Summary
Aquí, presentamos un protocolo para realizar un ensayo para la transposasa accesible cromatina secuenciación (ATAC-seq) en linfocitos activados CD4 + humanos. El protocolo ha sido modificado para minimizar contaminación mitocondrial ADN lee desde 50% al 3% mediante la introducción de un nuevo tampón de lisis.
Abstract
ATAC-seq se ha convertido en una metodología ampliamente utilizada en el estudio de la epigenética debido a su enfoque rápido y sencillo mapeo genoma cromatina accesible. En este trabajo presentamos un protocolo mejorado de ATAC-seq que reduce contaminación mitocondrial ADN Lee. Mientras que los anteriores protocolos de ATAC-seq han luchado con un promedio de 50% contaminación de ADN mitocondrial Lee, el tampón de lisis optimizado en este protocolo reduce la contaminación del ADN mitocondrial en un promedio del 3%. Este protocolo de ATAC-seq mejorada permite reducción cerca del 50% del coste de la secuenciación. Demostramos cómo se pueden preparar estas bibliotecas de ATAC-seq de alta calidad de linfocitos CD4 + activados, proporcionando instrucciones paso a paso de CD4 + aislamiento de linfocitos desde la sangre a través de análisis de datos. Este protocolo mejora de ATAC-seq ha sido validado en una amplia gama de tipos celulares y será de uso inmediato a los investigadores estudiar la accesibilidad de la cromatina.
Introduction
El ensayo para la transposasa accesible cromatina secuenciación (ATAC-seq) se ha convertido rápidamente en el principal método para interrogar la arquitectura de la cromatina. ATAC-seq puede identificar regiones de cromatina accesible a través del proceso de tagmentation, la fragmentación y el marcaje de ADN por la misma enzima para producir bibliotecas con las que la secuencia puede determinar accesibilidad de cromatina a través de un genoma entero. Este proceso de tagmentation está mediada por la hiperactiva Tn5 transposasa, que sólo corta open las regiones de la cromatina debido al impedimento estérico nucleosomic. Como corta, el Tn5 transposasa inserta también adaptadores de secuenciación que permiten la construcción de la biblioteca rápido por PCR y secuenciación de próxima generación de genoma cromatina accesible1,2.
ATAC-seq se ha convertido en el método preferido para determinar las regiones de la accesibilidad de la cromatina por la protocolo relativamente simple y rápido, calidad y variedad de información que puede determinar a partir de sus resultados y la pequeña cantidad de material necesaria de partida. En comparación con DNasa-seq3 (que también mide la accesibilidad de todo el genoma cromatina), MNase-seq4 (que determina posiciones de nucleosoma en regiones del genoma abierto), y el formaldehído-mediada FAIRE-seq5, ATAC-seq es más rápido, más barato y más reproducible1. También es más sensible, trabajando con material de tan sólo 500 núcleos, en comparación con los núcleos 50 millones necesarios para DNasa-seq3de partida. ATAC-seq también tiene la capacidad para proporcionar más información sobre la arquitectura de la cromatina que otros métodos, incluyendo regiones de unión del factor de transcripción, posicionamiento nucleosoma y cromatina abierta las regiones1. Protocolos de ATAC-seq eficaces, unicelulares han sido validados, proporcionando información sobre la arquitectura de la cromatina en el nivel unicelular6,7.
