Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/59123
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Summary

Hier, een protocol wordt gepresenteerd voor het inkapselen van en het kweken van cellen in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels matiemaatschappij met een fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-afbreekbaar peptide. Cellulaire MMP en metabole activiteit wordt gemeten rechtstreeks vanaf de hydrogel culturen met behulp van een standaard microplate-lezer.

Abstract

Driedimensionale (3D) cel cultuur systemen recapituleren vaak nauwer in vivo cellulaire reacties en functies dan traditionele tweedimensionale (2D) cultuur systemen. Meting van de functie van de cel in 3D cultuur is echter vaak meer uitdagend. Veel biologische tests vereisen ophalen van celmateriaal die kan moeilijk in 3D culturen. Een manier om deze uitdaging is het ontwikkelen van nieuwe materialen die meting van de functie van de cel binnen het materiaal in staat te stellen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor meting van cellulaire matrix metalloproteinase (MMP) activiteit in 3D hydrogels in een 96-Wells-indeling. In dit systeem, is een poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel matiemaatschappij met een fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellulaire MMP activiteit is evenredig aan de intensiteit van de fluorescentie en kan worden gemeten met een standaard microplate-lezer. Miniaturisatie van deze test naar een 96-Wells-formaat beperkt de tijd die nodig is voor experimentele instellen door gebruik van 50% en reagens met 80% per voorwaarde ten opzichte van de vorige versie van de 24-well van de bepaling. Deze bepaling is ook compatibel met andere metingen van cellulaire functie. Bijvoorbeeld is een bepaling van de metabole activiteit hier gedemonstreerd, die gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met MMP activiteit metingen binnen de dezelfde hydrogel. De bepaling is aangetoond met menselijke melanoom cellen ingekapseld in een heel scala van cel zaaien dichtheden om te bepalen van de dichtheid van de passende inkapseling voor het werkbereik van de bepaling. MMP en metabole activiteit uitlezingen waren na 24u voor de inkapseling van de cel, evenredig naar cel zaaien dichtheid. Terwijl de bepaling wordt hier aangetoond met een fluorogenic afbreekbaar substraat, de assay en methodologie kunnen worden aangepast voor een breed scala aan hydrogel systemen en andere tl sensoren. Een dergelijke bepaling biedt een praktische, efficiënte en toegankelijke 3D kweken platform voor een breed scala van toepassingen.

Introduction

Driedimensionale (3D) cultuur systemen vaak nauwer recapituleren in vivo cellulaire reacties dan traditionele tweedimensionale (2D) cultuur systemen, zie verschillende uitstekende publicaties1,-2,3 . Echter met behulp van 3D cultuur systemen voor het meten van de functie cel heeft zijn uitdagend als gevolg van de moeilijkheid van cellulaire ophalen en genieten van verdere verwerking. Dit probleem beperkt de meting van vele cellulaire functies in 3D cultuur systemen. Overwinnen van deze problemen, nieuwe technieken waarmee gemakkelijk meting van de functie van de cel binnen 3D omgevingen nodig zijn. Een manier om deze behoefte is de ontwikkeling van materialen die 3D-celkweek ondersteunen niet alleen maar ook het opnemen van sensoren voor het meten van de functie cel. Bijvoorbeeld, hebben verschillende hydrogel systemen fluorogenic protease cleavable wordt zodat de visualisatie van protease-activiteit binnen 3D omgevingen4,,5,,6,7opgenomen. Terwijl deze systemen oorspronkelijk voor microscopische beeldvorming gebruikt werden, kunnen deze systemen ook worden aangepast voor gebruik in een globale matrix metalloproteinase (MMP) activiteit assay met behulp van een standaard afleesapparaat, facile meting van een functie van de cel in een 3D inschakelen milieu8.

