Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Probe für Transposase zugänglichen Chromatin Sequenzierung (ATAC-Seq) auf aktivierten CD4 + menschlichen Lymphozyten durchführen. Das Protokoll wurde modifiziert, um Kontamination mitochondriale DNA liest von 50 % auf 3 % durch die Einführung eines neuen Lyse-Puffers zu minimieren.
Abstract
ATAC-Seq ist eine weit verbreitete Methode in der Studie der Epigenetik aufgrund seiner schnellen und einfachen Ansatz zur Kartierung genomweite zugänglich Chromatin geworden. In diesem Beitrag präsentieren wir eine verbesserte ATAC-Seq-Protokoll, die reduziert die mitochondriale DNA liest verunreinigen. Während frühere ATAC-Seq-Protokolle mit gekämpft haben liest durchschnittlich 50 % Verunreinigung mitochondrialen DNA, der optimierte Lyse Puffer eingeführt, die in diesem Protokoll mitochondriale DNA-Kontaminationen auf durchschnittlich 3 % reduziert. Diese verbesserte ATAC-Seq-Protokoll ermöglicht eine in der Nähe von 50 % Senkung der Sequenzierung Kosten. Wir zeigen wie diese qualitativ hochwertigen ATAC-Seq-Bibliotheken aus aktivierten CD4 + Lymphozyten, zubereiten können Schritt für Schritt Anleitungen von CD4 +-Lymphozyten isoliert von Vollblut durch Datenanalyse. Dieses verbesserte ATAC-Seq-Protokoll wird in einer Vielzahl von Zelltypen validiert wurde und von unmittelbaren Nutzen für Forscher Chromatin Zugänglichkeit.
Introduction
Der Test für Transposase zugänglichen Chromatin Sequenzierung (ATAC-Seq) ist schnell die führende Methode zur Abfrage von Chromatin Architektur geworden. ATAC-Seq erkennen Regionen zugänglich Chromatin durch den Prozess der Tagmentation, die Fragmentierung und tagging von DNA durch das gleiche Enzym, um Bibliotheken zu produzieren, mit denen Sequenzierung Chromatin Erreichbarkeit über eine gesamte Genom ermitteln kann. Dieser Tagmentation Prozess wird durch die hyperaktiven Tn5 Transposase vermittelt nur offene Regionen des Chromatins aufgrund nucleosomic sterische Behinderung schneidet. Wie schneidet, fügt die Tn5 Transposase auch Sequenzierung Adapter, die eine schnelle Bibliotheksbau von PCR und Sequenzierung der nächsten Generation von genomweiten zugänglich Chromatin1,2ermöglichen.
ATAC-Seq geworden ist die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Regionen von Chromatin Zugänglichkeit aufgrund der relativ einfachen und schnellen Protokoll, Qualität und Auswahl an Informationen, die aus seiner Ergebnisse und geringe Menge an Ausgangsmaterial benötigt ermittelt werden kann. Im Vergleich zu DNase-Seq3 (die Maßnahmen auch genomweite Chromatin Zugänglichkeit), MNase-Seq-4 (Das Nukleosom Positionen in offenen Genom Regionen bestimmt), und die Formaldehyd-vermittelten Jahrmarkt-Seq5, ATAC-Seq ist schneller, billiger und mehr reproduzierbare1. Es ist auch empfindlicher, arbeiten mit Ausgangsmaterial mit nur 500 Kerne, im Vergleich zu den 50 Millionen Kerne für DNase-Seq3erforderlich. ATAC-Seq hat auch die Möglichkeit, weitere Informationen zur Chromatin Architektur als andere Methoden, einschließlich Regionen Transkription Faktor Bindung, Nukleosom Positionierung und offene Chromatin Regionen1enthalten. Effektive, einzellige ATAC-Seq-Protokolle wurden validiert, Bereitstellung von Informationen über Chromatin Architektur an die einzelligen Ebene6,-7.
ATAC-Seq wurde zur Chromatin Architektur in einem breiten Spektrum von Forschung und Zellen-Typen, einschließlich Pflanzen8, Menschen9und viele andere Organismen zu charakterisieren. Es hat auch bei der Ermittlung der epigenetischen Regulation von Krankheit Staaten7kritisiert. Das am weitesten verbreitete ATAC-Seq-Protokoll enthält jedoch die Hauptbeeinträchtigung von Kontamination Sequenzierung liest aus der mitochondrialen DNA. In einigen Datensätzen kann dieser Verschmutzungsgrad so hoch wie 60 % der Sequenzierung Ergebnisse1. Es gibt eine konzertierte Anstrengung im Bereich dieser kontaminierenden mitochondriale liest zu senken, um für den effizienteren Einsatz von ATAC-Seq7,10,11ermöglichen. Hier präsentieren wir eine verbesserte ATAC-Seq-Protokoll, die die mitochondriale DNA Kontamination auf nur 3 % reduziert, so dass rund 50 % Ermäßigung in Sequenzierung Kosten10. Dies wird ermöglicht durch einen optimierten Prozess der CD4 + Lymphozyten isoliert und Aktivierung und eine verbesserte Lyse Puffer, kritische mitochondriale DNA-Kontamination zu minimieren.
