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Bioengineering

3d Hydrogels में वैश्विक सेलुलर मैट्रिक्स Metalloproteinase और चयापचय गतिविधि को मापने

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/59123
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Summary

यहां, एक प्रोटोकॉल encapsulating और पाली में संवर्धन कोशिकाओं (ईथीलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) hydrogels एक fluorogenic मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) के साथ कार्यात्मक-सड़ पेप्टाइड के लिए प्रस्तुत किया है । सेलुलर एमएमपी और चयापचय गतिविधि hydrogel संस्कृतियों से सीधे एक मानक microplate पाठक का उपयोग कर मापा जाता है ।

Abstract

तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति प्रणालियों अक्सर vivo सेलुलर प्रतिक्रियाओं और पारंपरिक दो आयामी (2d) संस्कृति प्रणालियों की तुलना में कार्यों में अधिक निकटता दोहराऊंगा । हालांकि, 3 डी संस्कृति में सेल समारोह की माप अक्सर अधिक चुनौतीपूर्ण है । कई जैविक परख सेलुलर सामग्री की पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता है जो 3 डी संस्कृतियों में मुश्किल हो सकता है । एक तरह से इस चुनौती का पता करने के लिए नई सामग्री है कि सामग्री के भीतर सेल समारोह के माप को सक्षम विकसित करना है । यहां, एक विधि ९६-well प्रारूप में 3 डी hydrogels में सेलुलर मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) गतिविधि की माप के लिए प्रस्तुत किया है । इस प्रणाली में, एक पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) hydrogel एक fluorogenic एमएमपी सट सेंसर के साथ कार्यात्मक है । सेलुलर एमएमपी गतिविधि प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए आनुपातिक है और एक मानक microplate पाठक के साथ मापा जा सकता है । एक ९६ के लिए इस परख के Miniaturization-अच्छी तरह से प्रारूप प्रयोगात्मक के लिए आवश्यक समय कम ५०% और हालत प्रति ८०% द्वारा एजेंट के उपयोग के रूप में पिछले 24 की तुलना में अच्छी तरह से परख के संस्करण । यह परख भी सेलुलर समारोह के अंय माप के साथ संगत है । उदाहरण के लिए, एक चयापचय गतिविधि परख यहां का प्रदर्शन किया है, जो एक ही hydrogel के भीतर एमएमपी गतिविधि माप के साथ एक साथ आयोजित की जा सकती है । परख मानव मेलेनोमा कोशिका के एक रेंज भर में समझाया कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है घनत्व सीडिंग के लिए उपयुक्त encapsulation घनत्व निर्धारित करने के लिए परख के कार्य रेंज । सेल encapsulation के 24 एच के बाद, एमएमपी और चयापचय गतिविधि readouts कोशिका बोने की सघनता के लिए आनुपातिक थे । जबकि परख यहां एक fluorogenic सड़ सब्सट्रेट के साथ प्रदर्शन किया है, परख और पद्धति hydrogel प्रणालियों और अंय फ्लोरोसेंट सेंसर की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित हो सकता है । इस तरह के एक परख आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए एक व्यावहारिक, कुशल और आसानी से सुलभ 3 डी संवर्धन मंच प्रदान करता है ।

Introduction

तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों अक्सर और अधिक बारीकी से vivo में दोहराऊंगा पारंपरिक दो आयामी (2d) संस्कृति प्रणालियों की तुलना में सेलुलर प्रतिक्रियाओं, कई उत्कृष्ट प्रकाशनों1,2,3 देखें . हालांकि, सेल समारोह को मापने के लिए 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग सेलुलर पुनः प्राप्ति और आगे नमूना प्रसंस्करण की कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है । यह कठिनाई 3 डी संस्कृति प्रणालियों में कई सेलुलर कार्यों का माप सीमा । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, नई तकनीक की जरूरत है कि 3 डी वातावरण के भीतर सेल समारोह के आसान माप सक्षम हैं । एक तरह से इस की जरूरत है पता सामग्री का विकास है कि न केवल 3 डी सेल संस्कृति का समर्थन है, लेकिन यह भी सेंसर को शामिल करने के लिए सेल समारोह को मापने । उदाहरण के लिए, कई hydrogel सिस्टम को शामिल किया है fluorogenic को चिढ़ाना moieties 3 डी वातावरण के भीतर गतिविधि को चिढ़ाने के दृश्य को सक्षम करने के लिए4,5,6,7। हालांकि इन प्रणालियों मूलतः सूक्ष्म इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया, इन प्रणालियों को भी एक वैश्विक मैट्रिक्स metalloproteinase में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (एमएमपी) गतिविधि परख एक मानक प्लेट रीडर का उपयोग कर, एक 3 डी में एक सेल समारोह के सतही माप को सक्षम करने वातावरण८.