MMP, een superfamilie van zink proteasen, spelen belangrijke rol in normale weefsel homeostase en vele ziekten. MMP degraderen remodelleren van extracellulaire matrix (ECM), klieven oppervlakte cel receptoren en cytokines en andere MMP9,10te activeren. MMP spelen belangrijke rol in de fysiologische processen zoals wondgenezing en ziekten zoals artritis, aderverkalking, Alzheimer en kanker (Bekijk beoordelingen in 9,10,11). Bij kanker, zijn hoge MMP expressie niveaus sterk gecorreleerd met kanker uitzaaiingen en slechte prognose12. Bovendien bijdragen MMP aan de progressie van de tumor door kanker cel invasie en migratie, cellulaire processen die inherent 3D verschijnselen13,14te bevorderen. Daarom is er veel interesse in de mogelijkheid voor het meten van MMP activiteit in 3D cultuur in vele contexten, met inbegrip van fundamentele biologische studies en drug screening tests.

PEG hydrogels worden veel gebruikt voor 3D-celkweek als gevolg van hun hoog watergehalte, weerstand tegen eiwit adsorptie en afstembare aard. PEG hydrogels hebben matiemaatschappij met een aantal wordt naar de functie van de directe cel, zoals met ECM mimetische peptiden zoals RGD RLD en IKVAV te vergemakkelijken van cel adhesie, of het direct binden van groeifactoren zoals transformeren groeifactor-β (TGF-β) 15,16. Meer recentelijk hebben PEG hydrogels matiemaatschappij is met sensor peptiden waarmee de meting van de functie cel als goed5,8. Met name het gebruik van een PEG hydrogel systeem met een fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide ingeschakeld meten van cellulaire MMP-activiteiten in 3D culturen met een standaard-afleesapparaat matiemaatschappij en vereist geen verdere verwerking. Deze systemen zijn ook compatibel met andere metingen van cellulaire functie, met inbegrip van de metabole activiteit. Hier, wordt een protocol beschreven voor de meting van MMP activiteit van cellen gekweekt in een 3D-PEG hydrogel matiemaatschappij met een fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide en resultaten te tonen van de experimenten van de eerste optimalisatie nodig voor gebruik van dit assay. Menselijke melanoom cellen (A375) werden ingekapseld in de hydrogels fluorogenic over een bereik van zaaien dichtheden om te bepalen van de juiste seeding dichtheden die binnen het werkbereik van de bepaling. Na 24u voor de inkapseling, werden MMP en metabole activiteit gemeten met behulp van een standaard microplate-lezer. Vervolgens werd MMP activiteit op metabole activiteit om te bepalen van de seeding dichtheden binnen het lineaire bereik van de bepaling genormaliseerd. Ten slotte, intra-plaat coëfficiënt van de variatie percentages (% CV) werden berekend tussen triplicates om na te denken van de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten. Deze methode kan eenvoudig en snel 3D-celkweek en eenvoudig meten van protease-activiteiten met minimal steekproef verwerking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogel onderdelen voorbereiding

  1. Synthetiseren de fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden zoals beschreven elders8, met behulp van fluoresce¨ une als de fluorescerende molecuul en dabcyl als de quencher. Los de peptide in DMSO tot een concentratie van 10 mM en winkel in een vriezer-80 ° C in kleine (~ 30 µL) porties om te voorkomen dat herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
    Opmerking: Deze peptiden kunnen ook worden gekocht commercieel. Dit protocol vereist een C-terminal cysteïne in de volgorde van de peptide covalente opneming in de hydrogel polymeer netwerk inschakelen.
  2. Bereiden van 8 arm 40 kDa poly (ethyleenglycol) amine (PEG)-Norborneen (NB) als beschreven17. Controleer of eind groep functionalization van meer dan 90% gebruik van 1H NMR. PEG-NB in steriele fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bij 25% w/v en winkel in-80 ° C diepvriezer in (~ 300 µL) aliquots ontbinden.
    Opmerking: PEG matiemaatschappij met Norborneen kan ook commercieel worden gekocht.
  3. De foto-initiator lithium fenyl 2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) synthetiseren zoals elders beschreven18. Los van de LAP in steriel water tot een concentratie van 68 mM en opslaan in een vriezer-80 ° C in (~ 300 µL) aliquots.
    Opmerking: als alternatief, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kan worden gebruikt als de foto-initiator. RONDE- en Irgacure kan commercieel worden gekocht.
  4. Los de MMP-afbreekbaar crosslinker peptide (KCGPQG↓IWGQCK) en de cel adhesie peptide (CRGDS) in steriel water tot een concentratie van 200 mM en 100 mM respectievelijk, en ze opslaan in een vriezer-80 ° C in (~ 300 µL en ~ 30 µL) aliquots, respectievelijk.