Dieses ModifiedATAC-Seq-Protokoll wurde mit einer breiten Palette von Primärzellen, einschließlich Menschenblut primäre peripheren mononukleären Zellen (PBMCs)10, menschliche primäre Monozyten und Maus dendritischen Zellen (unveröffentlicht) validiert. Es wird auch erfolgreich eingesetzt, Melanom-Zelllinien in einem gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) Bildschirm des nicht-kodierenden Elemente11zu befragen. Darüber hinaus bietet das Daten-Analyse-Paket in diesem Protokoll beschrieben und auf GitHub neue und erfahrene Forscher mit Werkzeugen zur Analyse ATAC-Seq-Daten. ATAC-Seq ist die effektivste Assay Chromatin Erreichbarkeit über eine gesamte Genom zuordnen, und Änderungen an bestehenden Protokolls, die hier vorgestellt werden erlauben Forschern, qualitativ hochwertige Daten mit niedrigen mitochondriale DNA-Kontaminationen zu produzieren, Sequenzierung Kostenreduzierung und Verbesserung der ATAC-Seq-Durchsatz.
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Protocol
Dieses verbesserte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die Durchführung von ATAC-Seq der CD4 + Lymphozyten, aus dem Ausgangsmaterial von Vollblut durch Datenanalyse (Abbildung 1).
1. Isolierung der CD4 + T-Zellen aus dem Vollblut
Hinweis: Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll ist 15 mL frischem Vollblut mittels standard-Verfahren, so dass die Quelle des Ausgangsmaterials zu selektierenden basiert auf Forschungsanforderungen erhoben. Skalieren Sie das Protokoll nach Bedarf. Wärmen Sie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 2 % fetalen Kälberserum (FCS) auf Raumtemperatur (RT vor) und passen Sie die Zentrifuge zu RT vor Beginn der CD4 + T Zelle Bereicherung Verfahren.
- 15 mL Vollblut in einem 50 mL konische Rohr 750 µL menschliche CD4 + T Zelle Bereicherung cocktail hinzufügen und vorsichtig mischen durch Umkehrung. 20 min bei RT inkubieren. Bei der Inkubation abgeschlossen ist, das Rohr 15 mL PBS + 2 % FCS hinzu und mischen Sie leicht durch Umkehrung.
- Bereiten Sie eine frische 50 mL konische Rohr mit 15 mL Dichte Medium. Sorgfältig Schicht verdünnten Blutprobe auf der Oberseite des Mediums Dichte, wobei Sie nicht auf die Dichte Medium/Blut-Schnittstelle zu stören, die bildet. Zentrifuge für 20 min bei 1.200 x g und RT mit Beschleunigung auf 1 und die absteigende Bremse OFF festgelegt.
Hinweis: Es ist entscheidend für die Beschleunigung auf 1 und absteigender Bremse OFF auf der Zentrifuge, Unterbrechungen der Zellschicht Mittel-und Dichte zu vermeiden festlegen. - Sammeln Sie die angereicherten CD4 + T-Zellen aus der Dichte-Medium/Plasma-Schnittstelle mit einem schmalen Stiel Transferpipette. Übertragen Sie die gesammelten Zellen auf eine frische 50 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die gesammelten CD4 + T-Zellen für 8 min bei 423 x g und RT.
Hinweis: Achten Sie darauf, die Zentrifuge Beschleunigung 9 und absteigenden Bremse auf ON für Schritt 1.3 und alle folgenden Schritte zurück. - Den Überstand verwerfen und Waschen der Zelle Pellet zweimal mit 50 mL PBS + 2 % FCS, Zentrifugieren für 8 min bei 423 X g und RT. Entsorgen des endgültigen Überstands waschen und Aussetzen der gewaschenen Zelle Pellet in 2 mL PBS + 2 % FCS.
- Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer. Um weiterhin mit ATAC-Seq, fahren Sie mit Schritt 2.3. Um Zellen für eine spätere Bearbeitung zu fixieren, gehen Sie zu Schritt 1.6.
- Fügen Sie 1 mL frisch Einfrieren Medium (90 % FCS + 10 % Dimethyl Sulfoxid) pro 1 Million Zellen. Aliquoten 1 mL der Zellen in das Medium in kryogenen sichere Rohre einfrieren. Röhren bei-80 ° C über Nacht in einem langsam-Einfrieren-Container zu platzieren. Am nächsten Tag transfer Rohre zu flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung.
Hinweis: 1 Million CD4 + T-Zellen werden je 2 mL der Originallautstärke eines Vollblut isoliert werden. Frieren Sie 500.000 Zellen in 1 mL Aliquote Einfrieren Medium. Frisches einfrierendes Medium bei jedem Gebrauch zu machen.
2. Aktivieren Sie und reinigen Sie der CD4 + T-Zellen
Hinweis: Diese schnelle Protokoll für die Aktivierung und Reinigung von CD4 + T-Zellen nur verlangt, 48 h und führt zu 95 % lebensfähig, CD4 + T-Zellen aktiviert. Kühlen Sie die Zentrifuge bis 4 ° C ab, bevor Sie Anfang des Protokolls.
- Tauen Sie 1 Durchstechflasche (500.000) CD4 + T-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad auf, bis nur das Eis geschmolzen ist. Übertragen Sie Zellen auf eine 15 mL konische Röhrchen mit 9 mL vorgewärmten Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) Medien ergänzt mit 10 % FCS, nachfolgend als komplette RPMI sanft.
Hinweis: Lassen Sie nicht Zellen vollständig auftauen um Kontakt mit DMSO zu vermeiden. - Zentrifuge für 6 min bei 1500 x g und 4 ° C. Den Überstand verwerfen und sanft das Pellet in 2 mL komplette RPMI auszusetzen. Wiederholen Sie den Spin down, überstand verwerfen und sanft Zellen in 0,5 mL komplette RPMI auszusetzen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Passen Sie die Dichte der Zellsuspension mit komplette RPMI, 50.000 Zellen in 200 µL pro Bohrloch einer 96-Well Rundboden-Platte zu Platte.
Hinweis: Aus einem gefrorenen Tube von 500K CD4 + T-Zellen, Platte 10 Brunnen von 50.000 CD4 + T-Zellen in 200 µL pro Bohrloch. -
Bereiten Sie magnetische Beads mit menschlichen T-Aktivator Anti-CD3 und Anti-CD28 Antikörper konjugiert.
- Aliquoten 12,5 µL von menschlichen T-Aktivator CD3/CD28 Perlen pro ATAC-Seq-Probe auf einem 1,5 mL-Tube. Waschen Sie die Perlen mit 1 mL 1 X PBS und legen Sie das Rohr auf ein Magnet für 1 min.
- Sorgfältig entfernen und verwerfen den klare überstand, entfernen Sie das Rohr aus Magnet und hängen Sie die Perlen in 13 µL vervollständigen RPMI pro Probe ATAC-Seq.
Hinweis: Berechnen Sie die Menge der Perlen notwendig basierend auf der Anzahl der ATAC-Seq Proben bearbeitet. Dieses Protokoll erfordert 12,5 µL CD3/CD28 Perlen pro 500.000 Zellen, die eine ATAC-Seq Probe darstellt.
- Aktivieren Sie der CD4 + T-Zellen. Sammeln Sie 500.000 Zellen in 2,1 mL komplette RPMI Medium in einem 15 mL konische Röhrchen zu, und fügen Sie 12,5 µL vorgewaschen menschlichen T-Aktivator-Perlen. Mischen Sie durch Umdrehen der Röhre vorsichtig.
- Übertragen Sie die Zellen mit Perlen sanft auf eine sterile Behälter und Platte 200 µL Zellen mit Perlen pro Bohrloch Rundboden-96-Well-Platte mit einer Multi-Kanal-Pipette. 48 h in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator inkubieren.
- Nach Inkubation, Zentrifugieren der 96-Well-Platte für 8 min bei 423 x g und RT entfernen 100 µL Medium pro Bohrloch aus der 96-Well-Platte, es zu einem konischen Rohr sammeln, bevor dafür keine Perle Verlust abwerfen. Aufschwemmen der Zelle Pellet in den verbleibenden 100 µL und sammeln Sie alle in einem 1,5 mL-Tube.
Hinweis: 10 Bohrungen der aktivierten T-Zellen werden in einer 1 mL Volumen gesammelt. - Führen Sie CD4 + Isolation. 500.000 Zellen in 1 mL der komplette RPMI 50 µL vorgewaschen CD4 konjugiert Perlen hinzufügen. Kombinieren Sie Perlen und Zellen mit Pipette. Inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C in den Kühlschrank stellen. Schütteln Sie Perlen und Zelle Mischung alle 6 Minuten.
