Her presenterer vi en protokoll for å konstruere lab skala boble kolonnen photobioreactors og bruke dem til kultur mikroalger. Det gir også en metode for bestemmelse av kultur vekst og nøytrale lipid innhold.
Det er betydelig interesse i studiet av mikroalger for tekniske applikasjoner som produksjon av biodrivstoff, høy verdi produkter, og for behandling av avfall. Som de fleste nye forskningsinnsats begynner på laboratoriet skala, er det behov for kostnadseffektive metoder for dyrking av mikroalger på en reproduserbar måte. Her kommuniserer vi en effektiv tilnærming til kultur mikroalger i laboratoriet skala photobioreactors, og å måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Instruksjonene finnes også på hvordan du setter opp photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismene Chlorella og Auxenochlorella, kan dette systemet tilpasses for å dyrke en rekke mikroalger, inkludert co kulturer av alger med ikke-alger arter. Lager kulturer dyrkes først i flasker for å produsere inoculum for photobioreactor-systemet. Alger inoculum er konsentrert og overført til photobioreactors for dyrking i satsvis modus. Eksempler er samlet daglig for optisk densitet målingene. På slutten av batch kultur, celler er høstet av sentrifuge, vasket, og fryse tørket å få en endelig tørrvekt konsentrasjon. Siste tørrvekt konsentrasjonen brukes til å lage en sammenheng mellom optisk densitet og tørr vekt konsentrasjonen. En modifisert Folch metode brukes deretter til å hente totalt lipider fra frysetørket biomasse og ekstrakt er assayed for sin nøytrale lipid innhold ved hjelp av en microplate analysen. Denne analysen er publisert tidligere, men protokollen skritt ble tatt her for å markere viktige trinnene i fremgangsmåten hvor ofte oppstår. Bioreactor systemet beskrevet her fyller en nisje mellom enkel kolbe dyrking og fullt kontrollert kommersielle bioreactors. Selv med bare 3-4 biologiske replikerer per behandling, vår tilnærming til dyrking alger fører til tett standardavvik i vekst og lipid analyser.
Anvendelsen av mikroalger i ingeniørfag og bioteknologi har tiltrukket stor interesse i de senere år. Mikroalger blir undersøkt for bruk i avløpsvann behandling1,2,3,4, biodrivstoff produksjon5,6,7,8, og produksjon av nutraceuticals og andre høy verdi produkter9,10. Alger er også genetisk endres til høyere priser i et forsøk på å forbedre deres egnethet for bestemte tekniske programmer11,12. Dermed er det stor interesse eksperimentering med industrielt relevante organismer i kontrollerte innstillinger. Formålet med denne metoden er å kommunisere effektiv tilnærming til kultur mikroalger i et kontrollert laboratoriemiljø og måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Forbedre vekst priser og nøytrale lipid innhold av mikroalger har blitt identifisert som to viktige flaskehalser mot kommersialisering av alger biodrivstoff13.
En rekke tilnærminger har blitt brukt til kultur alger for eksperimentelle formål. Generelt, kan disse metodene deles mellom store utendørs dyrking og småskala innendørs dyrking. Utendørs dyrking i photobioreactors og åpne dammer er egnet for eksperimentering å skalere opp prosesser som er allerede påvist i laboratoriet skala (f.eks å teste skalaen opp av en ny høy-lipid stamme av alger)14. Men innendørs småskala dyrking er egnet når utvikle nye eller forbedrede alger stammer eller utføre eksperimenter sikte på å forstå biologiske mekanismer. I disse siste tilfellene, er en høy grad av eksperimentelle kontroll nødvendig å tease ut subtile endringer i biologisk atferd. Derfor, er axenic kulturer ofte nødvendig for å minimere de komplekse biotiske faktorene assosiert med andre organismer (f.eks bakterier, andre alger) som uunngåelig vokse i store utendørs systemer. Selv når studere interaksjoner mellom alger og andre organismer, har vi funnet at bruk av svært-kontrollerte eksperimentelle forhold er nyttig når undersøke molekylær utveksling mellom organismer15,16,17.