2. assay media voorbereiding

  1. Voorbereiding van de warmte-geïnactiveerd, houtskool ontdaan foetale runderserum (FBS) voor de MMP-assay:
    Opmerking: Proteasen in FBS kunnen produceren een hoge achtergrond signaal met de MMP-test; Daarom is het aanbevolen om warmte-inactivering en houtskool strippen de FBS voor de assay-media.
    1. Inactivering van 100 mL FBS door verwarming gedurende 30 minuten bij 55 ° C.
      Opmerking: 100 mL FBS werd hier gebruikt voor aliquoting en opslag bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Kleinere volumes kunnen desgewenst worden gebruikt.
    2. 0,25% w/v van actieve kool en 0,025% w/v van dextran toevoegen aan een kleine hoeveelheid FBS (circa 5 mL) en roer tot een drijfmest wordt gevormd. Dan, voeg de rest van de FBS en roer gedurende 30 minuten bij 55 ° C.
    3. Centrifugeer bij 1,962 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng het supernatant op een ander vaartuig.
    4. Herhaal stap 2.1.2 maar bij 37 ° C, gevolgd door stap 2.1.3. De bovendrijvende vloeistof met behulp van een 0,45 µm filter en vervolgens een 0,2 µm filter te steriliseren.
  2. Bereiden assay media met behulp van de media, aangevuld met 1% houtskool ontdaan FBS, 2 mM L-glutamine, 10 U/mL penicilline, 10 µg/mL streptomycine.
    Opmerking: Media zonder fenol rood wordt aanbevolen omdat er minder storing fluorescentie. Andere toevoegingen aan de assay media zoals insuline, groeifactoren, enz. , zolang de absorptie kan worden toegevoegd en fluorescentie spectrum pieken elkaar niet overlappen met de sensor (494 nm/521 nm).
  3. Verdunde bacteriële collagenase enzym typ ik op 10 en 1000 µg/mL in de assay media als positieve controle.

