Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um ensaio de cromatina transposase-acessível sequenciando (ATAC-seq) em linfócitos humanos registrados CD4 +. O protocolo foi modificado para minimizar contaminando leituras de DNA mitocondriais de 50% para 3%, através da introdução de um novo buffer de Lise.
Abstract
ATAC-seq tornou-se uma metodologia amplamente utilizada no estudo da epigenética, devido à sua abordagem rápida e simples de mapear todo o genoma de cromatina acessível. Neste trabalho apresentamos um protocolo melhorado de ATAC-seq que reduz contaminando leituras de DNA mitocondriais. Enquanto o anterior ATAC-seq protocolos têm lutado com uma média de 50%, contaminando o DNA mitocondrial lê, a Lise otimizado introduzido neste protocolo reduz contaminação de DNA mitocondrial de uma média de 3%. Este protocolo ATAC-seq melhorado permite a quase 50% de redução do custo de sequenciamento. Vamos demonstrar como essas bibliotecas de ATAC-seq de alta qualidade podem ser preparadas de linfócitos CD4 + ativados, fornecendo instruções passo a passo do isolamento de linfócitos CD4 + de sangue total através da análise de dados. Este protocolo ATAC-seq melhorado foi validado em uma ampla gama de tipos de células e será de uso imediato para pesquisadores estudando acessibilidade de cromatina.
Introduction
O ensaio para transposase-acessível da cromatina sequenciamento (ATAC-seq) rapidamente se tornou o principal método para interrogar a arquitetura da cromatina. ATAC-seq pode identificar regiões da cromatina acessível através do processo de tagmentation, a fragmentação e marcação de DNA pela mesma enzima, para produzir as bibliotecas com o qual sequenciamento pode determinar a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro. Este processo de tagmentation é mediado pelo transposase Tn5 hiperativo, o que só corta regiões abertas da cromatina devido nucleosomic estérico. Como corta, o transposase Tn5 insere também adaptadores de sequenciamento que permitem a construção de biblioteca rápida por PCR e a próxima geração sequenciamento de genoma-larga acessível cromatina1,2.
ATAC-seq tornou-se o método preferido para determinar as regiões de acessibilidade de cromatina, devido ao protocolo relativamente simples e rápido, qualidade e variedade de informações que podem ser determinadas a partir de seus resultados e a pequena quantidade de material necessário começar. Em comparação com DNase-seq3 (que também mede a acessibilidade de todo o genoma de cromatina), MNase-seq4 (que determina posições nucleossoma em regiões do genoma aberto), e a mediada por formaldeído FAIRE-seq5, ATAC-seq é mais rápido, mais barato e mais reprodutíveis1. Também é mais sensível, trabalhando com material de tão poucos como 500 núcleos, em comparação com os núcleos 50 milhões necessários para DNase-seq3começar. ATAC-seq também tem a capacidade de fornecer mais informações sobre a arquitetura da cromatina que outros métodos, incluindo regiões de ligação do fator de transcrição nucleossoma posicionamento e regiões de cromatina aberta1. Eficazes, single-cell ATAC-seq protocolos validados, fornecendo informações sobre a arquitetura da cromatina na célula única nível6,7.
ATAC-seq tem sido usado para caracterizar a arquitetura da cromatina através de um amplo espectro de tipos de pesquisa e de células, incluindo plantas8humanos9e muitos outros organismos. Também tem sido fundamental na identificação de regulação epigenética da doença Estados7. No entanto, o mais amplamente utilizado ATAC-seq protocolo inclui a grande desvantagem de contaminação leituras de sequenciamento do DNA mitocondrial. Em alguns conjuntos de dados, este nível de contaminação pode ser tão alto quanto 60% de resultados1de sequenciamento. Há um esforço concertado no campo para reduzir essas leituras mitocondriais contaminantes para permitir a aplicação mais eficiente da ATAC-seq7,10,11. Aqui nós apresentamos um protocolo melhorado da ATAC-seq que reduz a taxa de contaminação de DNA mitocondrial de apenas 3%, permitindo a redução de cerca de 50% em custos de sequenciamento10. Isto é feito possível por um processo simplificado de isolamento de linfócitos CD4 + e ativação e um tampão de Lise melhorada que é crítico em minimizar a contaminação de DNA mitocondrial.
