Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en analyse for transposase-tilgængelige kromatin sekventering (ATAC-seq) på aktiverede CD4 + humane lymfocytter. Protokollen er blevet ændret for at minimere kontaminering af mitokondriel DNA læsninger fra 50% til 3% gennem indførelse af en ny lysisbuffer.
Abstract
ATAC-seq er blevet en meget anvendt metode i studiet af Epigenetik på grund af sin hurtige og enkle tilgang til kortlægning genome-wide tilgængelige kromatin. I dette papir præsenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokol, der reducerer forurener mitokondriel DNA læser. Mens tidligere ATAC-seq protokoller har kæmpet med læser et gennemsnit på 50% forurener mitokondrie-DNA, den optimerede lysisbuffer indført i denne protokol reducerer mitokondriel DNA forurening til et gennemsnit på 3%. Denne forbedrede ATAC-seq protokol giver mulighed for en i nærheden af 50% reduktion i sekventering omkostninger. Vi demonstrere, hvordan disse høj kvalitet ATAC-seq biblioteker kan fremstilles af aktiverede CD4 + lymfocytter, giver trinvise instruktioner fra CD4 + lymfocyt isolation fra fuldblod gennem analyse af data. Denne forbedrede ATAC-seq protokol er blevet valideret i en lang række celletyper og vil være til umiddelbar nytte for forskere studerer kromatin tilgængelighed.
Introduction
Assay for transposase-tilgængelige kromatin sekventering (ATAC-FF.) er hurtigt blevet den førende metode til spørgekriterierne kromatin arkitektur. ATAC-seq kan identificere regioner af tilgængelige kromatin gennem processen med tagmentation, fragmentering og mærkning af DNA af det samme enzym til fremstilling af biblioteker som sekvensering kan bestemme kromatin tilgængelighed på tværs af en hel genom. Denne tagmentation proces er medieret af en hyperaktiv Tn5 transposase, som kun skærer åbne områder af kromatin på grund af nucleosomic sterisk hindring. Som det skærer, indsætter Tn5 transposase også sekventering adaptere, der giver mulighed for hurtig bibliotek opbygning af PCR og næste generation sequencing genome-wide tilgængelige kromatin1,2.
ATAC-seq er blevet den foretrukne metode til at bestemme regioner af kromatin tilgængelighed på grund af relativt enkel og hurtig protokol, kvalitet og udvalg af oplysninger, der kan bestemmes ud fra dens resultater, og lille mængde starter materiale kræves. I forhold til DNase-seq3 (som også måler genome-wide kromatin tilgængelighed), MNase-seq4 (som bestemmer nucleosome positioner i åben genom regioner), og at formaldehyd-medieret FAIRE-seq5, ATAC-seq er hurtigere, billigere og mere reproducerbare1. Det er også mere følsomme, arbejder med begyndende materiale af så få som 500 kerner, i forhold til de 50 millioner kerner kræves for DNase-FF.3. ATAC-seq har også evnen til at give flere oplysninger om kromatin arkitektur end andre metoder, herunder regionerne transskription faktor bindende, nucleosome placering og åbne kromatin regioner1. Effektiv, encellede ATAC-seq protokoller er blevet valideret, med oplysninger om kromatin arkitektur på én celle niveau6,7.
ATAC-seq er blevet brugt til at karakterisere kromatin arkitektur på tværs af et bredt spektrum af typer af forskning og celler, herunder planter8, mennesker9og mange andre organismer. Det har også været kritisk at identificere epigenetisk regulering af sygdom stater7. Den mest udbredte ATAC-seq protokol indeholder dog den store ulempe ved forurening sekventering læsninger fra mitokondrie-DNA. I nogle datasæt, kan denne forurening niveau være så høj som 60% af sekventering resultater1. Der er en samordnet indsats i feltet for at reducere disse kontaminerende mitokondrie læser for at muliggøre en mere effektiv anvendelse af ATAC-FF.7,10,11. Her præsenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokol, der reducerer den mitokondrielle DNA forurening sats til kun 3%, så reduktion på omkring 50% i sekventering omkostninger10. Dette er gjort muligt af en strømlinet proces af CD4 + lymfocyt isolation og aktivering og en forbedret lysisbuffer, der er kritisk i at minimere mitokondriel DNA forurening.