3. Hydrogel voorbereiding en cel inkapseling

  1. Bereid de oplossing van de voorloper hydrogel.
    1. Toevoegen van de reagentia aan een 1,5 mL tube in de volgende volgorde, vortexing na toevoeging van elk onderdeel: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-afbreekbaar peptide, 17.8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM schoot, en 0,25 mM fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide.
      Opmerking: Tabel 1 toont hydrogel voorloper oplossing inhoud, voorraad concentraties, werken de concentraties, volume berekeningsformules en van de vereiste hoeveelheden die nodig zijn om 120 µL van hydrogel voorloper oplossing, die volstaat om een experimenteren met 10 hydrogels. Ter verantwoording voor verlies van de oplossing van de hydrogel wegens pipetteren, het totale volume met 20% te stijgen. De commerciële peptiden worden vaak geleverd in een zure waterstofchloride oplossing; Daarom wordt NaOH toegevoegd aan het bereiken van een definitieve pH van 7. pH van de uiteindelijke oplossing moet worden bevestigd door de gebruiker.
    2. Verdeel de hydrogel voorloper oplossing in meerdere 1,5 mL tubes, één tube per voorwaarde wordt getest.
      Opmerking: Verschillende controlevoorwaarden waarin hydrogels zijn bereid zonder toevoeging van cellen worden voorgesteld. Voor een negatieve controle, ter verantwoording voor aspecifieke afbraak van de fluorogenic-sensor, kan een hydrogel voorwaarde worden geïncubeerd met de controle van het voertuig of de experimentele media alleen als er geen behandeling voorwaarden. Voor een positieve controle en kalibratie tussen experimenten, kan hydrogels worden geïncubeerd met een protease bekend te klieven van de fluorogenic-sensor. Bijvoorbeeld, werden twee concentraties van bacteriële collagenase hier gebruikt.
  2. Cellen in hydrogels kapselen.
    1. Maak een suspensie van eencellige afhankelijk van het celtype wordt gebruikt. Bijvoorbeeld, het wassen van een 10 cm schotel van A375 melanoom cellen met 10 mL PBS. Trypsinize cellen met behulp van 0,05% trypsine en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 3 min. aantal cellen met een hemocytometer om te bepalen van de totale mobiele nummer.
    2. Centrifugeer de cell oplossing bij 314 x g gedurende 3 min, gecombineerd cultuurmedia en resuspendeer de cellen in PBS op ongeveer drie keer de hoogste vereiste seeding dichtheid voor het experiment. Bijvoorbeeld, werd een celsuspensie met een dichtheid van 21 x 106 cellen hier gebruikt om een definitieve ingekapselde dichtheid van 7 x 106 cellen/mL.
    3. De cellen opnieuw om ervoor te zorgen de concentratie van een nauwkeurige cel tellen.
    4. Zwevende cellen en PBS toevoegen aan elke buis van hydrogel voorloper oplossing volgens de vereiste seeding dichtheid (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7 x 106 cellen/mL in dit voorbeeld). PBS aan voorwaarden met geen cellen in plaats van de zwevende cellen toevoegen.
      Opmerking: Alle voorwaarden moeten hetzelfde uiteindelijke hydrogel voorloper oplossing volume om de verhouding tussen de hydrogel componenten en PBS constant is. Doen niet vortex buizen die cellen in hen hebben, Pipetteer krachtig op en neer zonder bubbels om Meng de voorloper-oplossing maken.
    5. Afzien 10 µL van de hydrogel voorloper oplossing in een steriele zwart ronde bodemplaat van 96-Wells, ervoor te zorgen dat de tip is gecentreerd in het midden van de elk putje terwijl verstrekking.
    6. Polymeriseren hydrogel voorloper oplossing door de plaat naar ultra violet (UV)-licht op 4 mW/cm2 voor 3 min bloot te leggen.
      Opmerking: De UV-lamp (UVL-56 Handheld UV-Lamp, UVP, Upland, CA) produceert UV-A licht met een lange golflengte van UV (365 nm), die heeft geen invloed op cellulaire levensvatbaarheid.
    7. 150 µL van assay media toevoegen aan alle putjes met uitzondering van de voorwaarden van de positieve controle zonder ingekapselde cellen. De positieve controle, toevoegt 150 µL van collagenase enzym oplossing.
    8. Voeg 150 µL van PBS aan de buitenste putjes van de plaat te verminderen van verdamping tijdens de incubatie.

4. MMP en metabole activiteitsmeting

  1. Meten van fluorescentie onmiddellijk na inkapseling een nulmeting van de fluorescentie te zorgen voor uniformiteit in hydrogel polymerisatie. Lees de plaat met behulp van een fluorescentie microplate scan lezer met behulp van een protocol van de ondoorzichtige 96-wells-plaat met een oppervlakte instelling op 494 nm/521 nm (excitatie/emissie). Dit zal de 0 h lezen.
  2. Incubeer plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 18u.
  3. Metabole activiteit reagens (resazurin) op 1:10 (v/v) voor elk putje toevoegen.
  4. Incubeer plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor een extra 6 h.
    Opmerking: Deze incubatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype.
  5. Maatregel fluorescentie bij 24 h na inkapseling. Lees de plaat met behulp van een fluorescentie microplate scan lezer met behulp van een protocol van de ondoorzichtige 96-wells-plaat met een oppervlakte instelling op 494 nm/521 nm (excitatie/emissie) voor MMP activiteit en 560 nm/590 nm (excitatie/emissie) voor metabole activiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De huidige bepaling werd aangepast van een eerder ontwikkelde en gekarakteriseerd 3D hydrogel cultuur systeem met een fluorogenic MMP cleavable sensor8matiemaatschappij. De fluorogenic MMP sensor gebruikt hier bestaat uit een peptide-reeks, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ geeft de breukzijde) die eerder werd geoptimaliseerd voor decolleté door MMP-14 en MMP-1119. De peptide heet met een fluorescerende molecule (fluoresceïne) en een quencher molecuul (dabcyl) aan beide zijden van de breukzijde (Figuur 1). Bij blootstelling van de fluorogenic-sensor aan de juiste protease, de fluorophore en de quencher worden gescheiden en fluorescentie verhoogt. Hier was de bepaling van een 24-well plaat verkleind naar de indeling van een 96-wells-plaat, wegwerken van verscheidene stappen in het proces van inkapselen en het verminderen van de tijd die nodig is voor het uitvoeren van een experiment met 50%. Het verminderde verder, het volume van de reagentia die wordt verbruikt door 80%, zoals hydrogel volumes werden teruggebracht van 50 µL tot 10 µL per putje. Bovendien, met behulp van een 96-wells-plaat, 20 voorwaarden in triplicates zou kunnen worden getest in plaats van de 12 voorwaarden dubbele per 24-well plaat. Een schematische voorstelling van de cel inkapseling proces wordt geïllustreerd in Figuur 2. Label 1 en 2 overeen met stap 3.1 en 3.2 van het protocol, respectievelijk. Etiketten 3 tot en met 5 komen overeen met de punten 3.2.5 tot en met 3.2.7 stappen in het protocol. Etiketten 6 tot en met 9 komen overeen met stappen 4.2 tot 4,5 in het protocol.