ATAC-seq se ha utilizado para caracterizar la arquitectura de la cromatina en un amplio espectro de tipos de investigación y las células, incluyendo las plantas8, los seres humanos9y muchos otros organismos. También ha sido fundamental en la identificación de la regulación epigenética de la enfermedad los Estados7. Sin embargo, el protocolo más ampliamente utilizado de ATAC-seq incluye el mayor inconveniente de contaminación Lee de la secuencia de ADN mitocondrial. En algunos conjuntos de datos, este nivel de contaminación puede ser tan alta como 60% de la secuenciación de resultados1. Hay un esfuerzo concertado en el campo para reducir estos contaminantes Lee mitocondrial con el fin de permitir la aplicación más eficiente de ATAC-seq7,10,11. Aquí presentamos un protocolo mejorado de ATAC-seq que reduce la tasa de contaminación de ADN mitocondrial a apenas un 3%, lo que permite reducción de alrededor del 50% en los costos de la secuencia10. Esto es posible gracias a un proceso optimizado de aislamiento de linfocitos de CD4 + y la activación y un tampón de lisis mejorada que es crítica para minimizar la contaminación del ADN mitocondrial.
Este protocolo de modifiedATAC-seq ha sido validado con una amplia gama de células primarias, incluyendo las células mononucleares (PBMCs) de sangre periférica primaria10, monocitos humanos primarios y células dendríticas de ratón (inéditas). Se ha también utilizado con éxito para interrogar las líneas celulares de melanoma en una pantalla de otro regularmente cortas repeticiones palindrómico (CRISPR) agrupado de elementos no codificantes11. Además, el paquete de análisis de datos se describe en este protocolo y siempre en GitHub ofrece nuevos y experimentados investigadores con herramientas para analizar datos de ATAC-seq. ATAC-seq es el ensayo más efectivo al mapa accesibilidad de la cromatina a través de un genoma entero, y modificaciones en el protocolo existente que se introducen aquí permitirá a los investigadores producir datos de alta calidad con baja contaminación de ADN mitocondrial, reducir costos de secuenciación y mejorar rendimiento de ATAC-seq.
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Protocol
Este protocolo mejorado proporciona instrucciones paso a paso para realizar ATAC-seq de linfocitos CD4 +, del material a partir de sangre entera a través de análisis de datos (figura 1).
1. aislamiento de CD4 + células de T de la sangre entera
Nota: El material de partida de este protocolo es 15 mL de sangre entera fresca recogida mediante procedimientos estándar, permitiendo que la fuente del material de partida para ser seleccionado basado en requisitos de la investigación. El protocolo de la escala según sea necesario. Caliente previamente el tampón fosfato salino (PBS) + suero de ternera fetal 2% (FCS) a temperatura ambiente (RT) y ajustar la centrifugadora a RT antes de iniciar el procedimiento de enriquecimiento de células T CD4 +.
- Añadir 750 μl humana CD4 + células de T del enriquecimiento de cóctel a 15 mL de sangre entera en un tubo cónico de 50 mL y mezclar suavemente por inversión. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Al terminar la incubación, añadir 15 mL de PBS + 2% FCS en el tubo y mezclar suavemente por inversión.
- Preparar un tubo cónico de 50 mL fresco con 15 mL de medio de densidad. Cuidadosamente la muestra de sangre diluida en la parte superior de la media de densidad, asegurándose de no alterar la interfaz de media sangre de densidad que se forma de la capa. Centrifugar 20 min a 1.200 x g y RT con aceleración a 1 y el descendente freno OFF.
Nota: Es fundamental para establecer la aceleración 1 y descendiendo freno OFF en la centrífuga para evitar la interrupción de la capa de células en el medio de la densidad. - Recoger las células de T de CD4 + enriquecidas desde la interfaz de densidad medio, plasma con una pipeta de transferencia de tallo estrecho. Transferencia de células colectadas a un tubo cónico de 50 mL fresco. Centrifugar las células T CD4 + recogidas durante 8 min en 423 x g y RT.
Nota: Asegúrese de regresar la aceleración centrífuga a freno 9 y descendente on paso 1.3 y todos los pasos siguientes. - Desechar el sobrenadante y lavar el precipitado de células dos veces con 50 mL de PBS + 2% FCS, centrifugación durante 8 min x 423 g y RT. descartar el sobrenadante final lavar y suspender el precipitado de células lavadas en 2 mL de PBS + 2% FCS.
- Contar las células usando un hemocitómetro. Para continuar con ATAC-seq, continúe con el paso 2.3. Para congelar las células para su posterior procesamiento, proceda al paso 1.6.
- Añadir 1 mL de medio de congelación fresco (90% FCS + 10% de dimetilsulfóxido) por 1 millón de células. Alícuota 1 mL de células de congelación medio en tubos criogénicos de seguros. Colocar los tubos a-80 ° C durante la noche en un recipiente de congelación lenta. Al día siguiente, transferir los tubos en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
Nota: 1 millón de células T CD4 + serán aislados por 2 mL de volumen original de sangre. Congelar las 500.000 células en alícuotas de 1 mL de medio de congelación. Hacer medio de congelación fresco en cada uso.
2. activar y purificar las células de T CD4 +
Nota: Este protocolo rápido para activar y purificar las células T CD4 + sólo requiere 48 h y los resultados en el 95% de viable, activa las células T CD4 +. Enfriar el centrifugar a 4 ° C antes de comenzar el protocolo.
- Descongelar 1 vial (500.000) de células T CD4 + en un baño de agua de 37 ° C hasta que se derrita el hielo. Suavemente transferir las células a un tubo cónico de 15 mL que contiene 9 mL de precalentado media del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) suplementado con 10% FCS, en lo sucesivo como RPMI completo.
Nota: No permita que las células descongelar completamente para evitar la exposición a DMSO. - Centrífuga para 6 min a 1500 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y suavemente suspender el sedimento en 2 mL de RPMI completo. Repetir la vuelta hacia abajo, eliminar el sobrenadante y suavemente suspender las células en 0,5 mL de RPMI completo.
- Contar las células usando un hemocitómetro. Ajustar la densidad de la suspensión celular con RPMI completo a 50.000 células en 200 μL por pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos de la placa.
Nota: De un tubo congelado de las células T CD4 + de 500K, pozos de la placa 10 de 50.000 células T CD4 + de 200 μL por pozo. -
Preparar bolas magnéticas conjugados con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 de humanos T-activador.
- Alícuota 12,5 μl de humanos granos activador T CD3/CD28 por ATAC-seq muestra a un tubo de 1,5 mL. Lavar los granos con 1 mL de 1 x PBS y coloque el tubo en un imán para 1 minuto.
- Cuidadosamente retire y deseche el sobrenadante, retire el tubo del imán y suspender las cuentas de 13 μl completo RPMI por muestra de ATAC-seq.
Nota: Calcular la cantidad de granos necesarias basada en el número de muestras de ATAC-seq se procesa. Este protocolo requiere 12,5 μl de perlas CD3/CD28 por 500.000 células, que constituye una muestra de ATAC-seq.
- Activan las células T CD4 +. Recoger 500.000 células en 2,1 mL de Medio RPMI completo en un tubo cónico de 15 mL y agregar 12,5 μl de pre-lavado granos de activador T humanos. Mezclar suavemente por inversión del tubo.
- Transferir suavemente las células con los granos a una estéril depósito y placa 200 μL de células con perlas por pozo de placa de 96 pocillos de fondo redondo con una pipeta multicanal. Incubar durante 48 h a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
- Post incubación, Centrifugue la placa de 96 pocillos durante 8 min en 423 x g y RT. quitar 100 μl de medio por pocillo de la placa de 96 pocillos, recogiendo a un tubo cónico antes de desecharlo para no garantizar la pérdida de grano. Resuspender el precipitado de células en los restantes 100 μl y recoger en un tubo de 1,5 mL.
Nota: 10 pozos de células T activadas serán recogidos en un volumen de 1 mL. - Realizar el aislamiento de CD4 +. Añadir 50 μl de pre-lavado cuentas de CD4 conjugado a 500.000 células en 1 mL de RPMI completo. Combinar granos y las células con una pipeta. Incubar por 20 min a 4 ° C en la nevera. Agite la mezcla de celular cada 6 min y granos.
Nota: Este protocolo debe ser utilizada para una muestra de 500.000 células. Ajustar según sea necesario para dos o más muestras de 500.000. - Cuando la incubación se completa, coloque el tubo en el imán para 2 minutos Retire y descarte el sobrenadante cuando claro. Lavar las células grano-limite quitando el tubo del imán, suspender las células grano-limite en 1 mL de PBS + 2% FCS, reemplazando el tubo sobre el imán durante 1 min y descartar el sobrenadante. Repita este proceso para un total de 3 lavados.
Nota: Tenga cuidado de no descartar cualquier granos durante el lavado. - Después del último lavado, coloque el tubo en el imán durante 1 minuto, retire y descarte el sobrenadante y colocar el sedimento en el hielo. Proceder a la sección 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Nota: En este paso, los núcleos están aislados de las células T CD4 + activadas para ATAC-SS. El tampón de lisis utilizado en este protocolo se ha mejorado para ser más suaves para los núcleos, dando por resultado la digestión más eficiente y mayor calidad de los resultados. Todos los pasos de centrifugación en la sección 3 se realizan con una centrífuga de ángulo fijo mantenida a 4 ° C. Enfriar la centrífuga antes de comenzar el protocolo.
- Realizar el aislamiento de los núcleos. Resuspender los granos y las células con buffer de lisis frío (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, MgCl2, 0.03% polisorbato 20 de 3 mM). Centrifugar inmediatamente a 500 x g por 10 min a 4 ° C. Retire y descarte el sobrenadante.
- Realizar la reacción de la transposasa. Suspender el sedimento de núcleos aislados con 50 μl de mezcla de Tn5 transposasa (tabla 1). Incubar en un termociclador durante 30 min a 37 ° C con una tapa de 40 ° C, en 4 ° C cuando se haya completado.
- Después de termociclaje rápido, inmediatamente realizar un giro de centrífuga de sobremesa rápido hacia abajo y coloque el tubo en el imán durante 1 minuto eliminar los granos del producto.
- Transferir el sobrenadante del tubo en el imán a una columna de purificación de ADN. Lavar la columna una vez con 250 μl de tampón de PB y dos veces con 750 μl de Buffer PE. Eluir la muestra en 10 μl de tampón de elución. Proceder directamente al paso 3.5.
Nota: Este paso amplifica los fragmentos de ADN con los adaptadores de ligados, aquí denominados la biblioteca ATAC-seq. Para multiplexar varias bibliotecas de ATAC-seq para ejecutarse en un carril NGS, utilizar 1 cartilla para todas las muestras y una cartilla indexadas diferentes 2 muestras individuales (tabla 2). Imprimaciones se utilizan en concentraciones de 1,25 μm de trabajo. - Configurar la inicial reacción de amplificación de PCR en un tubo PCR libre de nucleasa, combinando los componentes en el orden y el volumen especificado en tabla 3. Coloque el tubo PCR en el termociclador y ejecutar el programa de amplificación de PCR con ciclismo las condiciones especificadas en la tabla 4.
-
Controlar la reacción mediante qPCR. Configurar la reacción de qPCR en un tubo PCR libre de nucleasa, combinando los componentes en el orden y la cantidad especificada en la tabla 5. En máquina de qPCR y ciclo como especifica en el cuadro 6.
- Para determinar que el número óptimo de amplificación adicional-ciclos de la reacción de 45 μl restantes, crear un diagrama con número del ciclo en el eje x y la fluorescencia relativa (RFU) en el eje y. El número óptimo de ciclos de amplificación adicional es un tercio el número de ciclos que tarda la reacción de qPCR llegar a la meseta.
Nota: Control de la reacción por qPCR permite para la determinación del número óptimo de ciclos PCR deseadas obtener amplificación del fragmento de biblioteca óptima minimizando el contenido de GC y el sesgo de tamaño.
- Para determinar que el número óptimo de amplificación adicional-ciclos de la reacción de 45 μl restantes, crear un diagrama con número del ciclo en el eje x y la fluorescencia relativa (RFU) en el eje y. El número óptimo de ciclos de amplificación adicional es un tercio el número de ciclos que tarda la reacción de qPCR llegar a la meseta.
- Completar el final amplificación por PCR de los restantes 45 μl de reacción de PCR. Vuelva a colocar el tubo PCR con la reacción de amplificación del paso 3.5 en el termociclador y ejecutar el programa como se describe en la Tabla 7.
Nota: Muestras procesadas tal como se describe en este protocolo, el número óptimo de ciclos de amplificación PCR se determinó que 12. - Después de la amplificación es completa, purificar las bibliotecas usando un kit de limpieza PCR siguiendo el protocolo del fabricante, liberador en 25 μl del buffer de elución.
Nota: Bibliotecas amplificadas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta 48 h o congeladas a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
4. ATAC-seq biblioteca calidad análisis
Nota: Es importante validar la calidad y cantidad de librerías de ATAC-seq antes de secuenciación de próxima generación. La calidad y cantidad de las bibliotecas deben evaluarse usando kits disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales).
- Evaluar la calidad y cantidad de las bibliotecas de ATAC-seq con una plataforma basada en microfluídica para medición, cuantificación y control de calidad de ADN. Vea la figura 2 para obtener resultados de evaluación de calidad representativa.
Nota: La concentración de las bibliotecas de ATAC-seq debe ser > 1 ng/μL para obtener resultados de la secuencia de calidad. En promedio, 30 nM en 25 μl se obtuvo.
5. secuenciación y análisis de datos
Nota: Este gasoducto de análisis permite a los usuarios controlar la calidad de la asignación de procedimiento Lee, ajustar las coordenadas de diseño experimental y llamar picos para análisis posteriores. Las siguientes son las líneas de comandos y la explicación de la ejecución. El paquete de análisis de datos está disponible en (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- La secuencia de las bibliotecas preparadas en un secuenciador de generación próxima a una profundidad media de lectura de 42 millones lecturas por muestra.
- Estimar la calidad de la secuencia Lee comprobando los archivos generados por FastQC12 paquete de software utilizando el comando:
fastqc -o < directorio_de_salida >< fastq_file > - Recortar las bases de Lee Trimmomatic13 software, si es necesario, según lo determinado por el control de calidad de FastQC, usando el comando (para par terminado):
Java-jar < ruta de acceso al archivo jar de trimmomatic > PE < input1 >< entrada2 >< pareadas Salida1 >< impar Salida1 >< pareadas output2 >< output2 impar > HEADCROP: < bases de cultivo > - Alinear Bowtie214 software lee al genoma humano de referencia (hg38):
bowtie2 - x < referencia genoma >-< entrada par 1 >< 1 entrada par 2 > - < archivo de salida SAM > S
Nota: El argumento - x es para el nombre del índice para el genoma de referencia, y es -S para la salida de formato de SAM. - Compruebe la lacalidad de lecturas asignadas con Samtools15 flagstat paquete:
samtools flagstat < archivo BAM > - Ordenar el archivo de lecturas asignadas y quitar duplicados utilizando Picard16 herramienta:
Java-jar picard.jar SortSam entrada = < nombre de archivo de SAM entrada > salida = < nombre de archivo de salida clasificado BAM > SORT_ORDER = coordenada "y" java-jar picard.jar MarkDuplicates entrada = < archivo clasificado de BAM > salida = < archivo BAM sin duplicados > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Archivo de índice BAM, recortar la Lee cromosoma y cambiar las coordenadas por la razón experimental de ATAC-seq17:
Java-jar picard.jar entrada BuildBamIndex = < archivo de BAM >
samtools idxstats < archivo entrada BAM > | Cut -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools ve -b < archivo de BAM entrada >>< salida recortada archivo BAM >
bedtools bamtobed -i < Input ajustado archivo BAM >>< salida recortada archivo de cama >
awk ' empezar {OFS = "\t"}; {Si ($6 == "+") imprimir $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; imprimir otro $1, $2-5, $3-5, $4, $5, $6}' < Input ajustado archivo cama >< cambiado de puesto en el recorte archivo de cama > - Eliminar la lee que es cambiados de puesto a coordinación negativa:
awk '{if ($2 > 0) imprimir $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6'} < archivo entrada cama >< archivo de salida no negativos coordinación cama >. - Convertir cama, archivo BAM para el siguiente análisis de18 DiffBind:
bedtools bedtobam -i < archivo entrada cama > -g < referencia genoma >< archivo de salida BAM > - Realizar llamadas de pico por el paquete de software18 de DiffBind:
macs2 callpeak -t < archivo entrada BAM > f - BAM -g hs - nomodel--nolambda--keep-dup todos--llamada cumbres--outdir < ruta de acceso de directorio de salida > - n < nombre > -B - q 0.01--bdg - cambio -100--extsize 200
Nota: Después de filtrar, esperar una media de 37 millones lecturas por muestra. Contaminación del ADN mitocondrial que van desde 0.30% a 5,39% (1,96% en promedio). Habrá una baja tasa de lecturas asignadas multiplicar (6.7%-56%, 19% en promedio) y un porcentaje relativamente alto de usables nuclear Lee (60% – 92%, 79% en promedio).
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Representative Results
De 15 mL de sangre entera fresca, este protocolo genera un promedio de 1 millón de células T CD4 +. Estos pueden congelados para más adelante procesar o utilizar inmediatamente. Viabilidad de las células T CD4 +, frescas o descongeladas, fue consistentemente > 95%. Este método de aislamiento de células T CD4 + permite flexibilidad en el tiempo de colección y material de fuente. Este protocolo mejora de ATAC-seq produce una biblioteca final de más de 1 ng/μL para la secuencia. Control de calidad realizado usando sistemas comercialmente disponibles deben demostrar fragmentos de ADN de entre 200 y 1.000 PB (figura 2). La secuencia debe realizarse sólo con bibliotecas de alta calidad.
Todas las bibliotecas fueron ordenadas a una profundidad media de más de 40 millones leer por muestra. Mientras que los protocolos de ATAC-seq utilizados han sido desmentidos por contaminar lecturas de secuenciación de ADN mitocondrial que puede ir de 50-60% del total secuenciación Lee1 este protocolo mejora elimina el problema. Bibliotecas preparadas siguiendo este protocolo contienen en promedio solamente 3% Lee mitocondrial (Figura 3A). El alto porcentaje de usable Lee es suficientemente constante a través de réplicas biológicas (figura 3B). El protocolo fue capaz de proporcionar resultados altamente reproducibles a través de repeticiones técnicas (Figura 4A, B) así como biológicos repeticiones (figura 4, D). Además, el protocolo para CD4 + activación de células T presentada tarda 48 horas en lugar de una semana o más y resulta en activación constante y eficiente, como lo demuestran resultados reproducibles de la secuencia (Figura 4A, B). Picos de ATAC-seq predichas exactamente son llamados por la tubería de análisis (figura 4E). Análisis de los resultados de secuenciación identificó cambios claros en estado de cromatina durante la activación de células T humanas. Se identificaron regiones diferencialmente accesibles de la cromatina abierta entre seis muestras antes y después de 48 h de activación (figura 5).
Figura 1: Resumen Experimental del protocolo modificado de ATAC-seq. (A) adquisición de la muestra y procesamiento, de 15 mL de sangre de todo paciente a través de T de CD4 + la célula de aislamiento, revestimiento y activación de las células T y aislamiento de núcleos con el tampón de lisis mejorada. (B) la transposasa reacción y amplificación por PCR de la biblioteca de la secuencia. (C) análisis de calidad, secuenciación y análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: bibliotecas de ATAC-seq representativas de alta calidad de una plataforma basada en microfluídica para medición, cuantificación y control de calidad de ADN. (A) imagen de gel electrónica de muestras B1 y D1 con bandas de entre 200 y 1.000 pares de bases. (B y C) Electroferograma resultado seguimiento de muestras B1 (B) y D1 (C), con picos entre 200 y 1.000 pares de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: disminución de contaminación del ADN mitocondrial con los mejores resultados de protocolo de ATAC-seq en un aumento de lecturas de secuenciación de ADN utilizables. (A) comparación de usable Lee (púrpura), duplicado Lee (verde) y Lee mitocondrial (rojo) de T de CD4 + la célula ATAC-seq perfilado en la literatura. (B) comparación de usable Lee (púrpura), duplicado Lee (verde), mitocondrial Lee (rojo) y Lee no asignada (azul) de T de CD4 + la célula ATAC-seq perfiles de múltiples individuos sanos (n = 22). Esta figura ha sido modificada de Cheng et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: mejora de ATAC-seq protocolo reproducibilidad y exactitud. Dispersión de parcelas de la accesibilidad de la cromatina (ATAC-seq señal, ejes x y y) para dos replican experimentos sin estimular (A; 36.486 Th picos) o activado (B; 52.154 Thstim picos) células T muestra la reproductibilidad técnica. Accesibilidad de la cromatina de las células T activadas de individuos IGTB1191 (eje y) y IGTB1190 (eje x) (C) y el histograma de las correlaciones entre cada pares de individuos de los picos de Thstim 52.154 (D) muestra la reproducibilidad entre los individuos. (E) ATAC-seq picos llamados con nuestro protocolo mejorado de ATAC-seq en el cromosoma 19 Q13.12. Esta figura ha sido modificada de Cheng et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Representante ATAC-seq resultados de cambios en el estado de la cromatina tras la activación del T-cell de CD4 +. (A) Resumen Experimental (izquierda) y la nomenclatura (derecha). (B) regiones diferencialmente accesibles de la cromatina abierta (columnas) en seis muestras (filas) antes (arriba, Th) y después (abajo, Thstim) activación de 48 horas de primario de células T CD4 +. Esta figura ha sido modificada de Cheng et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 2 x TD Buffer | 25 ΜL |
| Enzima de Tn5 | 5 ΜL |
| Agua libre de nucleasas | 20 ΜL |
| Volumen total | 50 ΜL |
Tabla 1: Componentes de la reacción de paso 3.2 transposasa.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tabla 2: ATAC-seq oligos diseños usados para PCR.
| Agua libre de nucleasas | 11.9 ΜL |
| 100 μm Nextera personalizado cartilla 1 (cuadro 2) | 0,6 ΜL |
| NEBNext alta fidelidad 2 x PCR Master Mix | 25 ΜL |
| Biblioteca de ATAC-Seq | 10 ΜL |
| Cartilla de Nextera personalizado de 25 μm 2 (tabla 2) | 2,5 ΜL |
| Volumen total | 50 ΜL |
Tabla 3: Mezcla de reacción de PCR inicial paso 3.5.
| PASO DE CICLO | TEMPERATURA | hora | CICLOS DE |
| Extensión | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | 10 |
| De recocido | 63 ° C | 30 s | |
| Extensión | 72 ° C | 1 min | |
| Mantenga | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabla 4: Inicial programa ciclo PCR amplificación paso 3.5.
| Alícuota de reacción de PCR | 5 ΜL |
| Cóctel PCR del cuadro 3 con 0,6 x Syber verde | 10 ΜL |
Tabla 5: Mezcla de reacción de qPCR paso 3.6.
| PASO DE CICLO | TEMPERATURA | hora | CICLOS DE |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | 20 |
| De recocido | 63 ° C | 30 s | |
| Extensión | 72 ° C | 1 min | |
| Mantenga | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabla 6: Paso 3.6 qPCR ciclismo programa.
| PASO DE CICLO | TEMPERATURA | hora | CICLOS DE |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | Según lo determinado |
| De recocido | 63 ° C | 30 s | |
| Extensión | 72 ° C | 1 min | |
| Mantenga | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabla 7: Programa ciclismo paso 3.7 PCR para la amplificación de PCR final.
