Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ مقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) على تنشيط اللمفاويات CD4 + البشرية. لقد تم تعديل البروتوكول للتقليل من تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي: من 50% إلى 3% من خلال إدخال مخزن مؤقت تحلل الجديدة.
Abstract
وأصبح أتاك-seq منهجية مستخدمة على نطاق واسع في دراسة التخلق بسبب نهجها سريعة وبسيطة لرسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً. في هذه الورقة نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة تقلل تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي:. بينما ناضلت البروتوكولات أتاك-seq السابقة مع يقرأ بمعدل 50% تلويث الحمض النووي، تحلل الأمثل المخزن المؤقت في هذا البروتوكول يقلل من تلوث الحمض النووي mitochondrial إلى متوسط 3%. يسمح هذا البروتوكول أتاك-seq محسنة لتخفيض تكلفة التسلسل قريب 50%. ونحن تثبت كيف يمكن إعداد هذه المكتبات أتاك-seq عالية الجودة من تنشيط خلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، توفير إرشادات خطوة بخطوة من اللمفاويات عزل خلايا CD4 + من الدم كله من خلال تحليل البيانات. هذا البروتوكول أتاك-seq تحسين قد تم التحقق من صحتها في طائفة واسعة من أنواع الخلايا، وسوف يكون للاستخدام الفوري للباحثين الذين يدرسون إمكانية الكروماتين.
Introduction
سرعان ما أصبحت المقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) الأسلوب الرائد لاستجواب العمارة الكروماتين. أتاك-seq يمكن تحديد مناطق الكروماتين موجوداً من خلال عملية تاجمينتيشن، وتفتيت ووضع علامات على الحمض النووي من الإنزيم نفسه، لإنتاج المكتبات التي يمكن تحديد تسلسل الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله. هو توسط هذه العملية تاجمينتاتيون ترانسبوساسي Tn5 مفرط، مما يقطع فقط فتح مناطق الكروماتين بسبب عائق الفراغية نوكليوسوميك. كما أنه يخفض، ترانسبوساسي Tn5 أيضا بإدراج تسلسل المحولات التي تسمح ببناء مكتبة السريع ببكر وتسلسل الجيل القادم من الكروماتين موجوداً على نطاق الجينوم1،2.
وقد أصبح أتاك-seq الأسلوب المفضل لتحديد مناطق الكروماتين إمكانية الوصول إلى سبب بروتوكول بسيط وسريع نسبيا، ونوعية ونطاق المعلومات التي يمكن تحديدها من نتائجها، وكمية صغيرة من ابتداء من المواد المطلوبة. مقابل seq الدناز3 (الذي يقيس أيضا إمكانية الحصول على نطاق الجينوم الكروماتين)، seq منسى4 (الذي يحدد مواقف نوكليوسومي في المناطق المفتوحة الجينوم)، وفورمالدهايد بوساطة فير-seq5، أتاك-seq أسرع، أرخص وأكثر استنساخه1. كما أنها أكثر حساسية، العمل مع ابتداء من المواد لعدد قليل من نويات 500، بالمقارنة مع الأنوية 50 مليون المطلوب ل seq الدناز3. وقد أتاك-seq أيضا القدرة على تقديم مزيد من المعلومات حول بنية الكروماتين من الأساليب الأخرى، بما في ذلك مناطق ملزمة عامل النسخ، نوكليوسومي لتحديد المواقع، و مناطق الكروماتين المفتوحة1. تم التحقق من بروتوكولات seq أتاك الفعال، خلية واحدة، تقديم معلومات عن العمارة الكروماتين في خلية واحدة المستوى6،7.
وقد استخدمت أتاك-seq لتوصيف العمارة الكروماتين عبر طائفة واسعة من أنواع البحوث والخلايا، بما في ذلك النباتات8،9من البشر، والعديد من الكائنات الحية الأخرى. كما كان حاسما في تحديد لائحة جينية للمرض الدول7. ومع ذلك، يشمل البروتوكول أتاك-seq الأكثر استخداماً العيب الرئيسي التلوث قراءة تسلسل الحمض النووي. في بعض مجموعات البيانات، ويمكن أن يكون هذا مستوى التلوث تصل إلى 60 في المائة من تسلسل النتائج1. وهناك جهد متضافر في الحقل لتقليل هذه القراءات المتقدرية تلويث بغية السماح للتطبيق أكثر كفاءة من أتاك-seq7،،من1011. هنا نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة يقلل من معدل التلوث الحمض النووي mitochondrial إلى 3 في المائة فقط، مما يتيح الحد من حوالي 50% في تسلسل تكاليف10. أصبح هذا ممكناً من خلال عملية مبسطة اللمفاويات عزل خلايا CD4 + والتنشيط ومؤقت تحلل تحسن مهم في التقليل من تلوث الحمض النووي mitochondrial.
وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول seq موديفيداتاك مع مجموعة واسعة نطاق من الخلايا الابتدائية، بما فيها البشرية الدم المحيطي الابتدائي الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)10ووحيدات الأساسية البشرية والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور). فقد استخدمت أيضا بنجاح استجواب خطوط خلايا سرطان الجلد في شاشة يكرر المتناوب قصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات من العناصر غير الترميز11. بالإضافة إلى ذلك، توفر الحزمة تحليل البيانات المبينة في هذا البروتوكول، وقدمت في GitHub الباحثين الجدد وذوي الخبرة مع أدوات لتحليل البيانات أتاك-seq. أتاك-seq هو التحليل الأكثر فعالية لتعيين الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله والتعديلات على البروتوكول القائمة التي يتم إدخالها هنا ستسمح للباحثين لإنتاج بيانات عالية الجودة مع انخفاض التلوث الحمض النووي mitochondrial، تخفيض تكاليف التسلسل وتحسين الإنتاجية أتاك-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يوفر هذا البروتوكول تحسين الإرشادات خطوة بخطوة لأداء أتاك-seq لخلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، من المواد بدءاً من الدم كله من خلال تحليل البيانات (الشكل 1).
1-عزل خلايا CD4 + تي الخلايا من الدم كله
ملاحظة: انطلاق المواد لهذا البروتوكول 15 مل دم كله الطازجة التي تم جمعها باستخدام الإجراءات القياسية، السماح لمصدر المواد البداية ليتم تحديده استناداً إلى متطلبات البحوث. نطاق البروتوكول حسب الحاجة. فوسفات الحارة قبل مخزنة المالحة (PBS) + 2% مصل العجل الجنين (FCS) بدرجة حرارة الغرفة (RT) وضبط أجهزة الطرد المركزي إلى RT قبل بدء الإجراء تخصيب خلية CD4 + T.
- إضافة ميليلتر 750 البشرية CD4 + تي خلية الإثراء كوكتيل إلى 15 مل دم كله في أنبوب 50 مل مخروطية والمزيج بلطف بانعكاس. تبني على RT لمدة 20 دقيقة. عند الانتهاء من الحضانة، إضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2% إلى الأنبوب وتخلط بلطف بانعكاس.
- إعداد أنبوب مخروطي طازجة 50 مل مع 15 مل من الكثافة المتوسطة. طبقة العينة الدم المخفف على الأعلى من متوسط الكثافة، ويجري التأكد من عدم تعطيل الواجهة الكثافة المتوسطة/الدم الذي يشكل بعناية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1200 × ز و RT بالتعجيل بتعيين إلى 1، والفرامل تنازلي قبالة.
ملاحظة: من المهم تعيين التسارع إلى 1 وتنازلي الفرامل قبالة في النابذة تفادي تعطل طبقة خلية في المتوسط الكثافة. - جمع الخلايا CD4 + T المخصب من واجهة البلازما المتوسطة/كثافة استخدام ماصة نقل جذعية ضيق. نقل الخلايا التي تم جمعها إلى أنبوب مخروطي طازجة 50 مل. الطرد المركزي الخلايا CD4 + T التي تم جمعها لمدة 8 دقائق في 423 × ز والرايت
ملاحظة: تأكد من العودة تسريع أجهزة الطرد المركزي إلى الفرامل 9 وتنازلي بشأن الخطوة 1.3 وكافة الخطوات التالية. - تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه خلية مرتين مع 50 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2%، سينتريفوجينج لدقيقة 8 423 x ز وتجاهل الرايت المادة طافية النهائي تغسل وتعليق بيليه خلية غسلها في 2 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2%.
- حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. للمتابعة مع أتاك-seq، انتقل إلى الخطوة 2، 3. لتجميد الخلايا للمعالجة فيما بعد، تابع إلى الخطوة 1، 6.
- أضف 1 مل من الطازجة المتوسطة التجميد (FCS 90% + 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد) كل الخلايا 1 مليون. 1 مل الكوة الخلايا في تجميد المتوسطة في الأنابيب المبردة آمنة. ضع الأنابيب في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاوية تجميد بطيء. وفي اليوم التالي نقل أنابيب للنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: سوف تكون خلايا CD4 + "تي" 1 مليون معزولة الواحدة 2 مل حجم الأصلي للدم كله. تجميد الخلايا 500,000 في مختبرين 1 مل من تجميد المتوسطة. جعل المتوسطة تجميد جديدة في كل استخدام.