Treffen de detectiegrenzen en signaal bereik van de bepaling, werden de hydrogels matiemaatschappij met de fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide geïncubeerd met een aantal uiteenlopende concentraties (0 tot en met 2.000 µg/mL) van bacteriële collagenase enzym type ik. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C, werd een afleesapparaat gebruikt voor het meten van de fluorescentie (Figuur 3). Uit deze metingen, de dynamiek (laagste en hoogste gedetecteerd signalen) en werkbereik (3 standaarddeviaties boven het laagste gedetecteerde signaal) en 3 standaarddeviaties onder de hoogste gedetecteerde signaal waren vastbesloten. Na 24 uur incubatie werd naar voren gebracht dat het laagste gedetecteerde signaal werd geproduceerd door negatieve controles (achtergrondgeluiden) op 0 µg Mo/mL collagenase, terwijl de hoogste ontdekt signaal werd geproduceerd door 1000 µg Mn/mL collagenase of boven, waar het signaal te begint plateau (Figuur 3). Van het dynamisch bereik, werd het werkbereik berekend te zijn tussen ≈0.16 µg/mL en ≈474 µg/mL collagenase, een breed signaalbereik over drie ordes van grootte.

Voor cel cultuur testen, moet de juiste celdichtheid waardoor de fluorescentie lezingen binnen het werkbereik van de bepaling worden bepaald voor elk celtype. Representatieve gegevens wordt hier gepresenteerd voor de cellijn van melanoom A375, ingekapseld in een waaier van dichtheden van 0,25 tot 7 x 106 cellen/mL. Intensiteit van de fluorescentie is verkregen met behulp van een standaard microplate-lezer op twee verschillende tijdstippen: 1) direct na de inkapseling (0 h) en 2) na 24 h van inkapseling. 0 h waren fluorescentie lezingen laag over seeding dichtheden (Figuur 4,A), zoals verwacht. Na 24u van cultuur (Figuur 4,B), MMP activiteit rechtstreeks evenredig was aan de seeding dichtheid, waarin meer cellen in meer splitsing van de fluorogenic MMP cleavable sensor en de hogere intensiteit van de fluorescentie resulteerde. Als interne controles, hydrogels met geen cellen werden geïncubeerd met 0, typ 10, en 1000 µg/mL van collagenase ik enzym om aan te geven van de low, medium en hoge niveaus van het signaal respectievelijk (zoals bepaald door de karakterisering van de gamma van het signaal collagenase in Figuur 3) en aangegeven door onderbroken lijnen in Figuur 4B. Verder, de werkende bereik grenzen werden berekend op basis van de signalen van 0 en 1000 µg Mn/mL en vertegenwoordigd door stippellijnen in Figuur 4B. Seeding dichtheden aan of groter is dan 1 x 106 cellen/mL vallen binnen de grenzen van het werkbereik. Metingen van de metabole activiteit van de cellijn van A375 waren ook recht evenredig met de cel zaaien dichtheid (Figuur 4C). Eerder, heeft MMP activiteit op metabole activiteit als een interne controle om te bepalen van MMP activiteit op een basis per cel8is genormaliseerd. Normaliseren van MMP activiteit op metabole activiteit over seeding dichtheden resulteerde in geen significant verschil in MMP activiteit op seeding dichtheid groter is dan 2 x 106 cellen/mL (Figuur 4D). Om te bepalen variabiliteit tussen de triplicates in elke plaat (intra-plaat variabiliteit), de coëfficiënt van de variatie percentage (% CV) werd berekend voor zowel MMP en metabole activiteit en is samengevat in tabel 2. % CV onder de 20% geeft aan dat de variabiliteit van de intra-plaat binnen triplicates aanvaardbaar voor het systeem te produceren consistente resultaten20,21.