Denne modifiedATAC-seq protokol er blevet valideret med en bred vifte af primærelementer, herunder menneskelige primære perifert blod mononukleære celler (PBMC)10, menneskelig primær monocytter og mus dendritiske celler (upubliceret). Det har også været anvendt med succes til at afhøre melanom cellelinjer i et klyngemiljø regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) skærm af ikke-kodende elementer11. Derudover giver analyse datapakke beskrevet i denne protokol og leveres på GitHub nye og erfarne forskere med værktøjer til at analysere ATAC-seq data. ATAC-seq er den mest effektive assay at kortlægge kromatin tilgængelighed på tværs af en hel genom, og ændringer i den eksisterende protokol, der er indført her giver forskere til at producere data af høj kvalitet med lav mitokondriel DNA forurening, at reducere sekventering omkostninger og forbedre ATAC-seq overførselshastighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forbedrede protokol indeholder trinvise instruktioner til at udføre ATAC-seq af CD4 + lymfocytter, fra råvare fuldblod gennem analyse af data (figur 1).
1. isolering af CD4 + T-celler fra fuldblod
Bemærk: Råvaren til denne protokol er 15 mL frisk fuldblod indsamlet ved hjælp af standard procedurer, så kilde af råvaren skal vælges baseret på forskningsbehov. Skalere protokollen efter behov. Pre varm phosphat bufferet saltvand (PBS) + 2% føtalt kalveserum (FCS) til stuetemperatur (RT) og justere centrifuge til RT før start CD4 + T celle berigelse procedure.
- Tilføje 750 µL af menneskelige CD4 + T-celle berigelse cocktail til 15 mL fuldblod i en 50 mL konisk slange og blandes forsigtigt ved inversion. Der inkuberes ved RT i 20 min. Når inkubation er færdig, tilsættes 15 mL PBS + 2% FCS til røret og blandes forsigtigt ved inversion.
- Forberede en frisk 50 mL konisk slange med 15 mL af tæthed medium. Omhyggeligt lag fortyndet blodprøven på toppen af tæthed medium, Sørg for ikke at forstyrre den tæthed medium/blod grænseflade, der danner. Der centrifugeres i 20 min. på 1.200 x g og RT med acceleration indstillet til 1 og den faldende bremse ned.
Bemærk: Det er afgørende at indstille acceleration til 1 og faldende bremse ned på centrifuge at undgå forstyrrelser af cellelag på mellemlang og tæthed. - Indsamle beriget CD4 + T celler fra tæthed medium/plasma interface ved hjælp af smalle stilk overførsel pipette. Overføre de indsamlede celler til en frisk 50 mL konisk slange. Centrifugeres de indsamlede CD4 + T-celler for 8 min på 423 x g og RT.
Bemærk: Sørg for at vende tilbage centrifuge accelerationen til 9 og faldende bremse til ON i trin 1.3 og alle de følgende trin. - Supernatanten og vaske den celle pellet to gange med 50 mL PBS + 2% FCS, centrifugering for 8 min på 423 x g og RT. kassere den endelige supernatanten vaske og suspendere vasket celle pellet i 2 mL PBS + 2% FCS.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. For at fortsætte med ATAC-FF., Fortsæt til trin 2.3. For at fryse celler til senere behandling, Fortsæt til trin 1,6.
- Der tilsættes 1 mL frisk indefrysning medium (90% FCS + 10% dimethylsulfoxid) pr. 1 million celler. Alikvot 1 mL af celler i frysning medium i kryogene sikker rør. Sted rør ved-80 ° C natten over i en beholder, langsom-frysning. Den næste dag, overføre rør til flydende kvælstof til langtidsopbevaring.
Bemærk: 1 million CD4 + T-celler bliver isoleret pr. 2 mL af oprindelige volumen af fuldblod. Fryse 500.000 celler i 1 mL alikvoter af indefrysning medium. Gøre friske indefrysning medium på hver brug.
2. Aktivér og rense CD4 + T celler
Bemærk: Denne hurtige protokol for aktivering og rensning af CD4 + T celler kun kræver 48 h og resultater i 95% levedygtige, aktiverede CD4 + T-celler. Cool centrifuge til 4 ° C før begyndelsen af protokollen.
- Tø 1 hætteglas (500.000) af CD4 + T-celler i et 37 ° C vandbad indtil isen er bare smeltet. Forsigtigt Overfør celler til en 15 mL konisk tube indeholder 9 mL af pre varmede Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) medier suppleret med 10% FCS, herefter benævnt komplet RPMI.
Bemærk: Lad ikke celler tø helt for at undgå udsættelse for DMSO. - Der centrifugeres i 6 min. ved 1500 x g og 4 ° C. Supernatanten og forsigtigt suspendere pellet i 2 mL af komplet RPMI. Gentag spin ned, supernatanten fjernes, og forsigtigt suspendere celler i 0,5 mL af komplet RPMI.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. Juster tætheden af cellesuspension med komplet RPMI til plade 50.000 celler i 200 µL pr. brønd af en 96-brønd runde bundplade.
Bemærk: Fra én frosne rør af 500K CD4 + T celler, plade 10 brønde af 50.000 CD4 + T-celler i 200 µL pr. brønd. -
Forberede magnetiske perler konjugeret med human T-aktivator anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer.
- Alikvot 12,5 µL humant T-aktivator CD3/CD28 perler per ATAC-seq prøve til en 1,5 mL tube. Vaske perler med 1 mL af 1 x PBS og placere røret på en magnet for 1 min.
- Forsigtigt fjerne og supernatanten klar, fjerne røret fra magnet og suspendere perlerne i 13 µL komplet RPMI per ATAC-seq prøve.
Bemærk: Beregne mængden af perlerne nødvendige baseret på antallet af ATAC-seq prøver behandles. Denne protokol kræver 12,5 µL af CD3/CD28 perler per 500.000 celler, der udgør én ATAC-seq prøve.
- Aktivere CD4 + T-celler. Indsamle 500.000 celler i 2,1 mL af komplet RPMI medium i en 15 mL konisk slange og tilføje 12,5 µL af pre vasket human T-aktivator perler. Bland forsigtigt ved at vende røret.
- Forsigtigt overføre celler med perler til en steril reservoir og plade 200 µL af celler med perler pr. brønd af rund bund 96-brønd plade ved hjælp af en multi-kanal pipette. Der inkuberes i 48 timer i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Post inkubation, centrifugeres den 96-brønd plade i 8 min på 423 x g og RT. fjerne 100 µL af medium pr. brønd fra 96-brønd plade, indsamle det til en konisk slange før udsmid for at sikre ingen perle tab. Resuspenderes celle i de resterende 100 µL og indsamle alle i en 1,5 mL tube.
Bemærk: 10 brønde af aktiverede T-celler vil blive indsamlet i en 1 mL volumen. - Udføre CD4 + isolation. Tilføje 50 µL af pre vasket CD4 konjugeret perler til 500.000 celler i 1 mL af komplet RPMI. Kombinere perler og celler med pipette. Ruger i 20 min. ved 4 ° C i køleskabet. Agitere perler og celle blanding hver 6 min.
Bemærk: Denne protokol er skal bruges til en stikprøve af 500.000 celler. Justere som nødvendigt for to eller flere prøver af 500.000. - Når inkubation er færdig, placere røret på magnet for 2 min. Fjern og supernatanten når klart. Perle-bundet cellerne vaskes ved at fjerne røret fra magneten, suspendere perle-bundet celler i 1 mL PBS + 2% FCS, erstatte røret på magnet for 1 min og kassere klart supernatanten. Gentag denne proces for ialt 3 vasker.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at kassere alle perler under vasker. - Efter den sidste vask, placere røret på magnet for 1 min. Fjern og supernatanten og placere pelleten på is. Gå til afsnit 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Bemærk: I dette trin er kerner isoleret fra aktiverede CD4 + T-celler for ATAC-FF. Lysisbuffer bruges i denne protokol er blevet forbedret for at blive blidere på kerner, hvilket resulterer i mere effektiv fordøjelse og højere kvalitetsresultater. Alle centrifugering fremgangsmåden i afsnit 3 er udført med en fast vinkel centrifuge vedligeholdes ved 4 ° C. Cool centrifugen før du begynder protokol.
- Udføre kerner isolation. Resuspend perler og celler med kolde lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03% Polysorbat 20). Umiddelbart der centrifugeres 500 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern og kassér supernatanten.
- Udføre transposase reaktion. Suspendere den isolerede kerner pellet med 50 µL af Tn5 transposase mix (tabel 1). Inkuber i et thermocycler i 30 minutter ved 37 ° C med 40 ° C låg, holder ved 4 ° C når det er fuldført.