2-تفعيل ونق ر خلايا CD4 +
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول السريع لتفعيل وتنقية خلايا CD4 + T فقط ح 48 والنتائج في 95% قابلة للاستمرار، بتنشيط خلايا CD4 + T. بارد الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية قبل البدء بالبروتوكول.
- ذوبان الجليد قنينة 1 (500,000) من خلايا CD4 + T في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى مجرد قد ذاب الجليد. بلطف بنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 9 مل من حرارة قبل الوسائط روزويل بارك التذكاري المعهد-1640 (ربمي-1640) تستكمل مع السفح 10%، يشار إلى ربمي كاملة.
ملاحظة: لا تدع الخلايا ذوبان الجليد تماما لتجنب التعرض إلى [دمس]. - أجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقيقة في 1500 x ز و 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وتعليق بيليه برفق في 2 مل ربمي كاملة. كرر وتدور إلى أسفل وتجاهل المادة طافية، وتعليق الخلايا في 0.5 مل ربمي كاملة بلطف.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. ضبط كثافة تعليق خلية مع ربمي كاملة لوحة خلايا 50,000 في 200 ميليلتر كل من لوحة أسفل جولة 96-جيدا جيدا.
ملاحظة: من أنبوب المجمدة واحد ك 500 CD4 + "تي" الخلايا، لوحة 10 آبار 50,000 خلايا CD4 + T في 200 ميليلتر كل بئر. -
إعداد المغناطيسي الخرز مترافق مع البشرية المنشط تي-CD3 المضادة ومكافحة CD28 الأجسام المضادة.
- الكوة ميليلتر 12.5 من حبات المنشط تي-CD3/CD28 البشرية كل عينة أتاك-seq لأنبوب 1.5 مل. أغسل الخرز مع 1 مل من 1 x PBS ووضع الأنبوب في مغناطيس لمدة 1 دقيقة.
- بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية واضحة وإزالة الأنبوب من المغناطيس، وتعليق الخرز في 13 ميليلتر الكامل ربمي كل عينة أتاك-seq.
ملاحظة: حساب كمية الخرز اللازمة استناداً إلى عدد العينات seq أتاك يجري تجهيزها. ويتطلب هذا البروتوكول 12.5 ميليلتر من حبات CD3/CD28 كل الخلايا 500,000، الذي يشكل أحد أتاك-seq عينة.
- تنشيط خلايا CD4 + T. جمع الخلايا 500,000 في 2.1 مل متوسطة ربمي كاملة في أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة 12.5 ميليلتر من حبات المنشط تي البشرية قبل غسلها. المزيج بلطف بعكس الأنبوب.
- نقل الخلايا مع الخرز بلطف إلى عقيمة ميليلتر 200 خزان ولوحة الخلايا مع الخرز الواحدة جيدا من أسفل جولة لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات. احتضانها ح 48 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
- مرحلة ما بعد الحضانة، والطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 8 دقائق في 423 × ز والرايت إزالة 100 ميليلتر من المتوسطة الواحدة وكذلك من لوحة 96، حسنا، جمع إلى أنبوب مخروطي قبل تجاهل لضمان عدم فقدان حبة. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميليلتر 100 المتبقية، وجمع كل شيء في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: سيتم جمع 10 آبار لتنشيط خلايا تي في وحدة تخزين 1 مل. - أداء CD4 + العزل. إضافة 50 ميليلتر من قبل غسلها CD4 مترافق الخرز إلى خلايا 500,000 في 1 مل ربمي كاملة. دمج خلايا والخرز ماصة. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الثلاجة. تحرض الخرز وخلية الخليط كل 6 دقيقة.
ملاحظة: هذا البروتوكول استخدامها لنموذج واحد من الخلايا 500,000. ضبط حسب الضرورة لعينات اثنين أو أكثر من 000 500 دولار. - عند اكتمال الحضانة، ضع الأنبوب على المغناطيس لإزالة الحد الأدنى 2 وتجاهل المادة طافية عندما واضحة. تغسل حبة ربط الخلايا بإزالة الأنبوب من المغناطيس وتعليق الخلايا حبة زمنياً في 1 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2% واستبدال الأنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة، وتجاهل المادة طافية واضحة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل.
ملاحظة: احرص على عدم تجاهل أي حبات خلال يغسل. - بعد الغسيل النهائي، ضع الأنبوبة في المغناطيس للحد الأدنى 1 إزالة وتجاهل المادة طافية ومكان بيليه على الجليد. انتقل إلى القسم 3 (أتاك-seq).
3-أتاك-seq
ملاحظة: في هذه الخطوة، نواة معزولة من تنشيط خلايا CD4 + T لما يليها أتاك تم تحسين تحلل المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول أن يكون الطف على الأنوية، مما أدى إلى هضم أكثر كفاءة وأعلى جودة النتائج. يتم تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي في القسم 3 بالطرد مركزي زاوية ثابتة الإبقاء على 4 درجة مئوية. بارد الطرد المركزي قبل البدء بالبروتوكول.