MMPs, जिंक का superfamily, सामान्य ऊतक homeostasis में और कई रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । MMPs नीचा और remodel extracellular मैट्रिक्स (ECM), सेल सतह रिसेप्टर्स और साइटोकिंस सट और अन्य MMPs9,10को सक्रिय करें. MMPs शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जैसे कि गठिया, atherosclerosis, अल्जाइमर, और कैंसर जैसे रोगों में घाव हीलिंग और ( 9,10,11में समीक्षाएं देखें) । कैंसर में, उच्च एमएमपी अभिव्यक्ति स्तर दृढ़ता से कैंसर मेटास्टेसिस और गरीब पूर्वानुमान12के साथ संबद्ध हैं । इसके अलावा, MMPs कैंसर सेल आक्रमण और प्रवास को बढ़ावा देने के द्वारा ट्यूमर प्रगति में योगदान, सेलुलर प्रक्रियाओं है कि स्वाभाविक 3 डी घटनाएं13,14। इसलिए, कई संदर्भों में 3 डी संस्कृति में एमएमपी गतिविधि को मापने की क्षमता में बहुत रुचि है, मौलिक जैविक अध्ययन और दवा जांच परख सहित ।

खूंटी hydrogels व्यापक रूप से अपने उच्च जल सामग्री, प्रोटीन सोखना के लिए प्रतिरोध, और स्वरित्र प्रकृति के कारण 3 डी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । खूंटी hydrogels RGD, रालोद की तरह ECM mimetic पेप्टाइड्स के साथ के रूप में सीधे सेल समारोह के लिए moieties की एक संख्या के साथ कार्यात्मक किया गया है, और IKVAV सेल आसंजन की सुविधा के लिए, या विकास कारक बदलने जैसे वृद्धि कारकों के प्रत्यक्ष tethering-β (TGF-β) 15,16. हाल ही में, खूंटी hydrogels संवेदक पेप्टाइड्स कि सेल समारोह के रूप में अच्छी तरह से5,8के माप को सक्षम के साथ कार्यात्मक किया गया है । विशेष रूप से, एक खूंटी hydrogel प्रणाली का उपयोग एक fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक-सड़ सकने योग्य पेप्टाइड एक मानक प्लेट रीडर के साथ 3 डी संस्कृतियों में सेलुलर एमएमपी गतिविधि के माप सक्षम है और कोई आगे प्रसंस्करण की आवश्यकता. इन प्रणालियों भी सेलुलर समारोह के अन्य माप के साथ संगत कर रहे हैं, चयापचय गतिविधि सहित. यहां, एक प्रोटोकॉल एक 3d खूंटी एक fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक hydrogel में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के एमएमपी गतिविधि की माप के लिए वर्णित है, ह्रासी पेप्टाइड, और परिणाम इस के उपयोग के लिए आवश्यक प्रारंभिक अनुकूलन प्रयोगों का प्रदर्शन प्रस्तुत परख. मानव मेलेनोमा कोशिकाओं (A375) fluorogenic hydrogels में समझाया घनत्व सीडिंग की एक सीमा से अधिक उचित सीडिंग घनत्व है कि परख के काम रेंज के भीतर है निर्धारित कर रहे थे । encapsulation के 24 घंटे के बाद, एमएमपी और चयापचय गतिविधि एक मानक microplate पाठक का उपयोग मापा गया । अगले, एमएमपी गतिविधि चयापचय गतिविधि के लिए सामान्यीकृत को परख के रैखिक सीमा के भीतर घनत्व बोने का निर्धारण किया गया । अंत में, भिन्नता प्रतिशत (% CV) की इंट्रा प्लेट गुणांक प्राप्त परिणामों की reproducibility को प्रतिबिंबित करने के लिए triplicates के बीच गणना की गई. इस विधि सरल और तेजी से 3 डी सेल संस्कृति, और ंयूनतम नमूना प्रसंस्करण के साथ गतिविधि की गति को आसान माप सक्षम बनाता है ।

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Protocol

१. Hydrogel अवयव तयारी

  1. फ्लोरोसेंट के रूप में कहीं और8वर्णित, फ्लोरोसेंट अणु और शमन के रूप में dabcyl के रूप में fluorescein के उपयोग के रूप में सड़-पदावनत पेप्टाइड संश्लेषण । DMSO में 10 मिमी की एकाग्रता के लिए पेप्टाइड भंग और छोटे में एक-८० ° c फ्रीजर में स्टोर (~ 30 µ l) aliquots दोहराया रुक-गल चक्र से बचने के लिए.
    नोट: ये पेप्टाइड्स भी व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है । इस प्रोटोकॉल एक सी-टर्मिनल cysteine पेप्टाइड अनुक्रम में hydrogel बहुलक नेटवर्क में आबंध निगमन सक्षम करने के लिए की आवश्यकता है ।
  2. तैयार 8 आर्म ४० केडीए पॉली (ईथीलीन ग्लाइकोल) अमीन (खूंटी)-norbornene (नायब) के रूप में17बताई गई है. 1H एनएमआर का उपयोग कर ९०% से अधिक के अंत समूह functionalization की जांच करें । में खूंटी-नायब भंग बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में 25% डब्ल्यू/वी और स्टोर में-८० ° c फ्रीजर में (~ ३०० µ l) aliquots.
    नोट: norbornene के साथ कार्यात्मक खूंटी भी व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है ।
  3. फोटो-सर्जक लिथियम फिनाइल 2, 4, 6 trimethylbenzoylphosphinate (गोद) के रूप में18कहीं वर्णित संश्लेषित । ६८ मिमी की एकाग्रता के लिए बाँझ पानी में गोद भंग और एक में स्टोर-८० ° c फ्रीजर में (~ ३०० µ एल) aliquots.
    नोट: एक विकल्प के रूप में, Irgacure (2-Hydroxy-4 ′-(2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone) फोटो-सर्जक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । गोद और Irgacure व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है ।
  4. एमएमपी-क्षरण पेप्टाइड crosslinker (KCGPQG ↓ IWGQCK) और कोशिका आसंजन पेप्टाइड (CRGDS) बाँझ पानी में क्रमशः २०० मिमी और १०० मिमी की एकाग्रता को भंग, और उंहें में एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर (~ ३०० µ एल और ~ 30 µ एल) aliquots, क्रमशः ।