Figure 1
Figuur 1 : De fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide ontwerp. De MMP-afbreekbaar fluorogenic peptide bestaat uit een ruggengraat peptide (pMeOBzl) GPLAC ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ geeft de breukzijde) bepaalt dat de specificiteit van de sensor. De peptide wordt aangeduid met een quencher (dabcyl) en een fluorophore (fluoresceïne), oftewel ongelest (licht) wanneer de ruggengraat peptide is gekloofd door MMP. Een thiol-groep is geconjugeerd met de ruggengraat peptide om covalente reactie met Norborneen functionele groepen in de PEG molecule, koppelen van de sensor aan de hydrogel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Schematische assay. De hydrogel voorloper oplossing componenten worden gemengd met cellen gesuspendeerd in PBS. De voorloper van oplossing is dan afgepipetteerde zwarte, ronde bodem, 96-wells-platen en polymeervorm door blootstelling aan UV-licht voor 3 min. Assay media is toegevoegd, en platen worden ge¨ uncubeerd 18 h (37 ° C, 5% CO2). De metabole activiteit reagens resazurin wordt dan toegevoegd, en platen worden geïncubeerd voor een extra 6 h. MMP en metabole activiteit worden gemeten met behulp van een fluorescerende microplate-reader met een goed scan-protocol op de aangegeven excitatie/emissie golflengten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Dynamic en werkbereik van de assay. Hydrogels matiemaatschappij met fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide werden geïncubeerd met een aantal uiteenlopende concentraties van collagenase enzym type die ik gedurende 24 uur bij 37 ° C en fluorescentie intensiteit werd gemeten. Gestippelde lijnen vertegenwoordigen het bereik van dynamische en arbeidsomstandigheden. n = 3, betekenen ± standaardafwijking (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 4
Figuur 4 : Effect van de dichtheid van melanoom cellijn A375 op MMP activiteit zaaien. (A) eerste meting (0 h) van MMP activiteit voor cellijn van A375 over een bereik van seeding dichtheden ingekapseld. n = 3 gemiddelde ± SD. (B) meten van MMP-activiteiten op 24 h. 0, 10 en 1000 µg Mn/mL collagenase worden aangegeven door onderbroken lijnen. Gestippelde lijnen vertegenwoordigen het werkbereik (WR) berekend collagenase controles. n = 3, ± SD. (C) Measurement van metabole activiteit betekenen voor A375 cellijn ingekapseld gedurende 24 uur over een bereik van zaaien dichtheden en geïncubeerd met resazurin voor 6 h. n = 3, ± SD. (D) betekenen A375 MMP activiteit op metabole activiteit genormaliseerd. n = 3, ± SD. betekenen Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Table 1
Tabel 1: Hydrogel voorloper oplossing voorbereiding.