Este protocolo modifiedATAC-seq foi validado com uma grande variedade de células primárias, incluindo humano primário do sangue periférico (PBMC) de células mononucleares10humanos primários monócitos e células dendríticas de rato (não publicadas). Ele também tem sido usado com sucesso para interrogar linhas de células de melanoma em uma tela de regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster de elementos não-codificantes11. Além disso, o pacote de análise de dados descritos no presente protocolo e fornecido no GitHub fornece novos e experientes pesquisadores com ferramentas para analisar dados de ATAC-seq. ATAC-seq é o ensaio mais eficaz para mapear a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro, e modificações no protocolo existente que são introduzidas aqui permitirá que pesquisadores produzir dados de alta qualidade com baixa contaminação de DNA mitocondrial, redução de custos de sequenciamento e melhorar o throughput de ATAC-seq.
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Protocol
Este protocolo melhorado fornece instruções passo a passo para a realização de ATAC-seq de linfócitos CD4 +, de matérias-primas de sangue total por meio de análise de dados (Figura 1).
1. isolamento de células de CD4 + T do sangue inteiro
Nota: A matéria-prima para este protocolo é de 15 mL de sangue total fresco coletado usando procedimentos padrão, permitindo que a origem da matéria-prima a ser selecionado com base nos requisitos de pesquisa. Escala do protocolo conforme necessário. Pré-aquecer salina tamponada fosfato (PBS) + soro fetal bezerro de 2% (FCS) à temperatura ambiente (RT) e ajustar a centrífuga para RT antes de iniciar o processo de enriquecimento de célula CD4 + T.
- Adicionar 15 mL de sangue em um tubo cónico de 50 mL 750 µ l de humana CD4 + células T enriquecimento cocktail e misture suavemente por inversão. Incube a RT por 20 min. Quando a incubação é completa, adicionar 15 mL de PBS + 2% FCS para o tubo e misture suavemente por inversão.
- Prepare um tubo cónico fresco 50 mL com 15 mL de meio de densidade. Cuidadosamente a amostra de sangue diluído até o topo do meio de densidade, certificando-se para não perturbar a interface médio/sangue de densidade que forma da camada. Centrifugar por 20 min em 1.200 x g e RT com aceleração definida como 1 e o travão descendente fora.
Nota: É fundamental para definir a aceleração para 1 e decrescente freio fora no centrifugador para evitar o rompimento da camada de células em meio de densidade. - Colete as células T CD4 + enriquecidas através da interface de médio/plasma densidade utilizando uma pipeta de transferência tronco estreito. Transferi as células coletadas para um tubo de cónico de 50 mL. Centrifugar as células T CD4 + coletadas durante 8 min em 423 x g e RT
Nota: Certifique-se de retornar a aceleração centrífuga para freio 9 e decrescente para ON para etapa 1.3 e todas as etapas seguintes. - Desprezar o sobrenadante e lavar o centrifugado duas vezes com 50 mL de PBS + 2% FCS, centrifugação durante 8 min em 423 x g e RT. descartar o sobrenadante final Lave e suspender o centrifugado lavados em 2 mL de PBS + 2% FCS.
- Contar as células usando um hemocytometer. Para continuar com ATAC-seq, siga para o passo 2.3. Para congelar células para mais tarde processar, prossiga para o passo 1.6.
- Adicione 1 mL de meio fresco congelação (FCS 90% + 10% Dimetilsulfóxido) por 1 milhão de células. Alíquotas de 1ml de células no congelamento médio em tubos criogênicos de seguros. Coloque os tubos a-80 ° C durante a noite em um recipiente de congelamento lento. No dia seguinte, transferir os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
Nota: 1 milhão de células de CD4 + T será isolado por 2 mL de volume original de sangue. Congele a 500.000 células em alíquotas de 1 mL de meio de congelação. Faça meio gelado fresco em cada utilização.
2. ativar e purificar as células T CD4 +
Nota: Este protocolo rápido para ativar e purificar as células T CD4 + só requer 48 h e resultados em 95% viável, ativadas as células T CD4 +. Legal o centrifugador a 4 ° C antes de iniciar o protocolo.
- Descongele 1 frasco (500.000) de células T CD4 + em banho maria a 37 ° C até que o gelo derreteu-se só. Gentilmente transferi células para um tubo cônico de 15 mL, contendo 9 mL de pré-aquecido mídia Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), suplementada com 10% FCS, doravante referida como RPMI completa.