Innenfor kategorien av småskala innendørs Algedyrking har en rekke tilnærminger brukt. Kanskje er den mest brukte metoden å dyrke alger i Erlenmeyer flasker i en shaker tabell under en lys bank18,19. Utveksling av oksygen og CO2 foregår ved passiv spredning gjennom en skum plugg i toppen av flasken. Noen forskere har forbedret dette oppsettet gjennom aktiv lufting av flasker20. En annen tilnærming er å dyrke alger på flasker, mikset av rør bar og aktive lufting. Til tross for sin enkelhet, har vi funnet at bruk av kolber og flasker fører ofte til inkonsekvente resultater blant biologiske gjentak. Antagelig dette skyldes posisjon effekter – forskjellige posisjoner motta ulike mengder av lys, som også påvirker interne reaktoren temperaturer. Daglig rotasjon av reaktorer til nye plasseringer kan hjelpe, men ikke avhjelpe problemet fordi visse stadier av alger vekst (f.eks tidlig eksponentiell) er mer følsomme for posisjonelle effekter enn andre (f.eks Logg fase).
På motsatt side av spekteret av teknologisk raffinement er fullstendig kontrollert kommersielle photobioreactors. Disse systemene kontinuerlig overvåke og justere forhold i reaktoren å optimalisere algene oppblomstringen. De har programmerbare belysning, sanntid temperaturkontroll og pH-kontroll. Dessverre de er dyre og vanligvis koster flere tusen dollar per reaktoren. Mest vitenskapelige og tekniske tidsskrifter krever biologiske replikering av resultater, nødvendiggjør kjøp av flere bioreactors. Vi presenterer her en boble kolonnen reaktoren system som broer skillet mellom enkel (kolbe) og sofistikert (fullt kontrollert bioreactor) tilnærminger for lab skala Algedyrking. Boble kolonnene bruker stigende gassboblene å lette gassutveksling og bland reaktoren. Denne tilnærmingen gir en viss grad av kontroll over lys og temperatur, men gjør det på en måte som er kostnadseffektiv. Videre har vi funnet dette systemet å gi svært konsekvente resultater blant biologiske gjentak, redusere antall biologiske gjentak nødvendig for å få statistisk signifikante resultater sammenlignet med kolbe eller flaske tilnærming. Vi har også brukt dette systemet til vellykket dyrke blandinger av alger og bakterier21. I tillegg til Algedyrking skissere vi en prosedyre for å måle nøytral lipid innholdet i kulturperler alger. Sistnevnte har vært publisert andre steder22, men vi inkluderer fremgangsmåten her for å gi trinnvise instruksjoner for hvordan du bruker den med hell.
Det viktigste hensynet når dyrking alger er en forståelse av behovene til organisme eller gruppe organismer. Algene dyrking systemet beskrevet her kan brukes å kulturen en rekke alger men bestemte abiotiske faktorer (temperatur, media, pH, lysintensitet, CO2 -nivå, lufting rate) må justeres for organismen. Merk parameterne som beskrives her ble brukt til dyrking av Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismene er industrielle interessante fordi de er tolerante høyt næringsinnhold, ly…
The authors have nothing to disclose.
Støtte for denne forskningen ble levert av USDA National Institute of Food og landbruk Luke prosjektet ALA0HIGGINS og Auburn University kontorene til Prost, direktør for forskning og i Samuel Ginn College of Engineering. Støtte ble også levert av NSF gi CBET-1438211.
Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
Check valves | VWR | 89094-714 | |
Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
Light timer | Walmart | 556393626 | |
Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
Supplies and reagents for culturing algae | |||
0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
Equipment | |||
Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
Vortex mixer | VWR | 10153-838 |