- Efter termocycler, straks udføre en hurtig benchtop centrifuge spin ned og Læg røret på magnet for 1 min fjerne perlerne fra produktet.
- Overføre klart supernatanten fra røret på magneten til en DNA oprensning kolonne. Vaske kolonnen med 250 µL af Buffer PB og to gange med 750 µL af Buffer PE. Elueres prøven i 10 µL af eluering buffer. Gå direkte til trin 3.5.
Bemærk: Dette trin forstærker DNA-fragmenter med de sammenskrevne adaptere, betegnes som ATAC-seq bibliotek. For at multiplex flere ATAC-seq biblioteker til at køre på én NGS vognbane, skal du bruge ikke-indekserede Primer 1 for alle prøver og en anden indekserede Primer 2 for individuelle prøver (tabel 2). Primere bruges på arbejder koncentrationer af 1,25 µM. - Oprettet den første PCR forstærkning reaktion i en nukleasen-fri PCR rør, kombinerer komponenterne i orden og mængden angivet i tabel 3. PCR-røret anbringes i thermocycler og køre PCR forstærkning program med cykling betingelser som angivet i tabel 4.
-
Overvåge reaktionen af qPCR. Opsætning af qPCR reaktion i en nukleasen-fri PCR rør, kombinerer komponenterne i orden og mængden angivet i tabel 5. Sted i qPCR maskine og cyklus som angivet i tabel 6.
- For at bestemme det optimale antal ekstra forstærkning cykler for de resterende 45 µL reaktion, skal du oprette et plot med cyklus nummer på x-aksen og relative fluorescens (RFU) på y-aksen. Det optimale antal ekstra forstærkning cykler er en tredjedel antallet af cyklusser det tager for qPCR reaktion at nå plateauet.
Bemærk: Overvågning reaktionen af qPCR giver mulighed for fastsættelse af det optimale antal PCR cyklusser ønskede at opnå optimal bibliotek fragment forstærkning samtidig minimere GC indhold og størrelse bias.
- For at bestemme det optimale antal ekstra forstærkning cykler for de resterende 45 µL reaktion, skal du oprette et plot med cyklus nummer på x-aksen og relative fluorescens (RFU) på y-aksen. Det optimale antal ekstra forstærkning cykler er en tredjedel antallet af cyklusser det tager for qPCR reaktion at nå plateauet.
- Fuldføre den endelige PCR-amplifikation af de resterende 45 µL PCR reaktion. Placer PCR rør med forstærkning reaktion fra trin 3.5 tilbage i thermocycler og Kør programmet som beskrevet i tabel 7.
Bemærk: For prøver behandles som beskrevet i denne protokol, var den optimale samlede antal PCR forstærkning cykler besluttet på at være 12. - Efter forstærkning er komplet, rense biblioteker ved hjælp af en PCR oprydning kit efter producentens protokol, eluerer i 25 µL af eluering buffer.
Bemærk: Forstærket biblioteker kan opbevares ved 4 ° C i op til 48 h eller frosset ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
4. ATAC-seq bibliotek kvalitet analyse
Bemærk: Det er vigtigt at validere kvaliteten og kvantiteten af ATAC-seq biblioteker før næste generation sequencing. Kvaliteten og kvantiteten af bibliotekerne bør vurderes ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (Se Tabel af materialer).
- Vurdere kvaliteten og kvantiteten af ATAC-seq biblioteker ved hjælp af en mikrofluidik-baseret platform til dimensionering, kvantificering og kvalitetskontrol af DNA. Se figur 2 for repræsentative kvalitet vurderingsresultater.
Bemærk: Koncentrationen af ATAC-seq biblioteker skal være > 1 ng/µL at opnå kvalitet sekventering resultater. Den gennemsnitlige, 30 nM i 25 µL blev opnået.
5. sekvensering og dataanalyse
Bemærk: Denne analyse rørledning tillader brugere at kontrollere kvaliteten af læser kortlægning procedure, justere koordinaterne for eksperimentelle design, og kalder toppe for downstream analyse. Følgende er de kommandoer linjer og forklaring af udførelse. Data analyse pakke er tilgængelig på (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Sekvens rede bibliotekerne på en næste generation sequencer til en gennemsnitlig Læs dybde 42 millioner læsninger pr. prøve.
- Vurdere kvaliteten af sekventering læser ved at kontrollere filer genereret af FastQC12 softwarepakke ved hjælp af kommandoen:
fastqc -o < output_directory >< fastq_file > - Trim baserne af læser ved Trimmomatic13 software, hvis det er nødvendigt, som bestemmes af den FastQC kvalitet check, ved hjælp af kommandoen (for par-ended):
Java-jar < sti til trimmomatic jar fil > PE < input1 >< input2 >< parret output1 >< uparret output1 >< parret output2 >< uparret output2 > HEADCROP: < beskære baser > - Juster læser til menneskelige reference genom (hg38) af Bowtie214 software:
bowtie2 - x < reference genom > -1 < input par 1 >< input par 2 > -S < outputfilen SAM >
Bemærk: Argumentet - x er for basename af indekset for reference genom, og -S er for SAM format output. - Check thequality af tilknyttede læser ved hjælp af Samtools15 flagstat pakke:
samtools flagstat < BAM fil > - Sortere den tilknyttede læser fil og fjerne dubletter ved hjælp af Picard16 værktøj:
Java-jar picard.jar SortSam INPUT = < input SAM filnavn > OUTPUT = < sorteret BAM outputfilnavn > SORT_ORDER = koordinat "og" java-jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = < sorteret BAM fil > OUTPUT = < output BAM fil uden dubletter > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Indeks BAM fil, trim ubrugte kromosom læsninger og Skift koordinaterne for den eksperimentelle grund af ATAC-seq17:
Java-jar picard.jar BuildBamIndex INPUT = < BAM fil >
samtools idxstats < Input BAM fil > | skære -f 1 | GREP - v chrY | GREP - v chrM | GREP - v chrUn | xargs samtools Se -b < Input BAM fil >>< Output trimmet BAM fil >
bedtools bamtobed -i < Input trimmet BAM fil >>< Output trimmet BED fil >
AWK ' begynde {OFS = "\t"}; {Hvis ($6 == "+") udskrive $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; ellers udskrive $1, $2-5, $3-5, $4, $5, $6}' < Input trimmet BED fil >< Trimmed flyttet BED fil > - Slet de læser, der er flyttet til negative koordinering:
AWK '{Hvis ($2 > 0) udskrive $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6}' < Input BED fil >< Output ikke-negative koordinering BED fil >. - Konvertere filen seng til BAM fil til følgende DiffBind18 analyse:
bedtools bedtobam -i < Input BED fil > -g < reference genom >< Output BAM fil > - Udføre peak kald af DiffBind18 softwarepakke:
macs2 callpeak -t < Input BAM fil > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--keep-dup alle--opkald-topmøder--outdir < Output mappesti > - n < Output navn > -B - q 0,01--bdg--Skift -100 - extsize 200
Bemærk: Efter filtrering, Forvent en median af 37 millioner læser pr. prøve. Mitokondriel DNA forurening vil variere fra 0,30% – 5.39% (1,96% i gennemsnit). Der vil være en lav sats af formere tilknyttede læser (6,7% – 56%, 19% i gennemsnit) og en forholdsvis høj procentdel af anvendelige nukleare læser (60% – 92%, 79% i gennemsnit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fra 15 mL frisk fuldblod genererer denne protokol et gennemsnit på 1 million CD4 + T-celler. Disse kan nedfryses til senere behandling eller anvendes straks. Levedygtighed af CD4 + T-celler, friske eller optøede, var konsekvent > 95%. Denne metode af CD4 + T celle isolation giver mulighed for fleksibilitet i kilde materiale og samling tid. Denne forbedrede ATAC-seq protokol producerer en endelige bibliotek på mere end 1 ng/µL til sekvensering. Kvalitetskontrol, der udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige systemer skal påvise DNA fragmenter mellem 200 og 1.000 bp (figur 2). Sekventering bør kun udføres med høj kvalitet biblioteker.
Alle biblioteker blev sekventeret til en gennemsnitlig dybde på mere end 40 millioner Læs pr. prøve. Mens almindeligt anvendte ATAC-seq protokoller er blevet anfægtet af kontaminerende sekventering læsninger fra mitokondrie-DNA, der kan spænde fra 50% - 60% af den samlede sekventering læser1 eliminerer denne forbedrede protokol problemet. Biblioteker udarbejdet efter denne protokol indeholder i gennemsnit kun 3% mitokondrie læser (figur 3A). Den høje procentdel af anvendelige læser er tilstrækkeligt konstant på tværs af biologiske flergangsbestemmelser (figur 3B). Protokollen var i stand til at levere yderst reproducerbare resultater på tværs af tekniske flergangsbestemmelser (figur 4A, B) samt biologiske flergangsbestemmelser (figur 4 c, D). Derudover protokol til CD4 + T-celle aktivering præsenteret tager 48 h i stedet for en uge eller mere og resulterer i ensartet og effektiv aktivering, som det fremgår af reproducerbare sekventering resultater (figur 4A, B). Forudsagte ATAC-seq toppe kaldes præcist ved analyse-rørledningen (figur 4E). Analyse af sekventering resultater identificeret klare ændringer i kromatin tilstand under human T-celle aktivering. Varierende tilgængelige regioner af åbne kromatin blev identificeret mellem seks prøver før og efter 48 h i aktivering (figur 5).
Figur 1: eksperimenterende oversigt over den ændrede ATAC-seq protokol. (A) prøve erhvervelse og forarbejdning, fra 15 mL patient fuldblod gennem CD4 + T celle isolation-plating og aktivering af T-celler og cellekerner isolation med den forbedrede lysisbuffer. (B) transposase reaktion og PCR-amplifikation af sekventering bibliotek. (C) kvalitet analyse, sekventering og dataanalyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative høj kvalitet ATAC-seq biblioteker fra en mikrofluidik-baseret platform til dimensionering, kvantificering og kvalitetskontrol af DNA. (A) elektroniske gel billede af prøver B1 og D1 med striber mellem 200 og 1.000 basepar. (B og C) Elektroferogrammet sporingsresultatet prøver B1 (B) og D1 (C), med tinder mellem 200 og 1.000 basepar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: nedsat mitokondriel DNA kontaminering med forbedret ATAC-seq protokol resulterer i en stigning i brugbart DNA-sekventering læser. (A) sammenligning af anvendelige læser (lilla), to eksemplarer læser (grøn) og mitokondriel læser (rød) fra CD4 + T celle ATAC-seq profilering i litteraturen. (B) sammenligning af anvendelige læser (lilla), to eksemplarer læser (grøn), mitokondrie læser (rød) og ikke-tilknyttede læser (blå) af CD4 + T celle ATAC-seq profilering fra flere raske personer (n = 22). Dette tal er blevet ændret fra Cheng et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: forbedret ATAC-seq protokol reproducerbarhed og præcision. Scatter parceller af kromatin tilgængelighed (ATAC-seq signal, x og y-axes) til to replikere eksperimenter af unstimulated (A; 36,486 Th tinder) eller aktiveret (B; 52,154 Thstim tinder) T-celler viser tekniske reproducerbarhed. Kromatin tilgængelighed for aktiverede T-celler fra personer IGTB1191 (y-aksen) og IGTB1190 (x-akse) (C) og histogram af korrelationer mellem hvert par af enkeltpersoner for de 52,154 Thstim toppe (D) viser reproducerbarhed mellem individer. (E) ATAC-seq toppe, kaldet med vores forbedrede ATAC-seq protokol på kromosom 19 Q13.12. Dette tal er blevet ændret fra Cheng et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentant ATAC-seq resultater af ændringer i kromatin tilstand efter CD4 + T-celle aktivering. (A) eksperimentelle oversigt (til venstre) og nomenklatur (til højre). (B) varierende tilgængelige regioner af åbne kromatin (kolonner) i seks prøver (rækker) før (øverst Th) og efter (nederst, Thstim) 48 h aktivering af primære CD4 + T-celler. Dette tal er blevet ændret fra Cheng et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 2 x TD Buffer | 25 ΜL |
| TN5 enzym | 5 ΜL |
| Nukleasen gratis vand | 20 ΜL |
| Samlede volumen | 50 ΜL |
Tabel 1: Trin 3.2 transposase reaktion komponenter.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tabel 2: ATAC-seq oligos design, der anvendes til PCR.
| Nukleasen gratis vand | 11.9 ΜL |
| 100 µM brugerdefinerede Nextera Primer 1 (tabel 2) | 0,6 ΜL |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | 25 ΜL |
| ATAC-Seq bibliotek | 10 ΜL |
| 25 µM brugerdefinerede Nextera Primer 2 (tabel 2) | 2,5 ΜL |
| Samlede volumen | 50 ΜL |
Tabel 3: Trin 3.5 indledende PCR-mastermix.
| CYKLUS TRIN | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Udvidelse | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Udglødning | 63 ° C | 30 s | |
| Udvidelse | 72 ° C | 1 min | |
| Hold | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabel 4: Trin 3.5 indledende PCR forstærkning cykling program.
| PCR reaktion alikvot | 5 ΜL |
| PCR Cocktail fra tabel 3 med 0,6 x Syber grøn | 10 ΜL |
Tabel 5: Trin 3.6 qPCR mastermix.
| CYKLUS TRIN | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Udglødning | 63 ° C | 30 s | |
| Udvidelse | 72 ° C | 1 min | |
| Hold | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabel 6: Trin 3.6 qPCR cykling program.
| CYKLUS TRIN | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | Som bestemt |
| Udglødning | 63 ° C | 30 s | |
| Udvidelse | 72 ° C | 1 min | |
| Hold | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabel 7: Trin 3.7 PCR cykling program for endelige PCR-amplifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ændrede ATAC-seq protokol præsenteret i denne artikel giver reproducerbare resultater med minimal mitokondriel DNA forurening. Protokollen har været vant til med held karakterisere kromatin arkitektur af menneskelige primære PBMC10, humane monocytter, mus dendritiske celler (upubliceret), og kulturperler melanom cell linjer11. Vi forventer denne forbedrede lysis betingelse har potentiale til at arbejde for andre celletyper. Det forventes også, at denne kerner isolation protokol vil være kompatibel med single kerner ATAC-seq protokoller, minimere mitokondriel DNA forurening for at forbedre sekventering resultater.
En yderligere fordel ved dette ændrede protokol er evnen til at fryse partier af isolerede CD4 + T celler fra PBMC på forskellige tidspunkter afhængigt af tilgængeligheden af patientprøver. Som ATAC-seq kan derefter udføres samtidigt på alle prøver, er potentielle batch effekt bias i transposase reaktion og sekventering minimeret10. Det er afgørende at indefrysning medium gøres frisk med hver brug, for at opretholde den høje levedygtighed, der er opnået med denne fryse-tø protokol. Levedygtighed af isolerede CD4 + T celler bør forblive over 90% for at undgå ikke-specifikke fordøjelsen i transposase reaktion1.
Bemærk venligst, at yderligere optimering kan være påkrævet for at bruge denne protokol med variabel celletyper og mængder. Da Tn5 transposase til kerner forholdet er blevet optimeret til 500.000 kerner i denne protokol, hvis udfører ATAC-seq med et forskelligt antal kerner, bør mængden af Tn5 transposase tilpasses tilsvarende. Overdreven lysering af kerner på grund af et overskud af Tn5 kan føre til høje baggrund fra lukkede kromatin og lav kompleksitet af sekventering biblioteker, mens under lysis ikke kan give en komplet PCR forstærket bibliotek1. For at undgå disse komplikationer, anbefales det at udføre omhyggelig kerner optælling og optimere Tn5 forholdet som nødvendigt. Yderligere at forbedre datakvaliteten, tilrådes det at optimere PCR forstærkning cyklusser af qPCR overvågning. Hvis den endelige bibliotek gennemgår for mange forstærkning cyklusser, der kan være bias indført i sequencing data2. Det anbefales at udføre korrekt kvalitetsstyring ATAC-seq biblioteker før næste generation sequencing for at spare tid og penge.
Som vi har påvist, en modificeret lysisbuffer er nøglen til reduktion af mitokondriel DNA forurening og er effektiv på en lang række celletyper. Andre protokoller har behandlet spørgsmålet om mitokondrie forurening med alternative lysis buffere7,19 eller af en CRISPR-medieret mitokondriel DNA udtynding20intensiv proces. Vores alternative ATAC-seq protokol bidrager til indsatsen for at mindske mitokondriel DNA kontaminering af sekventering læser med en forbedret lysisbuffer og bevarelse af enkelheden i ATAC-FF., der gør det sådan en tilgængelig teknik. RNA-FF. og encellede sekventering er ATAC-seq et kraftfuldt værktøj til at udforske epigenetisk regulering. Denne forbedrede ATAC-seq protokol og data analyse pakke vil hjælpe mindske sekventering omkostninger og højere kvalitet resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Atsede Siba for teknisk support. C.S.C. understøttes af NIH grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
