Summary

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para construir laboratório-escala bolha coluna fotobiorreatores e usá-los para a cultura de microalgas. Ele também fornece um método para a determinação da taxa de crescimento da cultura e do conteúdo de lipídios neutros.

Abstract

Há grande interesse no estudo das microalgas para aplicações de engenharia, tais como a produção de biocombustíveis, produtos de alto valor e para o tratamento de resíduos. Como a maioria dos novos esforços de pesquisa começam em escala de laboratório, há uma necessidade de métodos de baixo custo para cultivo de microalgas de forma reproduzível. Aqui, nós nos comunicamos uma abordagem eficaz para cultura de microalgas em fotobiorreatores escala de laboratório e para medir o crescimento e o conteúdo de lipídios neutros de que algas. Também estão incluídas para instruções sobre como configurar o sistema de photobioreactor. Embora os organismos de exemplo são espécie de Chlorella e Auxenochlorella, este sistema pode ser adaptado para cultivar uma grande variedade de microalgas, incluindo co culturas de algas com espécies não-algas. Culturas-mãe primeiro são cultivadas em garrafas para produzir inóculo para o sistema de photobioreactor. Inóculo de algas é concentrado e transferido para fotobiorreatores para cultivo em modo de lote. As amostras são coletadas diariamente para as leituras da densidade óptica. No final da cultura lote, as células são colhidas por centrifugação, lavada e congelam secas para obter uma concentração final de peso seco. A concentração final de peso seco é usada para criar uma correlação entre a densidade óptica e a concentração de peso seco. Um método de Folch modificado subsequentemente é usado para extrair lipídios totais a partir da biomassa liofilizada e o extrato é analisado por seu conteúdo de lipídio neutro usando um ensaio de microplacas. Este ensaio foi publicado anteriormente, mas as etapas do protocolo foram incluídas aqui para destacar os passos críticos no procedimento onde frequentemente ocorrem erros. O sistema de biorreator descrito aqui preenche um nicho entre balão simples cultivo e biorreatores comerciais totalmente controlado. Mesmo com apenas 3-4 biológico repetições por tratamento, nossa abordagem para cultivo de algas leva a desvios-padrão apertados nos ensaios crescimento e lipídios.

Introduction

O aplicativo de microalgas em engenharia e biotecnologia tem atraído grande interesse nos últimos anos. Microalgas estão sendo estudados para uso em águas residuais tratamento1,2,3,4, biocombustível produção5,6,7,8e o produção de nutracêuticos e outros produtos de alto valor9,10. As algas são também sendo geneticamente modificadas em taxas maiores em um esforço para melhorar a sua aptidão para específicas aplicações engenharia11,12. Consequentemente, há grande interesse na experimentação com organismos relevantes industrialmente em ambientes controlados. A finalidade desse método é comunicar uma abordagem eficaz para cultura de microalgas em um ambiente controlado de laboratório e para medir o crescimento e o conteúdo de lipídios neutros de que algas. Melhorar o crescimento conteúdo de lipídios neutros de microalgas e taxas foram identificados como dois principais gargalos em direção a comercialização de biocombustíveis de algas13.

Uma ampla gama de abordagens tem sido usado para algas cultura para fins experimentais. Em geral, estas abordagens podem ser divididas entre cultivo ao ar livre em grande escala e cultivo indoor em pequena escala. Cultivo ao ar livre em fotobiorreatores e lagoas abertas é apropriado para a experimentação vista ampliação de processos que já tenham sido comprovados em escala de laboratório (por exemplo, para testar a aumentar de uma nova linhagem de alta-lipídios das algas)14. No entanto, cultivo indoor de pequena escala é apropriado durante o desenvolvimento de cepas de algas novos ou melhorados ou realizando experiências visa compreender os mecanismos biológicos. Nestes últimos casos, um alto grau de controle experimental é necessário para destrinchar mudanças sutis no comportamento biológico. Para esse fim, axénica culturas são muitas vezes necessárias para minimizar os fatores bióticos complexos associados com outros organismos (por exemplo, bactérias, outras algas) que inevitavelmente crescem em sistemas de grande escala ao ar livre. Mesmo quando estuda as interações entre as algas e outros organismos, encontramos que o uso das condições experimentais altamente controlado é útil aquando da análise molecular intercâmbio entre organismos15,16,17.

Dentro da categoria de cultivo de algas indoor em pequena escala, uma variedade de abordagens têm sido utilizados. Talvez a abordagem mais comum é a crescer algas em Erlenmeyers numa mesa de abanador sob uma luz banco18,19. Troca de oxigênio e CO2 ocorre por difusão passiva através de um plug de espuma no topo do balão. Alguns pesquisadores têm melhorado este set-up através de aeração ativa dos frascos20. Outra abordagem é a cultivar algas em garrafas, mixadas por barra de agitação e aeração ativa. Apesar de sua simplicidade, achamos que o uso de frascos e garrafas, muitas vezes, leva a resultados inconsistentes entre repetições biológicas. Presumivelmente devido aos efeitos de posição – diferentes posições recebem quantidades diferentes de luz, que também afetam as temperaturas internas do reator. Rotação diária dos reactores para novas posições pode ajudar, mas não é aliviar o problema porque determinados estágios de crescimento de algas (por exemplo, cedo exponencial) são mais sensíveis aos efeitos posicionais que outros (por exemplo, fase de registro).

No lado oposto do espectro da sofisticação tecnológica são totalmente controlado comercial fotobiorreatores. Estes sistemas de continuamente monitorar e ajustar as condições no reator para otimizar o crescimento de algas. Eles têm iluminação programável, controle de temperatura em tempo real e controle do pH. Infelizmente, eles são caros e normalmente custam milhares de dólares por reator. Mais revistas científicas e de engenharia exigem replicação biológica dos resultados, exigindo a compra de vários biorreatores. Apresentamos aqui um sistema de reator de coluna de bolhas que o fosso entre o simples (balão) e sofisticada (totalmente controlado bioreator) aproxima-se para o cultivo de algas de laboratório-escala de pontes. Colunas de bolha usam levantando bolhas de gás para facilitar a troca gasosa e misturar o reator. Essa abordagem fornece algum grau de controle sobre a iluminação e a temperatura, mas fá-lo de uma forma que é rentável. Além disso, encontramos este sistema produz resultados altamente consistentes entre réplicas biológicas, reduzindo o número necessário de repetições biológicos necessários para obter resultados estatisticamente significativos quando comparado com a abordagem de frasco ou garrafa. Também usamos este sistema para cultivar com sucesso as misturas de algas e bactérias21. Além do cultivo de algas, descrevem um procedimento para medir o teor de lipídios neutros nas algas cultivadas. O último método tem sido publicado em outro lugar22, mas incluímos aqui o procedimento para fornecer instruções passo a passo de como empregá-lo com sucesso.

Protocol

1. configuração de bolha coluna fotobiorreatores Construa um conjunto de tampas ventiladas das tampas de plástico que veio com as garrafas de vidro de 1 L e tubos de hibridação (ver Figura 1 para esquemas e fotos). Construa tampas para o umidificador, armadilha, cada ar elevador photobioreactor e cada frasco reator de mistura. ¼” furos na tampa: 2 furos são necessários para as tampas de biorreator e umidificador; 3 furos são necessários para a armadilha da mistura…

Representative Results

Este procedimento resulta em um curso de tempo dos dados de densidade óptica das algas em OD 550 nm (Figura 4A). A densidade óptica e peso seco concentração de dados podem ser correlacionados (Figura 4B). Isso é feito calculando a concentração de algas de peso seco final após a etapa de liofilização. Em seguida, a densidade óptica da diluição serial cultura (realizada no último dia de amostragem) e as concentraçõe…

Discussion

A consideração mais importante quando o cultivo de algas é uma compreensão das necessidades específicas do organismo ou grupo de organismos. As algas, sistema de cultivo descrito aqui pode ser usado para a cultura de uma grande variedade de algas, mas os específicos fatores abióticos (temperatura, mídia, pH, intensidade de luz, nível de CO2 , a taxa de aeração) precisam ser ajustado às necessidades do organismo. Observe os parâmetros descritos aqui foram usados para o cultivo de Chlorella

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Suporte para esta pesquisa foi fornecido pelo USDA, Instituto Nacional de alimentos e agricultura Hatch projeto ALA0HIGGINS e escritórios da Universidade de Auburn de reitor, Vice-Presidente de pesquisa e o Samuel Ginn faculdade de engenharia. Suporte também foi fornecido pelo NSF conceder CBET-1438211.

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35×300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24×2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

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Cite This Article
Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

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