Hinweis: Dieses Protokoll ist für eine Probe von 500.000 Zellen verwendet werden. Passen Sie ggf. für zwei oder mehrere Proben von 500.000. - Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, legen Sie das Rohr auf den Magneten für 2 min. entfernen und entsorgen den Überstand als klare. Waschen Sie die Wulst-gebundenen Zellen durch das Rohr vom Magneten zu entfernen, Aussetzung der Wulst-gebundenen Zellen in 1 mL PBS + 2 % FCS ersetzt den Schlauch auf den Magneten für 1 min und den klare überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.
Hinweis: Achten Sie darauf, dass Sie keine Perlen beim Wäschen aussondern. - Legen Sie nach dem letzten Waschen den Schlauch auf den Magneten für 1 min. entfernen und entsorgen des Überstands und Pellet auf Eis. Fahren Sie mit Abschnitt 3 (ATAC-Seq).
(3) ATAC-seq
Hinweis: In diesem Schritt werden Kerne isoliert von aktivierten CD4 + T-Zellen für ATAC-seq. In diesem Protokoll verwendeten Lyse-Puffer wurde verbessert, um sanfter auf die Kerne, was zu einer effizienteren Verdauung und höhere Qualität der Ergebnisse. Alle Zentrifugation Schritte in Abschnitt 3 sind mit einer festen Winkel Zentrifuge gepflegt bei 4 ° c durchgeführt. Kühlen Sie die Zentrifuge vor Beginn Protokoll.
- Führen Sie Kerne Isolation. Aufschwemmen Sie Perlen und Zellen mit kalten Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03 % Polysorbat 20). Zentrifugieren Sie sofort bei 500 X g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen und entsorgen des Überstands.
- Führen Sie die Transposase Reaktion. Aussetzen der isolierten Kernen Pellet mit 50 µL Tn5 Transposase Mix (Tabelle 1). Brüten Sie in einem Thermocycler für 30 min bei 37 ° C mit Deckel 40 ° C, bei 4 ° C, wenn Sie fertig sind.
- Nach Thermocyclings sofort führen Sie eine schnelle Benchtop Zentrifuge Spritztour nach unten und legen Sie den Schlauch auf den Magneten für 1 min um die Perlen aus dem Produkt zu entfernen.
- Den klare Überstand aus der Tube auf den Magneten zum Übertragen einer DNA-Reinigung-Spalte Waschen Sie die Spalte einmal mit 250 µL Puffer PB und zweimal mit 750 µL Buffer PE. Eluieren Sie die Probe in 10 µL der Elution Buffer. Gehen Sie direkt zu Schritt 3.5.
Hinweis: Dieser Schritt verstärkt die DNA-Fragmente mit der aufgespaltenen Adapter, hier als der ATAC-Seq-Bibliothek bezeichnet. Um multiplex-mehrere ATAC-Seq-Bibliotheken auf NGS einspurig ausgeführt werden, verwenden Sie nichtindizierte Primer 1 für alle Proben und verschiedenen indizierten Primer 2 für einzelne Samples (Tabelle 2). Zündkapseln werden in Konzentrationen von 1,25 µM arbeiten benutzt. - Richten Sie die erste PCR-Amplifikation Reaktion in einem Nuklease-freie PCR-Röhrchen, Kombination der Komponenten in der Reihenfolge und das angegebene Volume Tabelle 3. Legen Sie das PCR-Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie die PCR Verstärkung Programm mit Radsport Bedingungen wie in Tabelle 4angegeben.
-
Beobachten Sie die Reaktion von qPCR. Richten Sie die qPCR-Reaktion in einem Nuklease-freie PCR-Röhrchen, Kombination der Komponenten in der Reihenfolge und in Tabelle 5 angegebenen Betrag. In qPCR Maschine und Zyklus als gemäß Tabelle 6.
- Um festzustellen, dass die optimale Anzahl von zusätzlichen Verstärkung für die restlichen 45 µL Reaktion Zyklen, erstellen Sie ein Grundstück mit Zyklus Nummer auf der x-Achse und relative Fluoreszenz (RFU) auf der y-Achse. Die optimale Anzahl der zusätzlichen Verstärkung Zyklen ist ein Drittel der Anzahl der Zyklen dauert es für die qPCR Reaktion auf Plateau zu erreichen.
Hinweis: Überwachung der Reaktions durch qPCR kann zur Bestimmung der optimalen Anzahl von PCR-Zyklen gewünscht, optimale Bibliothek Fragment Verstärkung bei gleichzeitiger Minimierung der GC Inhalt und Größe Bias zu erhalten.
- Um festzustellen, dass die optimale Anzahl von zusätzlichen Verstärkung für die restlichen 45 µL Reaktion Zyklen, erstellen Sie ein Grundstück mit Zyklus Nummer auf der x-Achse und relative Fluoreszenz (RFU) auf der y-Achse. Die optimale Anzahl der zusätzlichen Verstärkung Zyklen ist ein Drittel der Anzahl der Zyklen dauert es für die qPCR Reaktion auf Plateau zu erreichen.