Table 2
Tabel 2: Intra-plaat % CV van de test met A375 cellijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D in vitro celkweek recapituleert veel belangrijke aspecten van het in vivo milieu. Echter, 3D cultuur maakt ook beoordeling functie van de cel en signalering uitdagend, zoveel biologische tests vereisen cellulaire ophalen en grote aantallen cellen. Dus, de ontwikkeling van een cultuur van eenvoudige 3D-systeem waarmee meting van cellulaire functie zonder verdere monster verwerking zou aanzienlijk vergroten het nut van 3D cultuur systemen. De 3D systeem hier beschreven kan worden aangepast voor een scala aan verschillende toepassingen. De volgorde van de fluorogenic-sensor kan detecteren andere proteasen worden aangepast. Bijvoorbeeld, de fluorogenic cleavable sensor sequentie (GPQG↓IWGQK) die kan worden cleaved door MMP-1, -2, -3, -7, -8 en -9, werd eerder gebruikt voor het detecteren van melanoom MMP activiteit in reactie op chemotherapeutica22. Het gebruik van de PEG hydrogel systeem maakt het ook mogelijk nauwkeurige onafhankelijke tuning van de mobiele communicatie, met inbegrip van de mechanische eigenschappen, de afbreekbaarheid en de matrix hechting wordt binnen de hydrogel. De adhesie molecuul RGD gebruikt in dit werk is een opeenvolging van fibronectine afkomstige en maakt van integrine-gemedieerde hechting. Andere celadhesie-moleculen zoals (RLD) en (IKVAV) die zijn afgeleid van fibrinogeen en laminin respectievelijk kon worden gebruikt om andere soorten integrine receptoren te activeren. Bijvoorbeeld, het bleek dat de celadhesie-moleculen veranderen de rek van aorta terugstroming interstitiële cellen (VIC), die een effect op aortaklep stenose15 hebben kangewijzigd. De volgorde van de crosslinker hydrogel kunt de afbreekbaarheid van de hydrogel en ingekapselde cellulaire gedrag binnen de hydrogel. Bijvoorbeeld, werd aangetoond dat de fibroblasten proliferatie en cel verspreiden wanneer gekweekt in sneller vernederende hydrogels, die het helende proces in vivo23 versnellen kanwas gestegen. Mechanische eigenschappen van de communicatie kunnen ook regelen voor cel functie en hydrogel stijfheid kan worden gewijzigd door een wijziging van het aantal armen in de PEG-macromer, PEG moleculaire gewicht en de verhouding tussen PEG en crosslinker.

Omdat MMP activiteit per celtype verschilt, voor elke nieuwe celtype is het belangrijk om uit te oefenen een optimalisatie-experiment van inkapseling dichtheid hier gedemonstreerd. MMP en metabole activiteit waren na 24u voor de inkapseling, recht evenredig met het seeding celdichtheid. Echter, langere tijden die het fluorescent signaal kunt plateau, de timing van de bepaling kan moeten daarom te worden geoptimaliseerd door de gebruiker8. De specifieke protease-sensor kan ook invloed hebben op het bereik en de timing van de bepaling. Het werkbereik van de bepaling kan worden bepaald door het uitvoeren van een experiment bereik signaal met geen cellen en een Proteolytische enzymen over een breed concentratie. Integratie van verschillende geen cel hydrogel voorwaarden geïncubeerd met enzym besturingselementen maakt oprichting van de laag (achtergrond lawaai), gemiddelde en hoge niveaus van signaal binnen elke assay (0, 10 en 1000 µg Mn/mL collagenase hier). Dit geeft een indicatie van waar de signalen geproduceerd door cellen binnen het werkbereik van de bepaling vallen. Deze bepaling is ook compatibel met andere tl sensoren die geen overlappende excitatie en emissie spectra, zoals de bepaling van de metabole activiteit hier gebruikt als een interne controle voor het berekenen van MMP activiteit op basis van per cel, zoals eerder gemeld8 . MMP activiteit genormaliseerd tot metabole activiteit aangetoond dat de geldigheid van deze benadering voor het zaaien van dichtheden op of boven 2 x 106 cellen/mL, waarin er was geen significante verandering in het zaaien van dichtheden. Deze normalisatie is cruciaal voor het identificeren van de juiste seeding dichtheden die binnen het werkbereik van de curve van MMP activiteit en binnen het lineaire gebied van de normalisatie-curve.