- إجراء العزل الأنوية. ريسوسبيند الخرز والخلايا مع تحلل الباردة المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 10 مم كلوريد الصوديوم، 3 مم MgCl2، بوليسوربيت 0.03% 20). الطرد المركزي فورا في 500 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل المادة طافية.
- القيام برد فعل ترانسبوساسي. تعليق بيليه نواة معزولة مع 50 ميليلتر من Tn5 ترانسبوساسي ميكس (الجدول 1). احتضان في ثيرموسيكلير مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع غطاء 40 درجة مئوية، عقد في 4 درجات مئوية عند الانتهاء.
- بعد ثيرموسيكلينج، فورا أداء تدور الطرد مركزي benchtop سريعة إلى أسفل ومكان الأنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة لإزالة الخرز من المنتج.
- نقل المادة طافية واضحة من الأنبوب في المغناطيس لعمود تنقية الحمض النووي. أغسل العمود مرة واحدة مع 250 ميليلتر من "الجريدة الرسمية المخزن المؤقت" ومرتين مع ميليلتر 750 من PE المخزن المؤقت. الوت العينة في 10 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت. انتقل مباشرة إلى الخطوة 3.5.
ملاحظة: يضاعف هذه الخطوة الشظايا من الحمض النووي مع محولات الواصلة، يشار إليه هنا المكتبة أتاك-seq. من أجل متعدد عدة مكتبات أتاك-seq ليتم تشغيله على أحد خ ع لين، استخدام غير مفهرسة التمهيدي 1 لجميع العينات و 2 التمهيدي المفهرسة المختلفة للعينات الفردية (الجدول 2). وتستخدم كبسولة تفجير في العمل تركيزات ميكرومتر 1.25. - قم بإعداد رد الفعل التضخيم بكر الأولى في أنبوب بكر نوكلاس خالية، الجمع بين المكونات الموجودة في النظام، ووحدة التخزين المحددة في الجدول 3- ضع الأنبوب بكر إلى ثيرموسيكلير وتشغيل البرنامج التضخيم PCR مع ظروف ركوب كما هو محدد في الجدول 4.
-
مراقبة رد فعل عن طريق قبكر. قم بإعداد رد فعل قبكر في أنبوب بكر نوكلاس خالية، الجمع بين المكونات الموجودة في النظام والمبلغ المحدد في الجدول 5. مكان في آلة قبكر، ودورة كمحدد في الجدول 6.
- لتحديد العدد الأمثل للتضخيم إضافية دورات لرد فعل ميليلتر 45 المتبقية، خلق مؤامرة مع عدد دورة على المحور السيني والأسفار النسبي (رفو) على المحور الصادي. العدد الأمثل لدورات إضافية التضخيم هو ثلث عدد دورات يستغرق لرد فعل qPCR للوصول إلى الهضبة.
ملاحظة: رصد رد فعل من جانب qPCR يسمح لتحديد العدد الأمثل لدورات PCR المطلوب للحصول على مكتبة الأمثل يفتت التضخيم مع تقليل GC محتوى وحجم التحيز.
- لتحديد العدد الأمثل للتضخيم إضافية دورات لرد فعل ميليلتر 45 المتبقية، خلق مؤامرة مع عدد دورة على المحور السيني والأسفار النسبي (رفو) على المحور الصادي. العدد الأمثل لدورات إضافية التضخيم هو ثلث عدد دورات يستغرق لرد فعل qPCR للوصول إلى الهضبة.
- إكمال التضخيم PCR النهائي من ميليلتر 45 المتبقية لتفاعل PCR. ضع الأنبوب PCR مع رد فعل التضخيم من الخطوة 3.5 مرة أخرى في ثيرموسيكلير وتشغيل البرنامج كما هو موضح في الجدول 7.
ملاحظة: لعينات معالجتها كما هو موضح في هذا البروتوكول، تقرر مثلى مجموع عدد دورات التضخيم بكر أن 12. - بعد اكتمال التضخيم تنقية المكتبات باستخدام مجموعة أدوات تنظيف PCR بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، الوتينج في 25 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف.
ملاحظة: يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية ليصل إلى 48 ح المكتبات تضخيم أو المجمدة في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
4-أتاك-seq مكتبة نوعية التحليل
ملاحظة: من المهم التحقق من نوعية وكمية من مكتبات seq أتاك قبل تسلسل الجيل القادم. ينبغي إجراء تقييم نوعية وكمية للمكتبات باستخدام أدوات متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
- تقييم نوعية وكمية من مكتبات seq أتاك باستخدام منصة المستندة إلى ميكروفلويديكس لتغيير الحجم والقياس الكمي ومراقبة الجودة للحمض النووي. انظر الشكل 2 لنتائج تقييم نوعية الممثل.
ملاحظة: يجب أن يكون تركيز المكتبات أتاك-seq > 1 نانوغرام/ميليلتر للحصول على نتائج الجودة التسلسل. في المتوسط، 30 نانومتر في 25 ميليلتر تم الحصول عليها.
5-تسلسل وتحليل البيانات
ملاحظة: أنابيب تحليل هذا يسمح للمستخدمين بالتحكم في جودة ما يلي: تعيين الإجراء، ضبط إحداثيات للتصميم التجريبي، وتستدعي قمم تحليل المتلقين للمعلومات. فيما يلي بعض أسطر الأوامر وشرح للتنفيذ. تتوفر الحزمة تحليل البيانات (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- التسلسل المكتبات المعدة في التسلسل جيل القادم لمتوسط عمق قراءة من القراءات 42 مليون كل عينة.
- تقدير جودة ما يلي التسلسل بالتحقق من الملفات التي تم إنشاؤها بواسطة حزمة برامج12 فاستقك باستخدام الأمر:
فاستقك-س < output_directory >< fastq_file > - تقليم أسس ما يلي عن طريق تريموماتيك13 البرمجيات، إذا لزم الأمر، كما يحددها الاختيار نوعية فاستقك، باستخدام الأمر (لزوج انتهت):
جافا-جرة < المسار إلى ملف جرة تريموماتيك > PE < input1 >< input2 >< زوجي output1 >< مزاوج output1 >< output2 زوجي >< مزاوج output2 > هيادكروب: < المحاصيل القواعد > - محاذاة للجينوم البشرية المرجع (hg38) على ما يلي حسب البرنامج14 Bowtie2:
bowtie2-x < مرجع الجينوم > < زوج الإدخال 1 ><-1 إدخال زوج 2 >-S < ملف الإخراج سام >
ملاحظة: الحجة-x ل basename الفهرس للجينوم المرجع، و-S لسام تنسيق الإخراج. - تحقق من ثيكواليتي من استخدام حزمة فلاجستات15 سامتولس المعين على ما يلي:
سامتولس فلاجستات < أم ملف > - فرز ملف معين على ما يلي، وإزالة التكرارات باستخدام أداة16 بيكار:
جافا-جرة picard.jar "الإدخال سورتسام" = < اسم ملف الإدخال سام > الإخراج = < اسم ملف الإخراج فرزها أم > SORT_ORDER = تنسيق "و" جافا-جرة picard.jar ماركدوبليكاتيس الإدخال = < المفروزة أم ملف > الإخراج = < ملف الإخراج أم دون تكرارات > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - تقليم على كروموسوم غير المستخدمة ما يلي "أم مؤشر" الملف، وتحويل الإحداثيات للسبب التجريبي seq أتاك17:
جافا-جرة picard.jar "الإدخال بويلدبامينديكس" = < أم ملف >
سامتولس إيدكسستاتس < "أم إدخال" ملف > | قص-و 1 | شري-v grep | grep-v شرم | كرون-v grep | عرض سامتولس xargs-ب < ملف "الإدخال أم" >>< إخراج قلص أم ملف >
بامتوبيد بيدتولس-i < اقتطاعها الإدخال ملف أم >>< إخراج قلص سرير ملف >
awk 'تبدأ {OFS ="\t"}؛ {إذا ($6 = = "+") طباعة $1، $2 + 4، $3 + 4، 4 دولار، ومبلغ 5، 6 دولار؛ وطباعة آخر $1، $2-5، $3-5، 4 دولار، مبلغ 5، 6 دولار} ' < اقتطاعها الإدخال ملف سرير >< Trimmed تحول سرير ملف > - حذف ما يلي: أن ينقل إلى التنسيق السلبية:
awk '{إذا طباعة ($2 > 0) $1"\t"$2"\t"$3"\t"$4"\t"$5"\t"$6}' < "سرير إدخال" ملف >< ملف الإخراج التنسيق غير سالب سرير >. - تحويل ملف سرير إلى ملف أم لتحليل18 ديفبيند التالية:
بيدتوبام بيدتولس-i < "سرير إدخال" ملف >-ز < مرجع الجينوم >< "أم إخراج" ملف > - إجراء استدعاء الذروة بحزمة البرامج18 ديفبيند:
macs2 كالبياك-t < "أم إدخال" ملف >-إف أم-ز hs-نوموديل-نولامبدا-تبقى-الحزب الديمقراطي الوحدوي جميعا--نداء-مؤتمرات-أووتدير < مسار الدليل الإخراج >-n < اسم الإخراج >-ب-q 0.01-bdg-التحول-100-اكستسيزي 200
ملاحظة: بعد تصفية، نتوقع متوسط القراءات 37 مليون كل عينة. وسوف تتراوح mitochondrial DNA التلوث بين 0.30 – 5.39% (1.96 في المائة في المتوسط). وسوف يكون هناك معدل منخفض لضرب المعينة ما يلي: (6.7%-56%، 19% في المتوسط) ونسبة عالية نسبيا من قابلة للاستخدام النووي يقرأ (60%-92%، 79 في المائة في المتوسط).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من 15 مل دم كله جديدة، ينشئ هذا البروتوكول في وسط خلايا CD4 + "تي" 1 مليون. وهذه يمكن المجمدة للمعالجة فيما بعد أو استخدامها على الفور. الجدوى لخلايا CD4 + T، طازجة أو المذابة، كان دائماً > 95%. يسمح هذا الأسلوب لعزل خلايا CD4 + T للمرونة في الوقت مصدر المواد وجمع. وتنتج هذا البروتوكول أتاك-seq تحسين مكتبة نهائي يزيد عن 1 نانوغرام/ميليلتر للتسلسل. يجب أن تثبت مراقبة جودة تنفيذ استخدام الأنظمة المتاحة تجارياً شظايا من الحمض النووي بين 200 و 000 1 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 2). يجب إجراء التسلسل فقط مع مكتبات ذات جودة عالية.
كانت متسلسلة جميع المكتبات بمتوسط عمق أكبر من 40 مليون قراءة كل عينة. بينما استخداماً أتاك-seq البروتوكولات قد طعن بتلويث ما يلي تسلسل من الحمض النووي التي يمكن أن تتراوح من 50%-60% مجموع التسلسل ما يلي:1 يحل هذا البروتوكول تحسين المسألة. تحتوي مكتبات أعدت عقب هذا البروتوكول على 3 في المائة فقط في المتوسط المتقدرية يقرأ (الشكل 3A). ارتفاع النسبة المئوية للاستخدام ما يلي: ثابت بما فيه الكفاية عبر replicates البيولوجية (الشكل 3B). وكان البروتوكول قادرة على تقديم النتائج استنساخه بدرجة عالية عبر تقنية replicates (الشكل 4 أ، ب) فضلا عن replicates البيولوجية (الشكل 4، د). بالإضافة إلى ذلك، البروتوكول لخلايا CD4 + تنشيط خلية تي قدم تستغرق 48 ساعة بدلاً من أسبوع واحد أو أكثر، ويؤدي التنشيط متسقة وفعالة، كما يتضح من النتائج استنساخه بالتسلسل (الشكل 4 أ، ب). توقع أتاك-seq قمم تسمى بدقة بتحليل خط الأنابيب (4E الشكل). تحليل نتائج تسلسل تحديد تغييرات واضحة في الدولة الكروماتين أثناء تنشيط الخلية تي البشرية. وحددت مناطق الكروماتين مفتوحة الأثران موجوداً بين ست عينات قبل وبعد 48 ساعة من التنشيط (الشكل 5).
رقم 1: التجريبية نظرة عامة على تعديل البروتوكول أتاك-seq. (أ) عينة من اقتناء وتجهيز، من 15 مل دم كله المريض من خلال خلايا CD4 + T الخلية العزل والطلاء وتنشيط خلايا تي، وعزل الأنوية مع تحلل المحسنة المخزن المؤقت. (ب) ترانسبوساسي رد الفعل والتضخيم PCR مكتبة التسلسل. (ج) نوعية التحليل وتسلسلها، وتحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مكتبات أتاك-seq تمثيلية عالية الجودة من منصة المستندة إلى ميكروفلويديكس لتغيير الحجم والقياس الكمي ومراقبة الجودة للحمض النووي- (أ) صورة جل الإلكترونية عينات B1 و D1 مع النطاقات بين 200 و 000 1 زوج قاعدي. (ب وج) نتيجة التتبع اليكتروفيروجرام لعينات B1 (ب) ومد-1 (ج)، مع قمم بين 200 و 000 1 زوج قاعدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: انخفاض التلوث الحمض النووي mitochondrial مع تحسين نتائج بروتوكول seq أتاك زيادة في تسلسل الحمض النووي للاستخدام على ما يلي- يقرأ مقارنة (أ) صالحة للاستعمال (الأرجواني)، يقرأ مكررة (الأخضر)، ويقرأ المتقدرية (الأحمر) من خلايا CD4 + T الخلية أتاك-seq التنميط في الأدب. يقرأ مقارنة (ب) صالحة للاستعمال (أرجواني) ويقرأ مكررة (الأخضر) ويقرأ المتقدرية (أحمر) وغير المعينة ما يلي: (أزرق) لخلايا CD4 + "تي" خلية أتاك-seq التنميط من الأشخاص الأصحاء متعددة (n = 22). لقد تم تعديل هذا الرقم من تشنغ et al.10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحسين أتاك-تسلسل البروتوكول إمكانية تكرار نتائج ودقتها. مبعثر مؤامرات للوصول الكروماتين (أتاك-seq إشارة x وياكسيس)، لاثنين تكرار تجارب من أونستيمولاتيد (A; 36,486 ال ذري) أو تنشيط (ب؛ 52,154 ثستيم قمم) خلايا T يوضح إمكانية تكرار نتائج التقنية. الكروماتين إمكانية الوصول لتنشيط خلايا تي من الأفراد IGTB1191 المحور (ص) و IGTB1190 (س) (ج) ويوضح الرسم البياني للعلاقات المتبادلة بين كل زوج من الأفراد لقمم ثستيم 52,154 (د) إمكانية تكرار نتائج بين الأفراد. (ﻫ) أتاك-seq قمم تسمى لدينا بروتوكول أتاك-seq محسنة في كروموسوم 19 Q13.12. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشنغ et al.10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: نتائج التغييرات في الدولة الكروماتين بعد تنشيط خلايا CD4 + تي خلية الممثل أتاك-seq. نظرة عامة تجريبية (A) (يسار) والتسمية (يمين). (ب) موجوداً خلطات مناطق الكروماتين مفتوحة (الأعمدة) في ست عينات (الصفوف) قبل (أعلى، Th) وبعد (أسفل، الstim) تفعيل ح 48 من خلايا CD4 + T أولية. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشنغ et al.10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 2 × TD المخزن المؤقت | 25 ميليلتر |
| إنزيم TN5 | 5 ميليلتر |
| نوكلاس المياه مجاناً | 20 ميليلتر |
| الحجم الإجمالي | 50 ميليلتر |
الجدول 1: 3.2 خطوة ترانسبوساسي رد فعل مكونات.
| Ad1_noMX: آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكجتكجكاجكجتكاجاتجتج |
| Ad2.1_TAAGGCGA كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجككتاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.2_CGTACTAG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتاجتاكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.3_AGGCAGAA كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتكتجككتجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.4_TCCTGAGC كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجكتكاجاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.5_GGACTCCT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجاجتككجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.6_TAGGCATG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجككتاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.7_CTCTCTAC كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتاجاجاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.8_CAGAGAGG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتككتكتكتجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.9_GCTACGCT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجكجتاجكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.10_CGAGGCTG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاجككتكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.11_AAGAGGCA كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتكتجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.12_GTAGAGGA كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتككتكتاكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.13_GTCGTGAT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاتكاكجاكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.14_ACCACTGT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكاجتجتجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.15_TGGATCTG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاجاتككاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.16_CCGTTTGT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكااكججتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.17_TGCTGGGT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكككاجكاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.18_GAGGGGTT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاككككتكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.19_AGGTTGGG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكككاككتجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.20_GTGTGGTG كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاككاكاكجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.21_TGGGTTTC كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجااكككاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.22_TGGTCACA كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتجاككاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.23_TTGACCCT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاججتكاجتكتكجتججكتكجاجاتجت |
| Ad2.24_CCACTCCT كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجاجتججتكتكجتججكتكجاجاتجت |
الجدول 2: أتاك-seq أوليجوس التصاميم المستخدمة لبكر.
| نوكلاس المياه مجاناً | ميليلتر 11.9 |
| 100 ميكرومتر مخصصة نيكستيرا التمهيدي 1 (الجدول 2) | ميليلتر 0.6 |
| نيبنيكست عالية الدقة 2 x ميكس سيد بكر | 25 ميليلتر |
| مكتبة أتاك-Seq | 10 ميليلتر |
| 25 ميكرومتر مخصصة نيكستيرا التمهيدي 2 (الجدول 2) | ميليلتر 2.5 |
| الحجم الإجمالي | 50 ميليلتر |
الجدول 3: 3.5 الخطوة الأولى بكر رد فعل مزيج.
| دورة خطوة | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 5 دقيقة | 1 |
| تمسخ الأولى | 98 درجة مئوية | 30 s | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 s | 10 |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 s | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| عقد | 4 درجة مئوية | انفينيتي | 1 |
الجدول 4: 3.5 الخطوة الأولى بكر التضخيم الدراجات البرنامج.
| [بكر] رد فعل قاسمة | 5 ميليلتر |
| كوكتيل بكر من الجدول 3 مع 0.6 x Syber الأخضر | 10 ميليلتر |
الجدول 5: 3.6 خطوة qPCR رد فعل مزيج.
| دورة خطوة | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| تمسخ الأولى | 98 درجة مئوية | 30 s | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 s | 20 |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 s | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| عقد | 4 درجة مئوية | انفينيتي | 1 |
الجدول 6: برنامج ركوب qPCR 3.6 خطوة.
| دورة خطوة | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| تمسخ الأولى | 98 درجة مئوية | 30 s | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 s | كما تحدد |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 s | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| عقد | 4 درجة مئوية | انفينيتي | 1 |
الجدول 7: برنامج ركوب PCR 3.7 خطوة للنهائي [بكر] تضخيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ينص البروتوكول أتاك-seq المعدلة المقدمة في هذه المقالة النتائج استنساخه مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي mitochondrial. البروتوكول قد المستخدمة لنجاح تميز الكروماتين العمارة البشرية الأولية ببمكس10، وحيدات البشرية، والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور)، وخطوط الخلية الميلانوما مثقف11. ونحن نتوقع هذا تحلل تحسين حالة لديه القدرة على العمل من أجل أنواع الخلايا الأخرى، وكذلك. من المتوقع أيضا أن هذا البروتوكول العزلة الأنوية سوف تكون متوافقة مع نواة واحدة أتاك-seq البروتوكولات، والتقليل من التلوث الحمض النووي mitochondrial لتحسين نتائج التسلسل.
فائدة إضافية لهذا البروتوكول المعدل هو القدرة على تجميد دفعات خلايا CD4 + T معزولة من ببمكس في أوقات مختلفة تبعاً لتوافر عينات المرضى. كما يمكن إجراء أتاك-seq ثم في نفس الوقت على جميع العينات، دفعة أثر التحيز المحتمل في رد فعل ترانسبوساسي والتسلسل هو مصغر10. من الأهمية بمكان بذل تلك الوسيلة تجميد جديدة مع كل استخدام، من أجل الحفاظ على استمرارية عالية أن يتحقق مع هذا البروتوكول تجميد أذاب. ينبغي أن تظل إمكانية عزل خلايا CD4 + "تي" أعلاه 90% تفاديا لهضم غير محدد في رد فعل ترانسبوساسي1.
يرجى ملاحظة أن التحسين إضافية قد يلزم من أجل استخدام هذا البروتوكول مع أنواع الخلايا المتغيرة والكميات. حيث قد تم تحسين نسبة ترانسبوساسي إلى نوى Tn5 لنوى 500,000 في هذا البروتوكول، إذا كان أداء seq أتاك مع عدد مختلف من نوى، ينبغي تعديل مبلغ ترانسبوساسي Tn5 تبعاً لذلك. تحلل الإفراط نويات نظراً لوجود فائض Tn5 قد يؤدي إلى خلفية عالية من الكروماتين مغلقة وتضخم منخفضة تعقيد تسلسل المكتبات، بينما تحلل وكيل قد لا توفر بكر كاملة مكتبة1. ولتفادي هذه المضاعفات، ينصح بأداء دقيق النوى العد، وتحسين نسبة Tn5 حسب الضرورة. لزيادة تحسين نوعية البيانات، ينصح بتحسين بكر التضخيم دورات عن طريق رصد qPCR. إذا كانت المكتبة النهائي يخضع لدورات التضخيم كثيرة جداً، قد يكون هناك تحيز في تسلسل البيانات2. من المستحسن القيام بمراقبة الجودة الصحيحة المكتبات seq أتاك قبل تسلسل الجيل القادم توفيرا للوقت والمال.
كما أظهرنا، تحلل تعديل المخزن مؤقت هو مفتاح للحد تلويث الحمض النووي mitochondrial وفعالة على طائفة واسعة من أنواع الخلايا. بروتوكولات أخرى تناولت مسألة التلوث المتقدرية مع تحلل البديلة المخازن المؤقتة7،19 أو بواسطة عملية مكثفة وساطة كريسبر الميتوكوندريا الحمض النووي استنفاد20. لدينا بروتوكول أتاك-seq البديلة يسهم في الجهود الرامية لخفض تلوث الحمض النووي mitochondrial يقرأ التسلسل مع مخزن مؤقت لتحلل تحسين والمحافظة على بساطة أتاك-seq الذي يجعل من أسلوب موجوداً. جنبا إلى جنب مع تسلسل الحمض النووي الريبي وتسلسل خلية واحدة، أتاك-seq أداة قوية لاستكشاف التنظيم جينية. هذا التحسن في البروتوكول seq أتاك والحزمة تحليل البيانات سوف يساعد إنقاص تكاليف التسلسل وتنتج نتائج ذات جودة أعلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر سيبا اتسيدي للدعم التقني. C.S.C. معتمد من قبل 1R61DA047032 منحة المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