2. परख मीडिया की तैयारी

  1. तैयार गर्मी निष्क्रिय, लकड़ी का कोयला एमएमपी परख के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) छीन:
    नोट: FBS में teases एमएमपी परख के साथ एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत उत्पादन कर सकते हैं; इसलिए, यह गर्मी निष्क्रिय करने के लिए सिफारिश की है और चारकोल परख मीडिया के लिए FBS पट्टी ।
    1. ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हीटिंग द्वारा FBS के १०० मिलीलीटर निष्क्रिय ।
      नोट: FBS के १०० मिलीलीटर aliquoting और भंडारण के लिए यहां उपयोग किया गया था-20 ° c भविष्य के उपयोग के लिए । आवश्यकतानुसार छोटे वॉल्यूम का उपयोग किया जा सकता है ।
    2. सक्रिय चारकोल के ०.२५% w/v जोड़ें और dextran के ०.०२५% w/v FBS की एक छोटी राशि के लिए (लगभग 5 मिलीलीटर) और हलचल जब तक एक घोल का गठन किया है । फिर, FBS के बाकी जोड़ें और ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हलचल ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १,९६२ x g पर केंद्रापसारक । इसके बाद supernatant को दूसरे पोत पर ट्रांसफर कर देना ।
    4. दोहराएँ चरण 2.1.2 लेकिन पर ३७ ° c चरण 2.1.3 द्वारा पीछा किया. एक ०.४५ µm फ़िल्टर का उपयोग कर supernatant और फिर एक ०.२ µm फ़िल्टर निष्फल ।
  2. परख मीडिया का उपयोग कर तैयार मीडिया 1% चारकोल छीन FBS, 2 मिमी एल-glutamine, 10 यू/एमएल पेनिसिलिन, 10 µ g/एमएल streptomycin के साथ पूरक ।
    नोट: phenol लाल के बिना मीडिया की सिफारिश की है क्योंकि यह कम प्रतिदीप्ति हस्तक्षेप है । परख मीडिया के लिए अंय अतिरिक्त जैसे इंसुलिन, वृद्धि कारकों, आदि के रूप में लंबे समय के रूप में जोड़ा जा सकता है अवशोषित और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम चोटियों संवेदक (४९४ एनएम/521 एनएम) के साथ ओवरलैप नहीं है ।
  3. बैक्टीरियल collagenase एंजाइम प्रकार मैं 10 और १,००० µ g/एमएल में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में परख मीडिया पतला ।

3. Hydrogel तैयारी और सेल encapsulation

  1. hydrogel प्रणेता समाधान तैयार करें ।
    1. निम्न क्रम में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए रिएजेंट जोड़ें, प्रत्येक घटक के अलावा के बाद भंवर: 20 मिमी 8 एआरएम ४० केडीए खूंटी-नायब, १२.७५ मिमी crosslinker एमएमपी-सड़ योग्य पेप्टाइड, १७.८ मिमी NaOH, 1 मिमी CRGDS, 2 मिमी गोद, और ०.२५ मिमी fluorogenic एमएमपी-ह्रास पेप्टाइड.
      नोट: 1 तालिका hydrogel प्रणेता समाधान सामग्री, शेयर सांद्रता, कार्य सांद्रता, मात्रा गणना फार्मूले से पता चलता है और आवश्यक संस्करणों के लिए १२० µ l बनाने के लिए आवश्यक hydrogel प्रणेता समाधान है, जो एक आचरण करने के लिए पर्याप्त है 10 hydrogels के साथ प्रयोग । pipetting के कारण hydrogel समाधान के नुकसान के लिए खाते में, 20% से कुल मात्रा में वृद्धि । वाणिज्यिक पेप्टाइड्स अक्सर एक अंलीय हाइड्रोजन क्लोराइड समाधान में आपूर्ति कर रहे हैं; इसलिए, NaOH 7 के एक अंतिम पीएच प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया है । अंतिम समाधान के पीएच उपयोगकर्ता द्वारा की पुष्टि की जानी चाहिए ।
    2. एकाधिक १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में hydrogel अग्रदूत समाधान फूट डालो, शर्त के अनुसार एक ट्यूब का परीक्षण किया जा रहा है ।
      नोट: कई नियंत्रण शर्तों जिसमें hydrogels कक्षों के अतिरिक्त के बिना तैयार किए जाते है सुझाए गए हैं । एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, fluorogenic संवेदक के गैर विशिष्ट गिरावट के लिए खाते में, एक hydrogel हालत वाहन नियंत्रण या प्रयोगात्मक अकेले मीडिया के साथ किया जा सकता है अगर कोई उपचार की स्थिति हैं । एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए और प्रयोगों के बीच अंशांकन के लिए, hydrogels एक fluorogenic सेंसर सट करने के लिए जाना जाता छेड़ने के साथ मशीन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल collagenase के दो सांद्रता यहां इस्तेमाल किया गया ।
  2. hydrogels में कोशिकाओं encapsulate ।
    1. उपयोग किए जा रहे कक्ष प्रकार के लिए उपयुक्त के रूप में एकल कक्ष निलंबन तैयार करें । उदाहरण के लिए, पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ A375 मेलेनोमा कोशिकाओं की एक 10 सेमी डिश धो लें । Trypsinize कोशिकाओं का उपयोग ०.०५% trypsin और ३७ ° c पर मशीन और 5% सह2 के लिए 3 min. Count कक्षों के साथ एक hemocytometer कुल कक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए ।
    2. 3 मिनट, महाप्राण संस्कृति मीडिया के लिए ३१४ x g पर सेल समाधान केंद्रापसारक, तो फिर-पंजाब में लगभग तीन बार प्रयोग के लिए सबसे अधिक आवश्यक बीज बोने की सघनता में कोशिकाओं को निलंबित । उदाहरण के लिए, 21 x 106 कोशिकाओं के घनत्व के साथ एक सेल निलंबन यहां 7 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम encapsulated घनत्व को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था/
    3. एक सटीक कोशिका एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को फिर से गिनती.
    4. इस उदाहरण में आवश्यक सीडिंग घनत्व (०.२५, ०.५, 1, 2, 3, 4, 5, 6, और 7 x 106 कोशिकाओं/एमएल के अनुसार hydrogel प्रणेता समाधान के प्रत्येक ट्यूब के लिए निलंबित कोशिकाओं और पंजाबियों जोड़ें) । निलंबित कक्षों के एवज में कोई कक्ष न होने के साथ पंजाबियों को शर्तों में जोड़ें ।
      नोट: सभी शर्तों hydrogel घटकों और पंजाबियों के बीच अनुपात को सुनिश्चित करने के लिए एक ही अंतिम hydrogel प्रणेता समाधान मात्रा होना चाहिए निरंतर है । भंवर ट्यूबों कि उन में कोशिकाओं है मत करो, पिपेट ऊपर और नीचे जोरदार बुलबुले बनाने के लिए आदेश में प्रणेता समाधान मिश्रण के बिना ।
    5. एक बाँझ काले दौर नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली में hydrogel अग्रदूत समाधान के 10 µ एल वितरण, यह सुनिश्चित करना है कि टिप के बीच में केंद्रित है, जबकि एक अच्छी तरह से तिरस्कृत ।
    6. Polymerize hydrogel 3 मिनट के लिए 4 मेगावाट/सेमी2 पर अल्ट्रा वायलेट (यूवी) प्रकाश के लिए प्लेट को उजागर करके प्रणेता समाधान ।
      नोट: यूवी लैंप (UVL-५६ हाथ यूवी लैंप, UVP, अंतर्देशीय, सीए) यूवी का उत्पादन एक लंबी यूवी तरंग दैर्ध्य (३६५ एनएम) है, जो सेलुलर व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है पर एक प्रकाश ।
    7. जोड़ें १५० µ सभी कुओं को परख मीडिया के एल encapsulated कोशिकाओं के बिना सकारात्मक नियंत्रण की स्थिति के लिए छोड़कर । सकारात्मक नियंत्रण करने के लिए, collagenase एंजाइम समाधान के १५० µ एल जोड़ें ।
    8. मशीन के दौरान वाष्पीकरण को कम करने के लिए प्लेट के बाहरी कुओं को पंजाब के १५० µ एल जोड़ें ।

4. एमएमपी और चयापचय गतिविधि माप

  1. उपाय प्रतिदीप्ति तुरंत पोस्ट-encapsulation एक आधारभूत प्रतिदीप्ति माप की स्थापना और hydrogel बहुलकीकरण में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए । एक प्रतिदीप्ति microplate एक क्षेत्र के साथ एक अपारदर्शी ९६-well प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग पाठक का प्रयोग प्लेट पढ़ें ४९४ एनएम/521 एनएम पर सेटिंग स्कैन (उत्तेजना/ यह 0 ज पढ़ा जाएगा ।
  2. ३७ ° c और 5% CO2 में 18 h के लिए एक humidified मशीनी में थाली मशीन
  3. एक अच्छी तरह के लिए 1:10 पर चयापचय गतिविधि एजेंट (resazurin) जोड़ें (v/
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में एक humidified मशीन में एक अतिरिक्त 6 एच के लिए प्लेट मशीन ।
    नोट: यह मशीन समय कक्ष प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  5. नाप प्रतिदीप्ति पर 24 ज पद-encapsulation. एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग कर प्लेट पढ़ें ४९४ एनएम/521 एनएम (उत्तेजना/उत्सर्जन) एमएमपी गतिविधि और चयापचय गतिविधि के लिए ५६० एनएम/590 एनएम (उत्तेजना/उत्सर्जन) के लिए एक क्षेत्र स्कैन सेटिंग के साथ एक अपारदर्शी ९६-well प्लेट प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग ।