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Discussion
El protocolo modificado de ATAC-seq presentado en este artículo proporciona resultados reproducibles con mínima contaminación del ADN mitocondrial. El protocolo ha sido usado para con éxito caracterizan la arquitectura de la cromatina de humano primario PBMCs10, monocitos humanos, las células dendríticas de ratón (inéditas), y11líneas de células de melanoma cultivadas. Anticipamos esta lisis mejorada condición tiene el potencial para otros tipos de la célula. También se anticipa que este protocolo de aislamiento de los núcleos será compatible con núcleos solo protocolos de ATAC-seq, minimizando la contaminación del ADN mitocondrial para mejorar los resultados de la secuencia.
Un beneficio adicional de este protocolo modificado es la capacidad para inmovilizar lotes de células T CD4 + aisladas de PBMCs en diferentes momentos dependiendo de la disponibilidad de muestras de pacientes. ATAC-seq entonces se puede realizar al mismo tiempo en todas las muestras, posibles sesgos de efecto de lote en la reacción de la transposasa y secuenciación es mínimo10. Es fundamental que hacer congelación medio fresco con cada uso, para mantener la alta viabilidad que se logra con este protocolo de congelación y descongelación. Viabilidad de células de CD4 + T aisladas debe permanecer por encima del 90% para evitar la digestión inespecífica en la transposasa reacción1.
Tenga en cuenta que otra optimización puede ser requerido para utilizar este protocolo con cantidades y tipos de variable de células. Puesto que la relación de Tn5 transposasa a núcleos ha sido optimizada para 500.000 núcleos en este protocolo, en caso de ATAC-seq con un diverso número de núcleos, la cantidad de Tn5 transposasa debe ajustarse en consecuencia. Excesiva lisis de núcleos debido a un exceso de Tn5 pueden llevar a la euforia de cromatina cerrada y baja complejidad de bibliotecas de la secuencia, mientras que debajo-lisis pueden no proporcionar una completa PCR amplificado library1. Para evitar estas complicaciones, se aconseja realizar cuidados núcleos cuenta y optimizar la relación del Tn5 según sea necesario. Para mejorar aún más la calidad de los datos, se recomienda optimizar ciclos de amplificación de PCR mediante el control de la qPCR. Si la biblioteca final sufre demasiados ciclos de amplificación, puede existir sesgos en los datos de la secuencia2. Se recomienda realizar adecuado control de calidad de las bibliotecas de ATAC-seq antes de secuenciación de próxima generación con el fin de ahorrar tiempo y dinero.
Como hemos demostrado, un tampón de lisis modificado es clave para la reducción de la contaminación del ADN mitocondrial y es eficaz en una amplia gama de tipos de la célula. Otros protocolos han abordado el tema de contaminación mitocondrial con alternativos lisis buffers7,19 o por el intensivo proceso de una mediada por CRISPR mitocondrial ADN agotamiento20. Nuestro protocolo de ATAC-seq alternativo contribuye a los esfuerzos para disminuir la contaminación del ADN mitocondrial de Lee de la secuencia con un tampón de lisis mejora y conservación de la simplicidad de ATAC-seq que lo convierte en una técnica tan accesible. Junto con RNA-seq y secuenciación unicelular, ATAC-seq es una poderosa herramienta para explorar la regulación epigenética. Este mejorado protocolo ATAC-seq y paquete de análisis de datos le ayudará a disminuir los costes de secuenciación y producir resultados de calidad superiores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Atsede Siba para soporte técnico. C.S.C. es apoyado por los NIH grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
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