- Füllen Sie die endgültige PCR Verstärkung von der restlichen 45 µL des PCR-Reaktion. Legen Sie den PCR-Schlauch mit Verstärkung Reaktion aus Schritt 3.5 zurück in den Thermocycler und führen Sie das Programm, wie in Tabelle 7beschrieben.
Hinweis: Für Proben verarbeitet, wie in diesem Protokoll beschrieben war die optimale Gesamtzahl der PCR Verstärkung Zyklen bestimmt, 12. - Nach Abschluss der Verstärkung, reinigen Sie die Bibliotheken mit einem PCR-Bereinigung-Kit nach der Hersteller-Protokolls, in 25 µL des Puffers Elution eluierenden.
Hinweis: Verstärkte Bibliotheken können bei 4 ° C für bis zu 48 h gelagert oder bei-20 ° C für die langfristige Lagerung eingefroren.
(4) ATAC-Seq-Bibliothek-Qualitätsanalyse
Hinweis: Es ist wichtig, die Qualität und Quantität der ATAC-Seq-Bibliotheken vor der Sequenzierung der nächsten Generation zu validieren. Die Qualität und Quantität der Bibliotheken sollten mit handelsüblichen Kits (siehe Tabelle der Materialien) bewertet werden.
- Beurteilen Sie die Qualität und Quantität der ATAC-Seq-Bibliotheken mit einem Mikrofluidik-basierte Plattform für die Dimensionierung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle der DNA. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Bewertung Qualitätsergebnisse.
Hinweis: Die Konzentration der ATAC-Seq Bibliotheken muss > 1 ng/µL, Sequenzierung Qualitätsergebnisse zu erhalten. Auf durchschnittlich 30 nM 25 µL wurde erhalten.
(5) die Sequenzierung und Analyse von Daten
Hinweis: Diese Analyse Pipeline ermöglicht es Benutzern, kontrollieren die Qualität der Lesevorgänge mapping-Verfahren, Koordinaten für experimentelles Design anpassen und nachgelagerte Analyse Gipfel fordern. Im folgenden werden die Befehle Linien und Erklärung der Ausführung. Das Daten-Analyse-Paket ist verfügbar (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Reihenfolge der vorbereiteten Bibliotheken auf eine nächste Generation Sequenzer zu einer durchschnittlichen lesen Sie Tiefe von 42 Millionen Lesevorgänge pro Probe.
- Schätzen Sie die Qualität der Sequenzierung Lesevorgänge durch die Überprüfung von FastQC-12 -Software-Paket mit dem Befehl erzeugte Dateien:
Fastqc -o < Output_directory >< Fastq_file > - Schneiden die Grundlagen der Lesevorgänge durch Trimmomatic13 Software bei Bedarf gemäß der FastQC-Qualitäts-Check, mit dem Befehl (für paar-ended):
Java-Jar < Pfad zu Trimmomatic Jar-Datei > PE < input1 >< input2 >< gekoppelten output1 >< ungepaarte output1 >< gekoppelten Ausgang2 >< ungepaarte Ausgang2 > HEADCROP: < Zuschneiden Grundlagen > - Lesevorgänge auf menschlichen Bezug Genom (hg38) durch Bowtie214 Software ausrichten:
bowtie2 - X < verweisen Genom >-1 < Eingabe paar 1 >< Eingabe paar 2 > -S < Ausgabedatei SAM >
Hinweis: Das Argument - X für die Basename des Index für das Referenz-Genom, und -S ist für die SAM-Format ausgegeben. - Überprüfen Sie die Einschätzung des zugeordneten lautet mit Samtools-15 -Flagstat-Paket:
SamTools Flagstat < BAM Datei > - Die zugeordneten liest Datei sortieren und Entfernen von Duplikaten mit Picard-16 -Tool:
Java-jar picard.jar SortSam INPUT = < SAM Datei Eingangsname > Ausgabe = < sortiert BAM Ausgabedateiname > Sortier_reihenfolge = Koordinate "und" Java-jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = < sortierte BAM Datei > Ausgabe = < Ausgabedatei BAM ohne Duplikate > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - BAM-Index-Datei, Trimmen der ungenutzten Chromosom liest und verlagern die Koordinaten für den experimentellen Grund der ATAC-Seq17:
Java-jar picard.jar BuildBamIndex INPUT = < BAM Datei >
SamTools Idxstats < Eingabe BAM Datei > | Schneiden -f 1 | Grep - V ChrY | Grep - V ChrM | Grep - V ChrUn | Xargs Samtools anzeigen -b < Eingabe BAM Datei >>< Ausgabe getrimmt BAM Datei >
Bedtools Bamtobed -i < Eingabe getrimmt BAM Datei >>< Ausgabe getrimmt Bett Datei >
Awk ' beginnen {OFS = "\t"}; {Wenn ($6 == "+") drucken, $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; sonst drucken, $1, $2-5, 3-5 $, $4, $5, $6} "< Eingabe getrimmt Bett Datei >< getrimmte verschoben Bett Datei > - Löschen Sie das liest, die negative Abstimmung verschoben werden:
Awk '{if ($2 > 0) $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6 drucken}"< Eingabe BED Datei >< Ausgabedatei nichtnegative Koordination Bett >. - BAM-Datei für die folgenden DiffBind18 Analyse umwandeln Sie die Bett-Datei:
Bedtools Bedtobam -i < Eingabe BED Datei > -g < Bezug Genom >< Ausgabe BAM Datei > - Führen Sie Spitze Berufung von DiffBind18 -Software-Paket:
macs2 Callpeak -t < Eingabe BAM Datei > -f BAM -g hs - Nomodel--Nolambda--Keep-Dup alle-- Anruf-Gipfel--Outdir < Verzeichnis Ausgabepfad > - n < Ausgabenamen > -B - Q 0,01--Bdg - Verschiebung-100--Extsize 200
Hinweis: Erwarten Sie nach der Filterung einen Median von 37 Millionen Lesevorgänge pro Probe. Mitochondriale DNA-Kontaminationen reichen von 0,30 %-5.39 % (durchschnittlich 1,96 %). Es wird eine niedrige Rate von multiplizieren zugeordneten liest (durchschnittlich 6,7 %, 56 %, 19 %) und ein relativ hoher Prozentsatz der nutzbaren nuklearen liest (60 % – 92 %, 79 % im Durchschnitt).
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Representative Results
Von 15 mL frischem Vollblut erzeugt dieses Protokoll einen Durchschnitt von 1 Million CD4 + T-Zellen. Diese können für eine spätere Bearbeitung eingefroren oder sofort verwendet werden. Lebensfähigkeit der CD4 + T-Zellen, frisch oder aufgetaut, wurde konsequent > 95 %. Diese Methode der CD4 + T Zelle Isolierung sorgt für Flexibilität im Material und Sammlung Quellzeit. Dieses verbesserte ATAC-Seq-Protokoll produziert eine endgültige Bibliothek von mehr als 1 ng/µL für die Sequenzierung. Qualitätskontrolle mit handelsüblichen Systemen durchgeführt sollte zeigen, dass DNA-Fragmente zwischen 200 und 1000 bp (Abbildung 2). Sequenzierung sollte nur mit qualitativ hochwertigen Bibliotheken durchgeführt werden.
Alle Bibliotheken wurden zu einer durchschnittlichen Tiefe von mehr als 40 Millionen pro Probe lesen sequenziert. Während häufig verwendete ATAC-Seq-Protokolle angefochten worden, durch Kontamination Sequenzierung Lesezugriffe auf die mitochondriale DNA, die von 50-60 % der gesamten Sequenzierung liest1 reichen können beseitigt dieses verbesserte Protokoll das Problem. Bibliotheken, zubereitet nach diesem Protokoll enthalten durchschnittlich nur 3 % mitochondriale liest (Abb. 3A). Der hohe Anteil der nutzbaren liest ist hinreichend konstant über biologische Wiederholungen (Abb. 3 b). Das Protokoll war hoch reproduzierbare Ergebnisse über technische Wiederholungen (Abbildung 4A, B) sowie biologische Wiederholungen (Abbildung 4, D) anbieten. Darüber hinaus das Protokoll für CD4 + T-Zell-Aktivierung präsentiert 48 h anstatt eine Woche oder länger dauert und führt zu konsistente und effiziente Aktivierung, wie reproduzierbar Sequenzierung Ergebnisse (Abbildung 4A, B) zeigen. Vorhergesagten ATAC-Seq-Gipfel werden genau durch die Analyse Pipeline (Abb. 4E) genannt. Analyse der Ergebnisse der Sequenzierung identifiziert klarere Zustandsänderungen Chromatin während der menschlichen T-Zell-Aktivierung. Differentiell zugängliche Bereichen der offenen Chromatin wurden zwischen sechs Proben vor und nach 48 h der Aktivierung (Abbildung 5).
Abbildung 1: experimentelle Überblick über das geänderte Protokoll ATAC-Seq. (A) probieren Sie Übernahme und Verarbeitung von 15 mL Patientenblut ganz durch CD4 + T Zelle, Isolation, Beschichtung und Aktivierung der T-Zellen und Zellkerne Isolierung mit dem verbesserten Lyse-Puffer. (B) die Transposase Reaktion und PCR-Amplifikation der Sequenzierung Bibliothek. (C) Qualität Analyse, Sequenzierung und Analyse der Daten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative hochwertige ATAC-Seq Bibliotheken aus einem Mikrofluidik-basierte Plattform für die Dimensionierung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle der DNA. (A) elektronische Gelbild Proben B1 und D1 mit Streifenbildung zwischen 200 und 1000 Basenpaare. (B und C) Electropherogram Ergebnis der Ablaufverfolgung Proben B1 (B) und D1 (C), mit Höhen zwischen 200 und 1000 Basenpaare. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: verringert die mitochondriale DNA-Kontaminationen mit ATAC-Seq Protokoll Ergebnisverbesserung zu einem Anstieg der verwendbaren DNA-Sequenzierung liest. (A) Vergleich der nutzbaren liest (lila), Duplikat liest (grün) und mitochondriale liest (rot) von CD4 + T Zelle ATAC-Seq Profilierung in der Literatur. (B) Vergleich der nutzbaren liest (lila), Duplikat liest (grün), mitochondriale liest (rot) und nicht zugeordnete liest (blau) von CD4 + T Zelle ATAC-Seq Profilierung von mehreren gesunden Personen (n = 22). Diese Zahl wurde von Cheng Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: ATAC-Seq Protokoll Reproduzierbarkeit und Genauigkeit verbessert. Grundstücke von Chromatin Zugänglichkeit (ATAC-Seq-Signal, x- und y-Achse) streuen, für zwei Experimente der unstimulierte replizieren (A; 36.486 Th-Gipfel) oder aktiviert (B; 52.154 Thstim Gipfel) T-Zellen zeigt technische Reproduzierbarkeit. Chromatin Zugänglichkeit für aktivierte T-Zellen von Einzelpersonen IGTB1191 (y-Achse) und IGTB1190 (x-Achse) (C) und Histogramm von Korrelationen zwischen allen Paaren von Einzelpersonen für die 52.154 Thstim-Gipfel (D) zeigt Reproduzierbarkeit zwischen den Individuen. (E) ATAC-Seq Gipfel namens mit unserem verbesserten ATAC-Seq-Protokoll auf Chromosom 19 Q13.12. Diese Zahl wurde von Cheng Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Vertreter ATAC-Seq-Ergebnisse der Zustandsänderungen nach CD4 + T-Zell-Aktivierung Chromatin. (A) experimentelle Übersicht (links) und Nomenklatur (rechts). (B) differentiell zugänglichen Bereichen der offenen Chromatin (Spalten) in sechs Proben (Zeilen) vor (oben, Th) und nach (unten, ThStim) 48 h Aktivierung des primären CD4 + T-Zellen. Diese Zahl wurde von Cheng Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| 2 x TD Puffer | 25 ΜL |
| TN5 Enzym | 5 ΜL |
| Nuklease freies Wasser | 20 ΜL |
| Gesamtvolumen | 50 ΜL |
Tabelle 1: Schritt 3.2 Transposase Reaktionskomponenten.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| AD2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tabelle 2: ATAC-Seq Oligos Entwürfe für PCR verwendet.
| Nuklease freies Wasser | 11.9 ΜL |
| 100 µM benutzerdefinierte Nextera Primer 1 (Tabelle 2) | 0,6 ΜL |
| NEBNext-HiFi 2 x PCR Master Mix | 25 ΜL |
| ATAC-Seq-Bibliothek | 10 ΜL |
| 25 µM benutzerdefinierte Nextera Primer 2 (Tabelle 2) | 2.5 ΜL |
| Gesamtvolumen | 50 ΜL |
Tabelle 3: Schritt 3.5 erste PCR Reaktion Mix.
| ZYKLUS-SCHRITT | TEMPERATUR | ZEIT | ZYKLEN |
| Erweiterung | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Anfängliche Denaturierung | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturierung | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Glühen | 63 ° C | 30 s | |
| Erweiterung | 72 ° C | 1 min | |
| Halten | 4 ° C | Unendlichkeit | 1 |
Tabelle 4: Schritt 3.5 erste PCR-Amplifikation Radsport Programm.
| PCR-Reaktion aliquoten | 5 ΜL |
| PCR-Cocktail aus Tabelle 3 mit 0,6 X Syber grün | 10 ΜL |
Tabelle 5: Schritt 3.6 qPCR Reaktion Mix.
| ZYKLUS-SCHRITT | TEMPERATUR | ZEIT | ZYKLEN |
| Anfängliche Denaturierung | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturierung | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Glühen | 63 ° C | 30 s | |
| Erweiterung | 72 ° C | 1 min | |
| Halten | 4 ° C | Unendlichkeit | 1 |
Tabelle 6: Schritt 3.6 qPCR Radsport Programm.
| ZYKLUS-SCHRITT | TEMPERATUR | ZEIT | ZYKLEN |
| Anfängliche Denaturierung | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturierung | 98 ° C | 10 s | Wie bestimmt |
| Glühen | 63 ° C | 30 s | |
| Erweiterung | 72 ° C | 1 min | |
| Halten | 4 ° C | Unendlichkeit | 1 |
Tabelle 7: Schritt 3.7 PCR-Radsport-Programm für endgültige PCR-Amplifikation.
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Discussion
Das modifizierte ATAC-Seq-Protokoll in diesem Artikel vorgestellten liefert reproduzierbare Ergebnisse mit minimalen mitochondriale DNA-Kontaminationen. Das Protokoll wurde erfolgreich zur Chromatin Architektur des menschlichen primäre PBMCs10, menschlichen Monozyten, dendritische Mauszellen (unveröffentlicht) zu charakterisieren, und kultivierten Melanom Zelle Linien11. Wir erwarten diese verbesserte Lyse Zustand hat das Potenzial, für andere Zelltypen sowie zu arbeiten. Es wird auch erwartet, dass dieser Kerne Isolierung Protokoll kompatibel mit einzelnen Kernen ATAC-Seq-Protokolle, Minimierung der mitochondrialen DNA-Kontaminationen um Sequenzierung Ergebnisse zu verbessern.
Ein weiterer Vorteil dieses geänderten Protokolls ist die Fähigkeit, Chargen von isolierten CD4 + T-Zellen von PBMCs zu unterschiedlichen Zeiten abhängig von der Verfügbarkeit von Patientenproben einfrieren. ATAC-Seq dann gleichzeitig auf alle Proben durchgeführt werden kann, ist potenzielle Batch Effekt Verzerrung in der Transposase Reaktions- und Sequenzierung minimierte10. Es ist wichtig, dass das einfrierende Medium mit jedem Gebrauch, um die hohe Rentabilität zu erhalten, die mit diesem Frost-Tausalz-Protokoll erreicht wird frisch zubereitet werden. Lebensfähigkeit des isolierten CD4 + T-Zellen sollte über 90 % bleiben, um unspezifische Verdauung in der Transposase Reaktion1zu vermeiden.
Bitte beachten Sie, dass weitere Optimierung erforderlich sein kann, um dieses Protokoll mit Variable Zelle Arten und Mengen zu verwenden. Da die Tn5 Transposase-Kerne Verhältnis für 500.000 Kerne in diesem Protokoll optimiert worden ist, wenn ATAC-Seq mit einer unterschiedlichen Anzahl von Kernen durchführen, sollte die Menge an Tn5 Transposase entsprechend angepasst werden. Übermäßige lyse der Kerne durch ein Übermaß an Tn5 führen zu hohen Hintergrund aus geschlossenen Chromatin und geringer Komplexität der Sequenzierung Bibliotheken, zwar unter Lyse keine komplette PCR verstärkt Bibliothek1. Um diese Komplikationen zu vermeiden, ist es ratsam, vorsichtig Kerne zählen und optimieren die Tn5 Verhältnis wie nötig. Um die Datenqualität weiter zu verbessern, ist es ratsam, PCR Verstärkung Zyklen optimieren durch die Überwachung der qPCR. Wenn die endgültige Bibliothek zuviel Verstärkung Zyklen unterzogen wird, möglicherweise Bias in der Sequenzierung Daten2eingeführt. Es empfiehlt sich, angemessene Qualitätskontrolle der ATAC-Seq-Bibliotheken vor der Sequenzierung der nächsten Generation zu führen, um Zeit und Geld sparen.
Wie wir gezeigt haben, ein modifizierte Lyse-Puffer ist der Schlüssel zur Verringerung der mitochondrialen DNA-Kontaminationen und wirkt auf eine Vielzahl von Zelltypen. Andere Protokolle haben die Frage der mitochondrialen Kontamination mit alternativen Lyse Puffer7,19 oder durch den intensiven Prozess eines CRISPR-vermittelte mitochondriale DNA-Abbau20behandelt. Unser alternative ATAC-Seq-Protokoll trägt zu den Bemühungen um die mitochondriale DNA-Kontamination der Sequenzierung Lesevorgänge mit einer verbesserten Lyse-Puffer und Erhaltung von der Einfachheit der ATAC-Seq, das macht es eine zugängliche Technik zu verringern. Zusammen mit RNA-Seq und einzellige Sequenzierung ist ATAC-Seq ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erkundung der epigenetischen Regulation. Diese verbesserte ATAC-Seq-Protokoll und Daten-Analyse-Paket hilft Sequenzierung Kosten zu senken und höhere Qualität der Ergebnisse zu produzieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Atsede Siba für technischen Support. C.S.C wird unterstützt von NIH Grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
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