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Representative Results

वर्तमान परख एक पहले से विकसित और विशेषता 3d hydrogel संस्कृति एक fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक प्रणाली8से अनुकूलित किया गया था । fluorogenic एमएमपी सेंसर यहां इस्तेमाल एक पेप्टाइड अनुक्रम के होते हैं, GPLAC (pMeOBzl) ↓ WARKDDK (AdOO) सी (↓ दरार साइट इंगित करता है) कि पहले एमएमपी द्वारा दरार के लिए अनुकूलित किया गया था-14 और एमएमपी-1119. पेप्टाइड एक फ्लोरोसेंट अणु (fluorescein) और दरार साइट के दोनों ओर (चित्रा 1) पर एक शमन अणु (dabcyl) के साथ लेबल है । उचित छेड़ने के लिए fluorogenic संवेदक के जोखिम पर, fluorophore और शमनक अलग कर रहे हैं, और प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है. यहां, परख एक ९६ के लिए अच्छी तरह से थाली से लघुकृत था-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप, encapsulation प्रक्रिया में कई कदम को नष्ट करने और ५०% द्वारा एक प्रयोग करने की जरूरत समय को कम करने । इसके अलावा, यह ८०% द्वारा भस्म एजेंट की मात्रा कम, के रूप में hydrogel मात्रा ५० µ l से कम किया गया प्रति अच्छी तरह से 10 µ एल । इसके अलावा, एक ९६-well थाली का उपयोग करके, triplicates में 20 शर्तों के बजाय 24-well प्लेट प्रति डुप्लिकेट में 12 शर्तों के परीक्षण किया जा सकता है । कक्ष encapsulation प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्र 2में सचित्र है । लेबल 1 और 2 चरण ३.१ और ३.२ प्रोटोकॉल में क्रमश: करने के लिए संगत है । लेबल 3 से 5 3.2.5 प्रोटोकॉल में 3.2.7 करने के लिए चरणों के लिए संगत है । 6 से 9 लेबल प्रोटोकॉल में ४.२ करने के लिए ४.५ चरणों के लिए संगत है ।

पता लगाने की सीमा और परख के संकेत रेंज स्थापित करने के लिए, hydrogels fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक-सड़ योग्य पेप्टाइड सांद्रता की एक सीमा (0 से २,००० µ g/एमएल) बैक्टीरियल collagenase एंजाइम प्रकार मैं के साथ मशीन थे । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 24 ज के बाद, एक प्लेट रीडर को प्रतिदीप्ति (चित्रा 3) को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन मापनों से, डायनेमिक (निंनतम और उच्चतम पता लगाए गए सिग्नल) और कार्यशील श्रेणी (सबसे कम पहचाने गए सिग्नल और 3 मानक विचलन के ऊपर 3 मानक विचलन) निर्धारित किए गए थे । मशीन के 24 घंटे के बाद, यह देखा गया कि सबसे कम पाया संकेत नकारात्मक नियंत्रण द्वारा उत्पादित किया गया था (पृष्ठभूमि शोर) पर 0 µ g/एमएल collagenase, जबकि उच्चतम पता लगाया संकेत १,००० µ g/एमएल collagenase या ऊपर, द्वारा उत्पादित किया गया था जहां संकेत करने के लिए शुरू होता है पठार (चित्रा ३). डायनेमिक श्रेणी से, कार्य श्रेणी ≈ ०.१६ µ g/ml और ≈ ४७४ µ g/ml, परिमाण के तीन आदेशों के पार एक विस्तृत संकेत श्रेणी के बीच होने के लिए परिकलित किया गया था ।

सेल संस्कृति परख के लिए, उपयुक्त कोशिका घनत्व कि परख के कार्य रेंज के भीतर प्रतिदीप्ति रीडिंग में परिणाम प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । यहां, प्रतिनिधि डेटा मेलेनोमा सेल लाइन A375 के लिए प्रस्तुत किया है, ०.२५ से घनत्व की एक श्रेणी में समझाया 7 x 106 कोशिकाओं/एमएल । प्रतिदीप्ति तीव्रता दो अलग समय अंक में एक मानक microplate रीडर का उपयोग कर लिया गया था: 1) सीधे encapsulation के बाद (0 एच) और 2) encapsulation के 24 ज के बाद । 0 ज, प्रतिदीप्ति रीडिंग में कम थे सीडिंग घनत्व (चित्रा 4ए), के रूप में की उंमीद है । संस्कृति के 24 ज (चित्रा 4बी) के बाद, एमएमपी गतिविधि सीधे बोने के घनत्व के लिए आनुपातिक था, जिसमें अधिक कोशिकाओं के परिणामस्वरूप fluorogenic एमएमपी के अधिक दरार से सट सेंसर और उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता । आंतरिक नियंत्रण के रूप में, hydrogels से युक्त कोई कोशिकाओं 0, 10, और १,००० µ g/collagenase प्रकार मैं एंजाइम के कम, मध्यम और उच्च स्तर संकेत के क्रमशः संकेत के साथ मशीन थे (के रूप में collagenase संकेत रेंज लक्षण वर्णन द्वारा निर्धारित में चित्रा 3) और चित्र 4बीमें डैश्ड लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व किया । इसके अलावा, कार्यशील श्रेणी सीमाएं 0 और १,००० µ g/mL संकेतों से परिकलित की गई थी और यह चित्र 4Bमें डॉटेड रेखाओं द्वारा दर्शाई गई है । घनत्व सीडिंग में या अधिक से अधिक 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल काम रेंज की सीमा के भीतर गिर जाते हैं । A375 सेल लाइन के चयापचय गतिविधि माप भी सीधे सेल बीज घनत्व (चित्रा 4सी) के लिए आनुपातिक थे । पहले, एमएमपी गतिविधि को एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में चयापचय गतिविधि करने के लिए सामान्यीकृत किया गया है एक प्रति सेल के आधार पर एमएमपी गतिविधि निर्धारित8। एमएमपी गतिविधि को सामान्य करने के लिए चयापचय गतिविधि में घनत्व सीडिंग में कोई महत्वपूर्ण अंतर के परिणामस्वरूप एमएमपी गतिविधि में घनत्व से अधिक 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल (चित्रा 4डी). प्रत्येक प्लेट (इंट्रा प्लेट परिवर्तनशीलता) में triplicates के बीच परिवर्तनशीलता का निर्धारण करने के लिए, भिन्नता प्रतिशत के गुणांक (% CV) दोनों एमएमपी और चयापचय गतिविधि के लिए गणना की गई थी और तालिका 2में संक्षेप है. % CV 20% से नीचे इंगित करता है कि triplicates के भीतर अंतर प्लेट परिवर्तनशीलता प्रणाली के लिए स्वीकार्य है अनुरूप परिणाम20,21उत्पादन ।

Figure 1
चित्रा 1 : fluorogenic एमएमपी-अपमानजनक पेप्टाइड डिजाइन । fluorogenic एमएमपी-क्षरण पेप्टाइड एक रीढ़ पेप्टाइड GPLAC (pMeOBzl) ↓ WARKDDK (AdOO) सी के होते हैं (↓ दरार साइट इंगित करता है) कि सेंसर की विशिष्टता निर्धारित करता है । पेप्टाइड एक शमन (dabcyl) और एक fluorophore (fluorescein), जो अतृप्त (fluoresces) जब रीढ़ पेप्टाइड एमएमपी से सट जाता है के साथ लेबल है । एक thiol समूह रीढ़ पेप्टाइड के लिए संयुग्मित है खूंटी अणु में norbornene कार्यात्मक समूहों के साथ आबंध प्रतिक्रिया सक्षम करने के लिए, hydrogel को सेंसर युग्मन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : परख योजनाबद्ध । hydrogel प्रणेता समाधान घटक पंजाब में निलंबित कोशिकाओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं । प्रणेता समाधान तो काले, गोल नीचे, ९६ में pipetted है अच्छी तरह से प्लेटें और 3 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए जोखिम द्वारा बहुलक । परख मीडिया जोड़ा है, और प्लेटों 18 घंटे (३७ ° c, 5% सह2) के लिए मशीन हैं । चयापचय गतिविधि एजेंट resazurin फिर कहा जाता है, और प्लेटें एक अतिरिक्त 6 ज. एमएमपी और चयापचय गतिविधि के लिए मशीन हैं एक अच्छी तरह से संकेत दिया उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक प्रोटोकॉल स्कैन के साथ एक फ्लोरोसेंट microplate रीडर का उपयोग कर मापा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : गतिशील और परख के कार्य रेंज । Hydrogels fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक-सड़ योग्य पेप्टाइड collagenase एंजाइम प्रकार की सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ किया गया था ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मैं और प्रतिदीप्ति तीव्रता मापा गया था । डॉटेड रेखाएं डायनेमिक और कार्यशील श्रेणी का प्रतिनिधित्व करती हैं । n = 3, ± मानक विचलन (एसडी) मतलब है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : एमएमपी गतिविधि पर मेलेनोमा सेल लाइन A375 के बीज का घनत्व का प्रभाव । (क) प्रारंभिक मापन (0 एच) A375 कोशिका लाइन के लिए एमएमपी गतिविधि के बोने की एक सीमा से अधिक encapsulated घनत्व. n = 3 मतलब ± एसडी. (ख) एमएमपी गतिविधि की माप 24 ज .0, 10 और १००० µ g/एमएल collagenase के धराशायी लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । डॉटेड रेखाएं collagenase नियंत्रणों से परिकलित कार्यशील श्रेणी (WR) का प्रतिनिधित्व करती हैं । n = 3, मतलब ± एसडी. (ग) A375 सेल लाइन के लिए (8) के लिए resazurin के साथ तैयार की एक श्रेणी पर 24 ज के लिए समझाया के लिए चयापचय गतिविधि की माप घनत्व और 6 एच. एन = 3, मतलब ± एसडी. (घ) A375 एमएमपी गतिविधि सामान्यीकृत करने के लिए चयापचय गतिविधि । n = 3, मतलब ± एसडी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Table 1
तालिका 1: Hydrogel प्रणेता समाधान तयारी गरेको हो ।

Table 2
तालिका 2: A375 सेल लाइन के साथ परख के इंट्रा प्लेट% CV ।

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Discussion

3d इन विट्रो सेल कल्चर recapitulates में वीवो के कई अहम पहलू हैं । हालांकि, 3 डी संस्कृति भी सेल समारोह का आकलन करता है और चुनौतीपूर्ण संकेत, के रूप में कई जैविक परख सेलुलर पुनः प्राप्ति और कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । इसलिए, एक सरल 3 डी संस्कृति प्रणाली है कि आगे के नमूने प्रसंस्करण के बिना सेलुलर समारोह की माप में सक्षम बनाता है के विकास बहुत 3 डी संस्कृति प्रणालियों की उपयोगिता में वृद्धि होगी । 3 डी प्रणाली यहां वर्णित विभिंन अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । fluorogenic सेंसर का अनुक्रम अन्य टीज़ का पता लगाने के लिए बदला जा सकता है । उदाहरण के लिए, fluorogenic सट सेंसर अनुक्रम (GPQG ↓ IWGQK) जो एमएमपी-1,-2,-3,-7,-8, और-9 द्वारा सट किया जा सकता है, पहले मेलेनोमा22के जवाब में एमएमपी chemotherapeutics गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था । खूंटी hydrogel प्रणाली का उपयोग भी सक्षम बनाता है सटीक स्वतंत्र सेलुलर microenvironment की ट्यूनिंग, यांत्रिक गुणों सहित, क्षरण, और मैट्रिक्स hydrogel भीतर आसंजन moieties. इस काम में प्रयुक्त आसंजन अणु RGD एक fibronectin-व्युत्पन्न अनुक्रम है और integrin-मध्यस्थता आसंजन सक्षम बनाता है । ऐसे (रालोद) और (IKVAV) के रूप में अंय आसंजन अणुओं कि फाइब्रिनोजेन और laminin से प्राप्त कर रहे है क्रमशः integrin रिसेप्टर्स के अंय प्रकार को सक्रिय करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह प्रदर्शन किया गया था कि आसंजन अणुओं फेरबदल महाधमनी वाल्वुलर मध्यवर्ती कोशिकाओं (विक), जो महाधमनी वाल्व एक प्रकार का रोग15पर एक प्रभाव हो सकता है के बढ़ाव बदल दिया है । hydrogel crosslinker अनुक्रम hydrogel के भीतर hydrogel और encapsulated सेलुलर व्यवहार की गिरावट को नियंत्रित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यह प्रदर्शन किया है कि fibroblasts प्रसार और सेल फैल गया था जब तेजी से अपमानजनक hydrogels, जो vivo23में चिकित्सा की प्रक्रिया में तेजी लाने में तेज हो सकती में संस्कृति । microenvironment के यांत्रिक गुणों को भी सेल समारोह को विनियमित कर सकते हैं, और hydrogel कठोरता खूंटी macromer में हथियारों की संख्या में फेरबदल, आणविक वजन और खूंटी और crosslinker के बीच अनुपात के द्वारा संशोधित किया जा सकता है ।

क्योंकि एमएमपी गतिविधि सेल प्रकार से भिंन होता है, प्रत्येक नए सेल प्रकार यह महत्वपूर्ण है के लिए एक encapsulation घनत्व अनुकूलन प्रयोग आचरण के रूप में यहां का प्रदर्शन किया । encapsulation के 24 घंटे के बाद, एमएमपी और चयापचय गतिविधि सीधे कोशिका बोने की सघनता के लिए आनुपातिक थे । हालांकि, अब समय फ्लोरोसेंट संकेत पठार कर सकते हैं, इसलिए परख के समय के लिए उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है8। विशिष्ट चिढ़ाने संवेदक भी काम कर रेंज और परख के समय को प्रभावित कर सकते हैं । परख के कार्य रेंज कोई कोशिकाओं और एक व्यापक एकाग्रता पर एक proteolytic एंजाइम के साथ एक संकेत रेंज प्रयोग के आयोजन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । कई सं सेल hydrogel एंजाइम नियंत्रण के साथ मशीन की शर्तों के शामिल किए जाने की स्थापना में सक्षम बनाता है कम (पृष्ठभूमि शोर), मध्यम और प्रत्येक परख के भीतर संकेत के उच्च स्तर (0, 10 और १,००० µ g/ यह जहां कोशिकाओं द्वारा उत्पादित संकेतों परख के कार्य रेंज के भीतर गिर का एक संकेत देता है । यह परख भी अंय फ्लोरोसेंट सेंसर के साथ संगत है कि अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, जैसे चयापचय गतिविधि परख यहां एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल के लिए सेल के आधार पर एमएमपी गतिविधि की गणना के रूप में नहीं है, के रूप में पहले 8 की सूचना . एमएमपी गतिविधि चयापचय गतिविधि के लिए सामान्यीकृत में या ऊपर 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल, जिसमें कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन था बोने की घनत्व के लिए इस दृष्टिकोण की वैधता का प्रदर्शन घनत्व । यह सामांयीकरण उपयुक्त सीडिंग घनत्व जो एमएमपी गतिविधि वक्र और सामांयीकरण वक्र के रेखीय भाग के भीतर कार्य श्रेणी के भीतर है की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

जबकि परख कई प्रयोजनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, वहां कई सीमाएं और महत्वपूर्ण पहलुओं उपयोगकर्ता पर विचार करना चाहिए रहे हैं, विशेष रूप से फ्लोरोसेंट संकेत और hydrogels की तैयारी के साथ हस्तक्षेप के बारे में । सबसे पहले, देखभाल संस्कृति मीडिया और अतिरिक्त उपचार के चुनाव के साथ लिया जाना चाहिए, के रूप में इन एक अतिव्यापी अवशोषण स्पेक्ट्रम या अपारदर्शी है कि प्रतिदीप्ति का पता लगाने या संकेत बुझाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते है हो सकता है । यह phenol लाल शामिल नहीं है कि संस्कृति मीडिया का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है । इसके अलावा, कुछ दवा उपचार फ्लोरोसेंट (जैसे, डॉक्सोरूबिसिन) कर रहे हैं, या अवशोषण स्पेक्ट्रम है कि fluorophore के उत्तेजना/उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप (जैसे, curcuminoids) । एक दूसरा पहलू है कि परख के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते है hydrogel तैयारी है । hydrogel प्रणेता समाधान की उच्च चिपचिपाहट की वजह से, देखभाल की जरूरत है hydrogel समाधान और सावधान pipetting प्रथाओं के मिश्रण को एक अच्छी तरह से असमान fluorophore सामग्री या hydrogel समाधान की मात्रा को रोकने के लिए सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए । पिपेट सुझावों के पूर्व गीला करना और कम प्रतिधारण सुझावों का उपयोग परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद कर सकते हैं । hydrogel तैयारी का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू कुओं में hydrogel आकृति और स्थान है. hydrogel अच्छी तरह से और एक समान आकार के भीतर केंद्रित किया जाना चाहिए कम परिवर्तनशीलता के साथ सटीक प्रतिदीप्ति माप सक्षम करने के लिए15. यहां, गोल नीचे प्लेटों का उपयोग एक अच्छी तरह से और अर्द्ध के उत्पादन में पिपेट टिप केंद्र में एड्स गोलाकार hydrogels लगातार सभी कुओं भर में ।

3 डी को छेड़ने-क्षरण hydrogel प्रणाली, वास्तविक समय को चिढ़ाने और चयापचय गतिविधि readouts अनुकूल बनाने के द्वारा एक 3 डी microenvironment में ंयूनतम नमूना प्रसंस्करण के साथ पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, सिंथेटिक खूंटी hydrogel का उपयोग कम कर देता है बैच के लिए बैच परिवर्तनशीलता स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन ECM hydrogels के साथ मनाया । इसके अलावा, खूंटी hydrogels का उपयोग ठीक-microenvironment के एक बेहतर नियंत्रण के लिए hydrogels के रासायनिक और यांत्रिक संकेतों की ट्यूनिंग सक्षम बनाता है । इसके अलावा, खूंटी hydrogel बहुलकीकरण यहां वर्णित एक तस्वीर प्रक्रिया शुरू की है, यह जल्दी और अधिक क्लासिक प्राकृतिक ECM hydrogels से उच्च प्रवाह के तरीके के लिए उत्तरदाई (यानी, कोलेजन या Matrigel), जो धीमी है और कर रहे है तापमान संवेदनशील । इस त्वरित, प्रयोक्ता नियंत्रित बहुलकीकरण की अनुमति देता है स्केलिंग प्रणाली के आगे रोबोट तरल संचालकों का उपयोग कर स्वचालित हो, के रूप में15अंय लोगों द्वारा प्रदर्शन किया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक को ओहियो कैंसर अनुसंधान (ओसीआर), ओह, इस काम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से राजा सऊद विश्वविद्यालय (KSU), रियाद, पहले लेखक के प्रायोजन के लिए केएसए के वित्तपोषण के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका स्वीकार करना चाहते हैं । फ्लोरोसेंट पेप्टाइड संवेदक के आणविक वजन मापा गया था मैट्रिक्स का उपयोग सहायता, लेजर desorption-ionization, समय की उड़ान (मालदी-तोफ) जन स्पेक्ट्रोमेट्री परिसर रासायनिक साधन केंद्र जन स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटियोमिक् से सहायता के साथ ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में सुविधा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
Activated charcoal  Sigma-Aldrich C3345
Black round bottom 96-well plate Brand-Tech 89093-600
Cell adhesion peptide (CRGDS) GenScript USA Inc. custom made
Collagenase enzyme type I  Life Technologies 17100-017
Dextran Sigma-Aldrich D4876
DMEM High Glucose Media Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum (FBS)  Seradigm 1500-500
Fluorescence microplate reader  BioTek Cytation 3
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
L-glutamine Life Technologies 25030-081
MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) GenScript USA Inc. custom made
NaOH Fisher Scientific S318500
Penicillin /streptomycin Life Technologies 15140-122
Resazurin (Alamar Blue) Life Technologies DAL1100
UV light  UVP 95-0006-02

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४३ Hydrogels 3 डी सेल encapsulation मैट्रिक्स Metalloproteinases चयापचय गतिविधि मेलेनोमा प्रतिदीप्ति
3d Hydrogels में वैश्विक सेलुलर मैट्रिक्स Metalloproteinase और चयापचय गतिविधि को मापने
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Fakhouri, A. S., Leight, J. L.… More

Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).

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