Nota: Não deixe células descongelar completamente para evitar exposição a DMSO. - Centrífuga para 6 min a 1500 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e suavemente, suspender o sedimento em 2 mL de RPMI completa. Repita o spin para baixo, desprezar o sobrenadante e suavemente suspender as células em 0,5 mL de RPMI completa.
- Conte as células usando um hemocytometer. Ajuste a densidade da suspensão celular com RPMI completa para 50.000 células em 200 µ l por alvéolo de uma placa de fundo redondo de 96 poços da placa.
Nota: De um tubo congelado de células T CD4 + de 500K, poços da placa 10 de 50.000 células T CD4 + em 200 µ l por bem. -
Prepare-se grânulos magnéticos conjugados com anticorpos humanos T-ativador anti-CD3 e anti-CD28.
- Alíquota de 12,5 µ l de grânulos de ativador T CD3/CD28 humanos por ATAC-seq amostra para um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos com 1 mL de 1X PBS e colocar o tubo em um ímã para 1 min.
- Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante claro, retire o tubo do ímã e suspender os grânulos em 13 µ l completar RPMI por amostra ATAC-seq.
Nota: Calcule a quantidade de contas necessárias com base no número de amostras de ATAC-seq sendo processada. Este protocolo requer 12,5 µ l de CD3/CD28 grânulos por 500.000 células, que constitui um exemplo de ATAC-seq.
- Ative as células T CD4 +. Coletar 500.000 células em 2,1 mL de meio RPMI completo em um tubo cônico de 15 mL e adicionar 12,5 µ l de grânulos de T-ativador humanos pre-lavados. Misture suavemente por inversão do tubo.
- Delicadamente, transferi as células com grânulos para um estéril reservatório e prato 200 µ l de células com grânulos por poço da placa de 96 poços de fundo redondo com uma pipeta multicanal. Incube durante 48 h a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
- Pós-incubação, centrifugar a placa de 96 poços para 8 min em 423 x g e RT. remover 100 µ l de meio por poço da placa de 96 poços, recolhendo-o para um tubo cônico antes de descartar para não garantir nenhuma perda de talão. Resuspenda o pellet de células nos restantes 100 µ l e coletar tudo em um tubo de 1,5 mL.
Nota: 10 poços de células T ativadas serão coletados em um volume de 1 mL. - Realize isolamento de CD4 +. Adicione 50 µ l de grânulos de CD4 conjugados pre-lavados para 500.000 células em 1 mL de RPMI completa. Combine os grânulos e células com uma pipeta. Incube durante 20 min a 4 ° C, na geladeira. Agite a mistura de célula cada 6 min e grânulos.
Nota: Este protocolo é para ser usado para obter um exemplo de 500.000 células. Ajuste como necessário para duas ou mais amostras de 500.000. - Quando a incubação estiver concluída, coloque o tubo sobre o ímã para 2 min. remover e descartar o sobrenadante quando clara. Lave as células grânulo-limite por retirar o tubo do ímã, suspendendo as células grânulo-limite em 1 mL de PBS + 2% FCS, substituir o tubo sobre o ímã para 1 min e descartar o sobrenadante claro. Repita este processo para um total de 3 lavagens.
Nota: Tenha cuidado para não descartar qualquer grânulos durante lavagens. - Após a lavagem final, coloque o tubo no ímã para 1 min. remover e descartar o sobrenadante e a pelota no gelo. Prossiga para a seção 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Nota: Nesta etapa, os núcleos estão isolados de células T CD4 + ativadas para ATAC-Seq A Lise utilizado neste protocolo foi melhorada para ser mais suave sobre os núcleos, resultando em uma digestão mais eficiente e resultados de qualidade superiores. Todas as etapas de centrifugação na secção 3 são executadas com uma centrífuga de ângulo fixo, mantida a 4 ° C. Legal da centrífuga antes de iniciar o protocolo.
- Realize isolamento núcleos. Resuspenda grânulos e células com tampão de Lise fria (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, MgCl2, 0,03% polissorbato 20 de 3 mM). Centrifugar imediatamente a 500 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover e descartar o sobrenadante.
- Realize a reação de transposase. Suspenda o sedimento de núcleos isolados com 50 µ l de mistura de transposase Tn5 (tabela 1). Incube em um thermocycler por 30 min a 37 ° C, com uma tampa de 40 ° C, mantendo a 4 ° C, quando completa.
- Após thermocycling, imediatamente realizar uma rotação de centrífuga de bancada rápido para baixo e colocar o tubo sobre o ímã para 1 min remover os grânulos do produto.
- Transferi o sobrenadante claro do tubo sobre o ímã para uma coluna de purificação de DNA. Lave a coluna com 250 µ l de Buffer PB e duas vezes com 750 µ l de tampão de PE. Eluir a amostra em 10 µ l de tampão de eluição. Siga directamente para o passo 3.5.
Nota: Esta etapa amplifica os fragmentos de DNA com os adaptadores ligados, aqui referidos como a biblioteca de ATAC-seq. A fim de multiplexar várias bibliotecas ATAC-seq para ser executado em uma pista NGS, use não indexadas 1 Primer para todas as amostras e um 2 diferente de Primer indexado para amostras individuais (tabela 2). As primeiras demão são usadas em concentrações de 1,25 µM a trabalhar. - Configurar a reação de amplificação do PCR inicial em um tubo PCR livre de nuclease, combinando os componentes na ordem e volume especificado no tabela 3. Coloque o tubo de PCR para o thermocycler e executar o programa de amplificação do PCR com condições ciclismo conforme especificado na tabela 4.
-
Monitore a reação por qPCR. Configure a reação de qPCR em um tubo PCR livre de nuclease, combinando os componentes na ordem e quantidade especificada na tabela 5. Na máquina de qPCR e ciclo como especificado na tabela 6.
- Para determinar que o número ideal de amplificação adicional ciclos para a reação de 45 µ l restantes, crie uma trama com número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y. O número ideal de ciclos de amplificação adicional é um terço do número de ciclos que leva para a reação de qPCR alcançar o planalto.
Nota: A reação de monitoramento por qPCR permite para determinação do número ideal de ciclos PCR desejado para obter amplificação de fragmento biblioteca ideal, minimizando o conteúdo GC e viés de tamanho.
- Para determinar que o número ideal de amplificação adicional ciclos para a reação de 45 µ l restantes, crie uma trama com número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y. O número ideal de ciclos de amplificação adicional é um terço do número de ciclos que leva para a reação de qPCR alcançar o planalto.
- Complete a final amplificação por PCR dos restantes µ 45 l de reação de PCR. Coloque o tubo de PCR com a reação de amplificação da etapa 3.5 no thermocycler e execute o programa conforme descrito na tabela 7.
Nota: Para amostras processadas conforme descrito no presente protocolo, o número total ideal de ciclos de amplificação da PCR estava determinado a ser 12. - Após a amplificação, purifica as bibliotecas usando um kit de limpeza PCR seguindo o protocolo do fabricante, de eluição em 25 µ l de tampão de eluição.
Nota: Bibliotecas amplificadas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 48 h ou congeladas a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.
4. análise da qualidade ATAC-seq biblioteca
Nota: É importante validar a qualidade e a quantidade de bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração de sequenciamento. A qualidade e a quantidade das bibliotecas devem ser avaliados usando kits comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
- Avalie a qualidade e quantidade das bibliotecas ATAC-seq usando uma plataforma baseada em microfluídica para dimensionamento, quantificação e controle de qualidade do DNA. Consulte a Figura 2 para resultados de avaliação de qualidade de representante.
Nota: A concentração das bibliotecas ATAC-seq deve ser > 1 ng / µ l para obter resultados de sequenciamento de qualidade. Em média, 30 nM em 25 µ l foi obtido.
5. sequenciamento e análise de dados
Nota: Esse pipeline de análise permite aos usuários controlar a qualidade das leituras procedimento de mapeamento, ajustar as coordenadas para o projeto experimental e chamar picos para análise a jusante. A seguir estão as linhas de comandos e a explicação da execução. O pacote de análise de dados está disponível em (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Sequencie as bibliotecas preparadas em um sequenciador de geração próxima a uma profundidade média de leitura de 42 milhões de leituras por amostra.
- Estime a qualidade de leituras de sequenciamento, verificando arquivos gerados pelo pacote de software de12 FastQC usando o comando:
fastqc -o < output_directory >< fastq_file > - Aparar as bases de leituras por software de13 Trimmomatic, se necessário, conforme determinado pela verificação de qualidade da FastQC, usando o comando (para par-ended):
Java-jar < caminho para o arquivo jar do trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< emparelhados Saída1 >< desirmanada Saída1 >< emparelhados output2 >< output2 não pareado > HEADCROP: < bases de culturas > - Alinhe leituras ao genoma humano referência (hg38) pelo software de14 Bowtie2:
bowtie2 - x < genoma de referência > -1 < entrada par 1 >< < arquivo de saída SAM > entrada par 2 > -S
Nota: O argumento - x é para o nome de base do índice para o genoma de referência, e -S é para a saída do formato de SAM. - Verificar a qualidade das leituras mapeadas usando o pacote de flagstat de15 Samtools:
samtools flagstat < arquivo BAM > - Classificar o arquivo mapeado leituras e remover duplicatas usando a ferramenta de16 de Picard:
Java-jar picard.jar entrada SortSam = < nome do arquivo SAM entrada > saída = < nome do arquivo de saída classificada BAM > SORT_ORDER = coordenada "e" java-jar picard.jar MarkDuplicates entrada = < classificada BAM arquivo > saída = < arquivo BAM de saída sem duplicatas > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Arquivo de índice BAM, aparar o cromossomo não utilizados lê e mudar as coordenadas para a razão experimental da ATAC-seq17:
Java-jar picard.jar entrada BuildBamIndex = < BAM arquivo >
samtools idxstats < arquivo entrada BAM > | corte -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v Crespo | xargs samtools Ver os -b < arquivo entrada BAM >>< saída aparadas arquivo BAM >
bedtools bamtobed -i < Input aparadas arquivo BAM >>< saída aparadas arquivo cama >
awk ' começar {OFS = "\t"}; {se ($6 = = "+") imprimir $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; imprimir mais US $1, $2-5, r $3-5, $4, $5, $6}' < Input aparadas arquivo cama >< aparado deslocado arquivo cama > - Exclua as leituras que são deslocadas para coordenação negativa:
awk '{se ($2 > 0) imprimir $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6}' < arquivo entrada cama >< arquivo de cama de coordenação não-negativo de saída >. - Converta o arquivo de cama para arquivo BAM para análise de18 seguinte DiffBind:
bedtools bedtobam -i < arquivo entrada cama > -g < genoma de referência >< arquivo de saída BAM > - Realizar chamada de pico pelo pacote de software DiffBind18 :
macs2 callpeak -t < arquivo entrada BAM > -f BAM -g Sh - nomodel - nolambda..--Mantenha-dup todos..--chamada-cúpulas - outdir < caminho do diretório de saída > - n < nome de saída > -B - q 0,01 - bdg..--turno -100 - extsize 200
Nota: Após a filtragem, espere uma mediana de 37 milhões de leituras por amostra. Contaminação de DNA mitocondrial variam de 0,30% – 5.39% (1,96% em média). Haverá uma baixa taxa de leituras multiplicar mapeadas (6,7% e 56%, 19% em média) e uma percentagem relativamente elevada de utilizável nuclear lê (60%-92%, 79% em média).
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Representative Results
De 15 mL de sangue total fresco, este protocolo gera uma média de 1 milhão de células de CD4 + T. Estes podem ser congelados para mais tarde processar ou usados imediatamente. Viabilidade das células T CD4 +, frescas ou descongeladas, foi consistentemente > 95%. Este método de isolamento de célula CD4 + T permite flexibilidade no tempo de material e a coleção de origem. Este protocolo ATAC-seq melhorado produz uma biblioteca final de mais de 1 ng / µ l para o sequenciamento. Controle de qualidade realizado utilizando sistemas comercialmente disponíveis deve demonstrar fragmentos de DNA entre 200 e 1.000 bp (Figura 2). Sequenciamento só deve ser realizado com bibliotecas de alta qualidade.
Todas as bibliotecas foram sequenciadas para uma profundidade média de mais de 40 milhões ler por amostra. Enquanto protocolos ATAC-seq comumente usados tem sido desafiados por contaminar leituras de sequenciamento do DNA mitocondrial que pode variar de 50% - 60% do total de sequenciamento leituras1 este protocolo melhorado elimina a questão. Bibliotecas preparadas este protocolo a seguir contêm em média apenas 3% de leitura mitocondrial (Figura 3A). A elevada percentagem de leituras utilizáveis é suficientemente constante através de réplicas biológicas (Figura 3B). O protocolo foi capaz de fornecer resultados altamente reprodutíveis pela técnicos replicados (Figura 4A, B), bem como réplicas biológicas (Figura 4, D). Além disso, o protocolo para CD4 + ativação de célula T apresentado leva 48 h ao invés de uma semana ou mais e resulta em ativação consistente e eficiente, como demonstrado pelos resultados reprodutíveis sequenciamento (Figura 4A, B). Picos de ATAC-seq previstos com precisão são chamados pelo pipeline de análise (Figura 4E). Análise dos resultados do sequenciamento identificadas alterações claras em estado de cromatina durante a ativação de células T humanas. Diferencialmente acessíveis regiões da cromatina aberta foram identificadas entre seis amostras antes e após 48 h de ativação (Figura 5).
Figura 1: visão geral Experimental do protocolo modificado ATAC-seq. (A) amostra de aquisição e processamento, de 15 mL de sangue de todo paciente com CD4 + T celular isolamento, chapeamento e ativação das células T e isolamento de núcleos com o melhoria do lysis. (B) o transposase reação e amplificação por PCR da biblioteca de sequenciamento. (C) qualidade análise, sequenciamento e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: bibliotecas de ATAC-seq representativa da alta qualidade de uma plataforma baseada em microfluídica para dimensionamento, quantificação e controle de qualidade do DNA. Imagem de gel de eletrônico (A) de amostras B1 e D1 com bandas entre 200 e 1.000 pares de bases. (B e C) Electroferograma resultado de rastreamento de amostras B1 (B) e D1 (C), com picos entre 200 e 1.000 pares de bases. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: diminuição da contaminação de DNA mitocondrial com os resultados de protocolo ATAC-seq melhoradas em um aumento nas leituras de sequenciamento de DNA utilizáveis. (A) comparação de utilizável lê (roxa), duplicata lê (verde) e leituras mitocondriais (vermelho) de T CD4 + células ATAC-seq perfis na literatura. (B) comparação de utilizável lê (roxa), duplicata lê (verde), lê mitocondrial (vermelho) e leituras desmapeadas (azul) de T CD4 + células ATAC-seq perfilação de vários indivíduos saudáveis (n = 22). Esta figura foi modificada de Cheng et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: melhorou a precisão e a reprodutibilidade do protocolo ATAC-seq. Espalhar a parcela de acessibilidade da cromatina (sinal ATAC-seq, x e y-Axes) para dois replicam as experiências de unstimulated (A; 36.486 Th picos) ou ativados (B; 52.154 Thstim de picos) células T demonstra reprodutibilidade técnica. Acessibilidade de cromatina para células T ativadas de indivíduos IGTB1191 (eixo y) e IGTB1190 (eixo x) (C) e histograma de correlações entre todos os pares de indivíduos para os picos de Thstim 52.154 (D) demonstra reprodutibilidade entre os indivíduos. (E) ATAC-seq picos chamado com nosso protocolo ATAC-seq melhorado no cromossomo 19 Q13.12. Esta figura foi modificada de Cheng et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: representante ATAC-seq resultados de alterações no estado de cromatina após a ativação de células T CD4 +. (A) visão Experimental (à esquerda) e nomenclatura (à direita). (B) diferencialmente acessíveis regiões da cromatina aberta (colunas) em seis amostras (linhas) antes (top, Th) e depois (inferior, Thstim) ativação de 48 h de primárias células T CD4 +. Esta figura foi modificada de Cheng et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 2 x Buffer TD | 25 Μ l |
| TN5 enzima | 5 Μ l |
| Água livre de nuclease | 20 Μ l |
| Volume total | 50 Μ l |
Tabela 1: Componentes de reação de transposase passo 3.2.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tabela 2: ATAC-seq oligos projetos usados para PCR.
| Água livre de nuclease | 11.9 Μ l |
| 100 µM usina personalizado Primer 1 (tabela 2) | 0,6 Μ l |
| NEBNext alta fidelidade 2 x PCR Master Mix | 25 Μ l |
| Biblioteca de ATAC-Seq | 10 Μ l |
| 25 µM usina personalizado Primer 2 (tabela 2) | 2,5 Μ l |
| Volume total | 50 Μ l |
Tabela 3: Mistura de reação de PCR inicial passo 3.5.
| ETAPA DO CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLOS DE |
| Extensão | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Recozimento | 63 ° C | 30 s | |
| Extensão | 72 ° C | 1 min | |
| Segure | 4 ° C | Infinito | 1 |
Tabela 4: 3.5 passo inicial PCR amplificação ciclismo programa.
| Alíquota de reação de PCR | 5 Μ l |
| Cocktail PCR no quadro 3 com 0,6 x Syber verde | 10 Μ l |
Tabela 5: Mistura de reação de qPCR passo 3.6.
| ETAPA DO CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLOS DE |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Recozimento | 63 ° C | 30 s | |
| Extensão | 72 ° C | 1 min | |
| Segure | 4 ° C | Infinito | 1 |
Tabela 6: Passo 3.6 qPCR ciclismo programa.
| ETAPA DO CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLOS DE |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | Conforme determinado |
| Recozimento | 63 ° C | 30 s | |
| Extensão | 72 ° C | 1 min | |
| Segure | 4 ° C | Infinito | 1 |
Tabela 7: Programa de ciclismo etapa 3.7 PCR para amplificação por PCR final.
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Discussion
O protocolo modificado de ATAC-seq apresentado neste artigo fornece resultados reprodutíveis com contaminação mínima de DNA mitocondrial. O protocolo tem sido usado para com êxito caracterizam a arquitetura da cromatina de humano primário PBMCs10, humanos monócitos, células dendríticas de rato (não publicadas), e11linhas de células de melanoma culta. Nós antecipamos essa lise melhorada condição tem o potencial de trabalho para outros tipos de células também. Prevê-se também que este protocolo de isolamento de núcleos será compatível com núcleos único ATAC-seq protocolos, minimizando a contaminação de DNA mitocondrial para melhorar resultados de sequenciamento.
Um benefício adicional do presente protocolo modificado é a capacidade de congelar lotes de células T CD4 + isoladas de PBMC em momentos diferentes, dependendo da disponibilidade de amostras de doentes. Como ATAC-seq então pode ser executada simultaneamente em todas as amostras, viés de efeito potencial lote na reação transposase e sequenciamento são minimizado10. É fundamental que esse meio de congelação ser feito fresco com cada uso, a fim de manter a viabilidade de alta que é alcançada com este protocolo de congelamento e descongelamento. Viabilidade das células CD4 + T isoladas deve permanecer acima de 90% para evitar a digestão específico no transposase reação1.
Por favor, note que a otimização adicional pode ser necessário para usar este protocolo com as quantidades e tipos de células variáveis. Desde que o rácio de transposase-para-núcleos Tn5 foi otimizado para 500.000 núcleos no presente protocolo, se realizando ATAC-seq com um número diferente de núcleos, a quantidade de Tn5 transposase deve ser ajustada em conformidade. Lise excessiva dos núcleos, devido a um excesso de Tn5 de fundo elevado pode originar de cromatina fechada e baixa complexidade das bibliotecas de sequenciamento, enquanto sob lise não pode fornecer uma completa PCR amplificados biblioteca1. Para evitar estas complicações, é aconselhável realizar cuidadosos núcleos contando e otimizar a relação Tn5 conforme necessário. Para melhorar ainda mais a qualidade dos dados, é aconselhável otimizar ciclos de amplificação da PCR, qPCR monitorando. Se a biblioteca final sofre muitos ciclos de amplificação, pode haver viés introduzido no sequenciamento dados2. Recomenda-se realizar o controle de qualidade adequado das bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração de sequenciamento para economizar tempo e dinheiro.
Como temos demonstrado, um tampão de Lise modificada é a chave para a redução da contaminação de DNA mitocondrial e é eficaz em uma ampla gama de tipos de células. Outros protocolos já abordou a questão da contaminação mitocondrial com Lise alternativa amortecedores7,19 , ou pelo processo intensivo de uma mediada por CRISPR mitochondrial DNA depleção20. Nosso protocolo alternativo de ATAC-seq contribui para o esforço para diminuir a contaminação de DNA mitocondrial de sequenciamento leituras com um tampão de Lise melhoria e conservação da simplicidade da ATAC-seq que torna uma técnica tão acessível. Junto com o RNA-seq e sequenciamento de célula única, ATAC-seq é uma ferramenta poderosa para explorar Regulamento epigenético. Isso melhorou o protocolo ATAC-seq e pacote de análise de dados vai ajudar a diminuir os custos de sequenciamento e produzir resultados de qualidade superiores.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Atsede Siba para suporte técnico. C.S.C é suportado pelo NIH grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
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