Hoewel de bepaling aangepast voor verschillende doeleinden worden kan, zijn er verschillende beperkingen en kritieke aspecten die de gebruiker zou moeten, met betrekking tot interferentie met de fluorescerende signaal en de voorbereiding van de hydrogels in het bijzonder overwegen. Ten eerste moet worden gezorgd met de keuze van cultuurmedia en aanvullende behandelingen, zoals deze kunnen hebben op een overlappende extinctie spectrum of de ondoorzichtigheid die kan interfereren met de opsporing van fluorescentie of doven van het signaal. Het is aanbevolen om gebruik van voedingsbodems die geen fenol rood bevat. Ook sommige drug behandelingen zijn fluorescerende (bijvoorbeeld Doxorubicine), of hebben de extinctie spectrum dat overlapt met de excitatie/emissiespectrum van de fluorophore (bijvoorbeeld curcuminoïden). Een tweede aspect dat kan invloed hebben op de prestaties van de test is de voorbereiding van de hydrogel. Vanwege de hoge viscositeit van de oplossing van de voorloper hydrogel moet zorg men zich ervan vergewissen homogenisatie van het mengsel van de hydrogel oplossing en zorgvuldige pipetting praktijken ter voorkoming van ongelijke fluorophore inhoud of hydrogel oplossing volume in elk putje. Vooraf bevochtiging van de pipet tips en met behulp van lage-retentie tips kunnen helpen verminderen van variabiliteit. Een ander belangrijk aspect van hydrogel voorbereiding is de hydrogel vorm en locatie in putten. De hydrogel moet worden gecentreerd in de put en van een uniforme vorm om nauwkeurige fluorescentie metingen met minder variabiliteit15. Hier, helpt het gebruik van ronde bodem platen bij het centreren van het uiteinde van de pipet in elk putje en de productie van semi-sferische hydrogels consequent over alle putjes.

Door aanpassing van het systeem van 3D protease-afbreekbaar hydrogel, kunnen real-time protease en metabole activiteit uitlezingen worden opgespoord in een 3D communicatie met minimal steekproef verwerking. Het gebruik van de synthetische PEG hydrogel vermindert bovendien de variabiliteit van de-charges-waargenomen met natuurlijk afgeleide ECM hydrogels. Bovendien kan met behulp van PEG hydrogels "fine-tuning"-van chemische en mechanische signalen van hydrogels voor een betere bestrijding van de communicatie. Bovendien, de PEG hydrogel polymerisatie beschreven hier is een foto aangestuurde proces, waardoor het snel en meer vatbaar voor high throughput methodologieën dan klassieke natuurlijke ECM hydrogels (dwz., collageen of Matrigel), die zijn langzamer en temperatuur gevoelig. Deze snelle, gebruiker-gecontroleerde polymerisatie kunt de schaalvergroting van het systeem verder worden geautomatiseerd met behulp van robotic vloeibare handlers, zoals aangetoond door anderen15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs wil erkennen Ohio kanker onderzoek (OCR), OH, Verenigde Staten voor de financiering van deze werkzaamheden, alsmede de Koning Saud Universiteit (KSU), Riyad, KSA voor het sponsoren van de eerste auteur. Moleculair gewicht van de fluorescerende peptide sensor werd gemeten met behulp van de matrix bijgestaan, laser desorptie-ionisatie, time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF) met hulp van de Campus chemische Instrument Center massaspectrometrie en Proteomics Faciliteit aan de Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
Activated charcoal  Sigma-Aldrich C3345
Black round bottom 96-well plate Brand-Tech 89093-600
Cell adhesion peptide (CRGDS) GenScript USA Inc. custom made
Collagenase enzyme type I  Life Technologies 17100-017
Dextran Sigma-Aldrich D4876
DMEM High Glucose Media Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum (FBS)  Seradigm 1500-500
Fluorescence microplate reader  BioTek Cytation 3
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
L-glutamine Life Technologies 25030-081
MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) GenScript USA Inc. custom made
NaOH Fisher Scientific S318500
Penicillin /streptomycin Life Technologies 15140-122
Resazurin (Alamar Blue) Life Technologies DAL1100
UV light  UVP 95-0006-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Tags

Bioengineering kwestie 143 Hydrogels 3D cel inkapseling Matrix metalloproteinasen metabole activiteit melanoom fluorescentie
Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fakhouri, A. S., Leight, J. L.… More

Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter