שוקל ולהקליט את צינורות 15 מ"ל להקפיא מיובש עם אצות.

5. השומנים חילוץ באמצעות שיטה שונה Folch בגודל24

  1. שוקלים לצאת 20 מ ג של ביומסה אצה הליחה לתוך 2 mL פקקי בורג צינור פוליפרופילן (הסימון תווית היצרן כדי להבטיח מוצר מתאים עקירות חרוז).
  2. להוסיף 1.5 מ של הממס Folch (2:1. כלורופורם/מתנול) כל שפופרת 2 מ"ל (המכיל 20 מ ג של הליחה אצות). שופכים ~0.5 mL חרוזי קריסטל/סיליקה (0.5 מ"מ) לתוך כל שפופרת עד רמת הנוזל בצינור מגיע 2 מ"ל.
    התראה: להתמודד עם הכלורופורם מתנול בשכונה fume להימנע נושם את האדים או עור קשר.
  3. Homogenize הדגימות אצות טחנת חרוז 20 s במהירות של 6.5 צינורות העברה m/s לקרח ל 30 s כדי להירגע דגימות. חזור עוד חמש פעמים לחלץ באופן מלא שומנים.
  4. לסנן את homogenate באמצעות מזרק 5 מ ל המכיל דיסק רשת שינוי של תיל מפלדת (#60 mesh) לאמץ את החרוזים, אוסף פילטרט של צינור 15 מ"ל.
  5. לשטוף את החרוזים עם 1.5 מ של הממס Folch, רבואסורקל נוזל עם המזרק לפי הצורך. חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולאסוף את כל פילטרט של צינור 15 מ"ל, מניב נפח סופי של 6 מ.
  6. הוסף 1.2 מ של 0.9% (w/v) פתרון NaCl תמצית Folch בצינור 15 מ"ל ו מערבולת לערבב היטב.
    הערה: אם יש צורך, יותר Folch ממס ניתן לרחוץ חרוזים (שימוש 0.2 x נפח שטיפת הכולל של 0.9% NaCl פתרון לזירוז שלב ההפרדה).
  7. Centrifuge צינורות 15 מ"ל ב g 6,000 x עבור 5 דק רשומה האחסון (ירוק) שלב כלורופורם התחתון הקרוב ביותר מ 0.1 ל באמצעות קווים בצד הצינור 15 מ"ל. להעביר את שלב תחתון בקבוקון זכוכית (עם המכסה) באמצעות כוס פסטר פיפטה.
  8. אחסן את השומנים ב-20 ° C או (-80 ° C אם קיימות תוכניות לשימוש זו תמצית ניתוח חומצת שומן).

6. נייטרלי השומנים Assay באמצעות שיטת Microplate (משנת היגינס. et al. 201422)

  1. להכין מלאי פתרונות. הכינו 10 מ ל 1 מ"ג/מ"ל שמן צמחי רגיל ב כלורופורם ולאחסן ב-20 ° C.
    הערה: שמן צמחי כלשהו עשוי לשמש assay הזה כי זה לא רגיש סוגים של חומצות שומן. הכינו 10 מ"ל של 200 µg/mL פתרון הנילוס אדום דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולאחסן בחושך בטמפרטורת החדר.
  2. מחממים מראש בלוק microplate יבש עד 55 מעלות צלזיוס בשכונה fume. בזמן זה הוא חימום, לדלל את השומנים תמציות ואת שמן צמחי רגיל מקופלים ל- 3 עם מתנול.
    הערה: דילול זה יכולים להשתנות בהתאם לתוכן השומנים של האצות, אבל רמה זו פועלת היטב עבור רוב כלורלה.
  3. עבור כל דגימה מדולל, להוסיף 80 µL microplate טוב פוליפרופילן 96 ב ארבע פעמים.
    אזהרה: השימוש plasticware פוליסטירן לא מומלץ לשימוש עם ממיסים אורגניים.
  4. לחומר ריק, החל µL 80 של 2:1. מתנול/כלורופורם ב ארבע פעמים. תקנים, להוסיף 10, 30, 60, 90, 120 µL של שמן ירקות מדולל כסטנדרט ארבע פעמים.
  5. מקום microplate של תנור בלוק יבש ב 55 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות עד הממס כל התאדו. בעוד הממס מתאדה, להכין את העבודה הנילוס אדום פתרון (הצורך 200 µL של 1 µg/ml פתרון לכל צלחת טוב). לדוגמה, סט מלא של סטנדרטים ודוגמאות 12 דורש מ 16 ל 1.0 µg/mL פתרון; להכין על ידי המסת µL 80 של המניה µg 200/mL (ב דימתיל סולפוקסיד) לתוך 16 מ ל dH2O.
  6. להסיר את microplate מהגוש חימום ומצננים לטמפרטורת החדר. להוסיף 30 µL של אלכוהול איזופרופיל מכל קידוח ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. ודא כל הערוצים פיפטה ערבוב הפתרון resuspending של שומנים, מניב נוזל ירוק הומוגנית.
  7. להוסיף 200 µL של הנילוס אדום פתרון (1 µg/mL) כל טוב, פיפטה למעלה/למטה 10 פעמים כדי לערבב. דגירה את הצלחת. בשביל 5 דקות בטמפרטורת החדר. תוך כדי המתנה, להכין פתרון 50% אקונומיקה על ידי ערבוב אקונומיקה (6% תת-כלורי) עם dH220 או µL בכל טוב יש צורך. הכנת 3 מ"ל של אקונומיקה 50% מספיקה עבור סט מלא של סטנדרטים ודוגמאות 12.
  8. להוסיף 20 µL של פתרון אקונומיקה microplate בכל טוב, פיפטה לאורך 5 פעמים כדי לערבב היטב. דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. לאחר 30 דקות, לקרוא פלורסצנטיות הדגימות בכל 5-10 דקות-530 ננומטר עירור/575 nm פליטה עם הפסקת אוטומטי מוגדר כ- 570 ננומטר עד האות מדגימות אצות מייצבת. בדרך כלל, 60 דקות של דגירה הכולל מספיקה.
  10. ליצור עקומת כיול בסטנדרטים שמן צמחי (בטווח של 0-40 ng באר/נפט).
    הערה: פונקציה קווית להתאים זו פועלת היטב עבור נמוך (< 30 ננוגרם/טוב) שמן ריכוזים של פולינום מתאים עשוי לשמש אם הסטנדרט עולה 30 ננוגרם/טוב. השתמש המתאם הזה כדי לכמת את השומנים נייטרלי ב הבארות הדגימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליך זה מניב קורס זמן של נתוני צפיפות אופטית אצה-OD 550 ננומטר (איור 4A). צפיפות אופטית ואת משקל יבש ריכוז נתונים יכול להיות בקורלציה (איור 4B). זו מושגת על-ידי הראשונה חישוב ריכוז האצות משקל יבש הסופי לאחר השלב להקפיא ייבוש. בשלב הבא, הצפיפות האופטית של תרבות דילול טורי (שבוצעה ביום האחרון של דגימה) וריכוזי בפועל משקל יבש ניתן מתואמים. עבור ריכוזים תא נמוכה, ניתן להשתמש מתאם ליניארי ואילו על ריכוז גבוה של התא, מתאם פולינום הסדר השני עשוי לשמש. מומלץ ליצור קשר נפרדות עבור כל תנאי התרבות. לבסוף, המתאם ניתן ליישם את הנתונים צפיפות אופטית כמובן זמן כדי לקבל עקומת גדילה משקל יבש (איור 4C). בניסוי זה דוגמה, Auxenochlorella protothecoides (UTEX 234125) היה תרבותי תחת ארבעה תנאים: שליטה axenic תרבויות גדל על טרי N8-NH4 בינוני21, בתרבות שיתוף עם החיידק Azospirillum brasilense, מדיום בתוספת 50 מ"ג/ליטר של חומצה אינדול-3-אצטית, בילה על בינוני מ brasilense א. Brasilense א ידוע לייצר חומצה אינדול-3-אצטית, גידול הצמח קידום הורמון, גם מקדם צמיחה microalgae מסוימים. עם זאת, ב- 50 מ"ג/ליטר, הטיפול העתיקות עכבות לחלוטין צמיחה protothecoides א . כתוצאה מכך, נתוני צפיפות אופטית היה זמין, אך כמות האצות היה די כדי להשיג ריכוז מדויק משקל יבש. במקרה זה, ניתן להחיל את המתאם עבור התרבות שליטה או נתוני צפיפות אופטית ייתכן שידווח ישירות. כי יתר הנתונים נאספו על שני 550 ננומטר, ספיגת nm 680, dataset גם יכול לשמש עבור המתאם בין יתר משקל יבש. בדרך כלל, OD 550 משמש כי זה אינה כוללת כמעט לגמרי את ספיגת של כלורופיל26, ובכך לדכא הטיה מפני שינויים בתוכן כלורופיל. לעומת זאת, OD 680 כולל את ספיגת של כלורופיל, יחסי גבוה של יתר 680/550 מצביעים על תוכן כלורופיל גבוה האצות. איור 4D מציג קבוצה של 12 תרבויות אצות גדל photobioreactors עמודה בועה. אפילו עם רק שלושה ביולוגי משכפל לכל טיפול, סטיות תקן צמוד הושגו, המאפשרות רגישות גבוהה להבדלים בין טיפולים.

Figure 4
באיור 4. גידול אצות תוצאות photobioreactors עמודה בועה. (א) הצפיפות האופטית (550 ננומטר) עקומת הגדילה של Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341) מראה תרבויות הזנת המנוח גידול לוגריתמי-120 שעות. שליטה תרבויות היו מבוגרים טרי בינוני4 N8-NH טיפול 1 תרבויות משנה א protothecoides , Azospirillum brasilense גדל על N8-NH טרי4 בינוני, טיפול 2 הוא axenic protothecoides א גדל על N8-NH בינוני4 בתוספת חומצה אינדול-3-אצטית 50 מ ג/ליטר (רשות העתיקות), וטיפול 3 הוא גדל על האמצעי בילה brasilense א protothecoides א axenic. המדיום בילה הוכן על ידי culturing brasilense א במשך 96 שעות על N8-NH בינוני4 בתוספת חומצה מאלית 2 g/L. תאים הוסרו, ואת המדיום היה מחדש שהושלם עם אמוניום כדי לשחזר את רמתו ההתחלתית, pH היה מותאם, המדיום היה מסונן סטרילי (μm 0.2). שימו לב כי הטיפול 50 mg/L רשות העתיקות עכבות לחלוטין גידול אצות. (B) המתאם ' עקומות ' בין יתר 550 ננומטר וריכוז משקל יבש הסופי באמצעות התאמה פולינום הסדר השני. אין מתאם מוצג לטיפול 2 כי יכול להיות שנקטפו ובלי אצות בסוף תקופת תרבות. (ג) יישום של המתאם פולינום בנתונים צפיפות אופטית התשואות עקומת גדילה לריכוז משקל יבש בציר ה-y. המתאם תרבות שליטה הוחל על הנתונים OD לטיפול 2. קווי שגיאה הן סטיות תקן מבוסס על 3 ביולוגי משכפל. (ד) תמונה של photobioreactors עמודה בועת זמן קצר לאחר חיסון תרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

השומנים נייטרלי הנתונים מוצג עבור שני ניסויים בדוגמה באיור5. זה וזמינותו הוכח לתאם עם תוכן שומני נייטרלי, במיוחד triacyglycerol (תג) תוכן. ניתן לראות על-ידי השוואת וזמינותו השומנים נייטרלי (איור 5A) על צלחת כרומטוגרפיה שכבה דקה המתאימים (איור 5B). ניתן לראות מגמה זהה גם הניסוי השני (איור 5C ו 5 D). בכל הניסויים, שמן קנולה היה לשמש תקן וכתוצאה מתאם ליניארי (R2 של 0.98 עבור הניסוי הראשון, 0.99 השנייה) בין קרינה פלואורסצנטית והמסה שמן קנולה בבאר. שים לב כי אם כל דוגמאות יש תוכן שומני נמוך, אז הנקודה הגבוהה ביותר או שניים על התקן מועמדת להדחה. המתאם הזה יכול לשמש כדי לחשב את כמות השומנים נייטרלי (µg) בכל אחד מן הבארות מדגם אצות. הפח המוני שמן ואז להמיר ריכוז תמצית ליפידים המוחל על microplate טוב. ערך זה מוכפל הגורם דילול בשימוש (למשל, 3 x) כדי להשיג תכולת השומנים נייטרלי Folch המקורי תמציות. ריכוז זה מוכפל ואז עוצמת הקול של התמצית (צריך להיות סגור עד 4 מ"ל), ואז מחולק על ידי המסה הכוללת של ביומסה אצות המשמש להפקת השומנים (צריך להיות קרוב 20 מ ג). התוצאה היא תכולת השומנים נייטרלי microalgae.

Figure 5
איור 5. השומנים נייטרלי נתונים המתקבלים תרבויות של כלורלה sorokiniana (UTEX 2714). תוכן שומני נייטרלי (A) (% משקל יבש) עבור אצות ניסוי 1 ב אצות אשר היו בוגרים עבור 120 שעות. התרבות שליטה היה axenic בתרבית על N8 טרי בינוני23, טיפול 1 הייתה תרבות משותפת של sorokiniana ג ו brasilense א . טריים N8 בינוני, טיפול 2 היה בינוני N8 טרי בתוספת 50 mg/L רשות העתיקות, טיפול 3 בוזבז בינוני מ brasilense א. המדיום בילה היה מוכן על ידי culturing brasilense א 96 שעות במדיום N8 בתוספת 2 g/L חומצה מאלית, הסרת תאים, שכשהם חנקתי אבוד, התאמת pH, סטרילי סינון המדיום (0.2 μm). בניגוד protothecoides א, 50 מ"ג/ליטר של רשות העתיקות לא לעכב sorokiniana ג הצמיחה. (B) TLC צלחת התמונה עבור ניסוי בסה כ מציג 1 תג יחסית שפע. תוכן שומני נייטרלי (C) (% משקל יבש) עבור אצות בניסוי 2 אשר היו הטיפולים אותו כמו הניסוי 1 אבל התאים נבצרו לאחר 72 שעות של צמיחה. (ד) TLC תמונה צלחת לשפע הניסוי מראה 2 היחסי תג. קווי שגיאה הן סטיות תקן מבוסס על 3 ביולוגי משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בנוסף, זה תרגול טוב כדי לחשב את המקדם של וריאציה (סטיית תקן מחולק הממוצע) של המקראות פלורסצנטיות raw על פני משכפל טכני כל ב וזמינותו השומנים נייטרלי. בהנחה משכפל טכניות בוצעו ב microplate ב ארבע פעמים כאמור בהליך, המקדם של וריאציה בדרך כלל לא יעלה על 10%. מקדמים גבוהים של וריאציה הם בדרך כלל התוצאה של ערבוב המסכן (במיוחד בעת הוספת אלכוהול איזופרופיל) ושימוש שעשוי להיות לא מדויק פיפטה רב-ערוצי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיקול החשוב ביותר כאשר culturing אצות היא הבנה של צרכים הספציפיים של אורגניזם או קבוצה של אורגניזמים. האצות שיטת הטיפוח המתוארים כאן יכול לשמש כדי תרבות מגוון רחב של אצות אבל הגורמים והאביוטיים ספציפי (טמפרטורה, מדיה, pH, עוצמת האור, רמה2 CO, לערבב קצב) צריכים להיות מותאמים לצרכים של האורגניזם. שימו לב שאר הפרמטרים המתוארים כאן שימשו לגידול של כלורלה , Auxenochlorella. אורגניזמים אלה הם עניין תעשייתי כי הם סובלניים מזין גבוה, אור של רמות הטמפרטורה27. עם זאת, ניתן להפחית רמות האור דרך ההסרה של נורות פלורסנט, מחזור יום/לילה יכול להיות מותאם כדי לייצג seasonality. באופן דומה, מחממי מים ניתן להפעיל למעלה או למטה, בקרת הטמפרטורה אמבט מים במערכת. בעוד המערכת המתוארת כאן אינה מעסיקה לתכונה כזו, זה אפשרי להרגע המרחצאות מים דגים טנק מטמפרטורת החדר דרך מערכת הקירור בעלות נמוכה. מקום דלי מים, מקרר קטן, להשתמש עם מהירות משתנה משאבה כדי לשאוב מים מתוך דלי מים קרים לאקווריום ובחזרה. מהר יותר את קצב השאיבה, יהפוך קר המאגר טנק דגים.

למרות מערכת טיפוח אצות תספק בדרך כלל תוצאות עקביות, יש כמה אזהרות חשובות שיש להתייחס. הראשון הוא מים ולהתפוצץ המתרחשת באירוע כי מערכת אוורור חוויות אובדן פתאומי של לחץ (למשל, מתאים פוצצו או כשל מדחס אוויר). הלחץ שנמצא קולטי אדים ידחוף מכשיר אדים מים לאחור דרך הצנרת, לרבות באמצעות רוטמטר. התקנת מלכודת במעלה או זרם אחורי preventer יכול לעזור. שימו לב כי ולהתפוצץ לא תשפיע ריאקטורים עצמם כי הם פועלים בלחץ אטמוספרי. בדיקה שגרתית של צנרת, אביזרי יכול לעזור להקל על כשלים במערכת. שיקול חשוב נוסף הוא לבחון באופן שגרתי, להחליף מסנני אוויר ובדוק שסתומים-ריאקטורים. הקפד להמלצה של היצרן עבור מספר מחזורים אוטוקלב המותר. הדבר חשוב במיוחד אם התחזוקה של תרבויות axenic הינה קריטית הניסוי. לבסוף, מומלץ לרכוש או לבנות על מתלה autoclavable להעברה בטוחה של ריאקטורים בין אמבטיות מים, החיטוי, אבטחה בארון. מתלה תיל מפלדת יכול לשרת מטרה זו.

מערכת ביוריאקטור המתוארים כאן יש מספר מגבלות. מגבלה מפתח הוא הצורך להתמודד עם הכורים בארון אבטחה באמצעות טכניקה סטרילי. הכורים חוסר יציאת ולהתפוצץ נגד דגימה, לדרוש מהמשתמש לעבור את הכור אבטחה ארון מדגם בלי לזהם את התרבות. הכורים גם לדרוש ידנית pH הקריאה וכוונון אשר מציגה פוטנציאל טעות אנוש.

מערכת ביוריאקטור המתוארים כאן מילוי משרה בין טיפוח פשוטה את הבקבוק ריאקטורים בשליטה מלאה. ביוריאקטור המערכת פותחה בתגובה צורך תוצאות עקביות יותר מאשר היו ניתנים להשגה באמצעות בקבוקים. הנתונים מראים כי מערכת זו מייצרת תוצאות צמיחה עקבית כאשר פעלו כראוי. שימו לב כי בקבוקי קצף היו מועסקים במסגרת ההליך לטיפוח של מניות אצות, אבל זה נעשה רק כדי לייצר inoculum לניסוי. זה מתקבל על הדעת כי בקבוקים מלאי היו איחדו עבור חיסון, ומכאן השתנות בקרב כורי אינה מהווה בעיה.

כמו אצות חוקרים רבים מעוניינים מעקב גדילה והן תוכן שומני נייטרלי, כללנו את הגישה שלנו כדי מדידה שני הפרמטרים האלה כאן. השימוש צפיפות אופטית כדי למדוד את הצמיחה הוא יאושם והוא ללא תחרות בפשטותו. אולם, מתאמים בין משקל יבש צפיפות אופטית להשתנות עם הזמן, תלויות תרבות תנאים. מומלץ ליצור משוואה המתאם עבור כל טיפול ניסיוני בתוך אצוה ניסיוני. זה אפשרי במסגרת ההליך המוצע להקפיא ייבוש אצות ניתן להשיג לאחר בכל ניסוי תרבות. הנחה קריטית של הגישה צפיפות אופטית היא כי הקשר בין צפיפות אופטית לבין משקל יבש מחזיקה קבוע במהלך צמיחת אצווה. כל עוד לחריגות הנחה זו הם קטנים, התוצאה תהיה מדויקת למדי. הדיוק היחסי יכול להיות מוערך על ידי השוואה בין ריכוז משקל יבש אצות מחושב בזמן אפס. בהנחה תרבויות היו מעורבים. ובכן, pipetting היה מדויק, שצריך כל התרבויות באותה צפיפות חיסון ראשוני. גם יכול להיות מאותגר הגישה צפיפות אופטית כאשר רקע ספיגת של המדיום הוא גבוה (קרי, בעת עבודה עם wastewaters מסוימים). חיסור של ספיגת בינונית (לפני חיסון) מקריאה כל יתר יכול לעזור עם בעיה זו.

מיצוי של ליפידים מהאצות יבש עוקב אחר מבוססת היטב Folch בגישה21,24; עם זאת, ישנם שיקולים חשובים. אצות שונים מינים יש קירות התא שונים בדרגות שונות של קשיחות. החרוזים זירקונים/סיליקה המשמש כאן הם חדים, עוצב כדי לחדור חזק, קירות התא רב-סוכר. סוג חרוז רך יותר (למשל, זכוכית) או פחות חרוז הפרעה מחזורי עשוי לשמש על אצות עם קירות התא חלש יותר. עם זאת, כלל אצבע הוא בגדר התא שנוצר לאחר החילוץ צריכות להיות ללא פיגמנט, המציין כי כל כלורופיל נעקר. אחד המקורות הנפוצים ביותר של כשל במהלך השלב שאיבת שומנים בדם מתרחשת עקב פסולים להקפיא ייבוש. אם המדגם נמס ב מייבש ההקפאה לפני זה יבש לחלוטין, התוצאה תהיה גלולה קשה מאוד, כהה, שעווה. זו היא התוצאה של תאים lysed בתנאים ואקום של הקפאת מייבש. בגדר עשוי להיות שקל להשיג משקל יבש, אבל זה לא יכול לשמש לחילוץ השומנים החלקיקים שעווה לא להתפרק Folch הממס. כדי להבטיח כי להקפיא ייבוש תמיד דוגמאות רך, עדין ואבקתי התשואות, זה חיוני כדי להקפיא את כל דוגמאות ל-80 מעלות צלזיוס ומעבירים אותם מיד אל ההקפאה מייבש. יתר על כן, באמצעות מצלמות-מיקרוסקופים (עם חור תחב בה) ולא התיר צינור העפעפיים יבטיח כי לחות ללא הרף שלהסיר מדגם לפני זה מפשירה.

וזמינותו השומנים נייטרלי המתוארות בהליך זה שפורסם בעבר, כולל דיון של השומנים חלופי מבחני22. עם זאת, כמה שיפורים חשובים שנעשו עבור אותה שגרה מאז הפרסום. בעיקר, הריכוז פתרון אדום הנילוס היה עלה מ µg 0.5/mL ל 1 µg/mL. השפעת שינוי זה היה אות בעוצמה גבוהה יותר, הדיר משופר ו הדחה של אותות ירידה לאורך זמן במהלך תקופת הדגירה. התוצאות מציגות וזמינותו משווה היטב על התוצאות של כרומטוגרפיה איכותי שכבה דקה. Assay זו פותחה ואומת באמצעות מינים שונים של כלורלה , Auxenochlorella כך את תחולתן מינים של הרכב שונה באופן משמעותי טרם נקבע. כל פיגמנט ירוק לגמרי להסירם מן וזמינותו במהלך הדגירה אקונומיקה, שמוביל והמדגמים צהוב בהיר או חיוור מאוד. שימו לב גם כי תמציות השומנים הנמצאים מפורק (כפי שצוין על-ידי שינוי מירוק צבע חום) בדרך כלל להיכשל לספק תוצאות מדויקות זה וזמינותו. לכן חיוני כדי לאחסן את השומנים דגימות ללא גבוה מ-20 ° C בחושך.

השיטות המובאות כאן עבור culturing אצות, מדידת הצמיחה, לכימות נייטרלי ליפידים שימושיים עבור מגוון של יישומים הנדסיים של אצות, אבל מתאימים במיוחד עבור מחקר על biofuel הייצור. שיטות אלה נמצאים בשימוש גם ללמוד עיכוב גדילה אצה wastewaters28 כמו גם השפעות של האורגניזם אינטראקציה על גידול והרכב של microalgae.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

תמיכה עבור מחקר זה סופק על ידי משרד החקלאות הלאומית המכון של המזון, החקלאות פתח פרוייקט ALA0HIGGINS משרדי אוניברסיטת אובורן של פרווסט סגן הנשיא למחקר, את סמואל גין להנדסה. גם העניקה תמיכה NSF להעניק CBET-1438211.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35x300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars - long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars - medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100x15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24x2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
  2. Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
  3. Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
  4. Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
  5. Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
  6. Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
  7. Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
  8. Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
  9. Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
  10. Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
  11. Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
  12. Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
  13. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  14. Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
  15. Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
  16. Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
  17. Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
  18. Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
  19. Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
  20. Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
  21. Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
  22. Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
  23. Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
  26. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
  27. de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
  28. Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 143 Microalgae photobioreactor טיפוח שאיבת שומנים בדם שומנים נייטרלי דלק ביולוגי
טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T.… More

Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter