Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/59123
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Summary

. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.

Abstract

מערכות התרבות התא תלת מימדי (3D) לעיתים קרובות באופן הדוק יותר מסכם את הדברים ויוו תגובות הסלולר ופונקציות מאשר מערכות התרבות המסורתית (2D) דו מימדי. עם זאת, מדידה של הפונקציה תא בתרבות 3D לעתים קרובות יותר מאתגר. מבחני ביולוגיים רבים דורשים שליפת חומר הסלולר אשר יכול להיות קשה בתרבויות תלת-ממד. דרך אחת בהתמודדות עם אתגר זה הוא לפתח חומרים חדשים המאפשרים מדידה של התא פונקציה בתוך החומר. כאן מוצגת שיטה למדידה של הסלולר מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP) פעילות hydrogels 3D בתבנית 96-ובכן. במערכת זו, הידרוג poly(ethylene glycol) (PEG) הוא functionalized עם חיישן cleavable MMP fluorogenic. פעילות תאית MMP פרופורציונליים לעוצמת קרינה פלואורסצנטית, ניתן למדוד עם קורא microplate רגיל. המזעור של זה וזמינותו לתבנית 96-ובכן מופחת הזמן הדרוש ניסיוני הגדר על ידי 50% ואת ריאגנט השימוש ב-80% לכל תנאי לעומת הגירסה הקודמת 24-טוב של וזמינותו. Assay הזה הוא גם תואם עם מדידות אחרות של תפקוד התאים. לדוגמה, וזמינותו פעילות חילוף החומרים הוא הפגין כאן, אשר יכול להתבצע בו זמנית עם MMP מדידות פעילות בתוך הידרוג אותו. וזמינותו הוא הפגין עם תאי מלנומה אנושית אנקפסולציה לרוחב טווח של תאים זריעה צפיפויות לקביעת צפיפות כימוס המתאים עבור טווח עבודה וזמינותו. לאחר 24 שעות של כימוס תא, MMP פעילות חילוף החומרים הקריאות הבאות היו ביחס לתא זריעה צפיפות. בעוד וזמינותו היא המודגמות כאן עם אחד fluorogenic מתכלה סובסטרט, וזמינותו של מתודולוגיה יכול להיות מותאם עבור מגוון רחב של הידרוג מערכות וחיישנים פלורסנט אחרים. כזה assay מספק פלטפורמה culturing 3D פרקטי, יעיל ונגיש בקלות עבור מגוון רחב של יישומים.

Introduction

תרבות תלת מימדי (3D) מערכות לעיתים קרובות באופן הדוק יותר מסכם את הדברים ויוו תגובות סלולרית מאשר מערכות התרבות המסורתית (2D) דו מימדי, ראו מספר פרסומים מעולה1,2,3 . אולם, ניצול מערכות התרבות תלת-ממד כדי למדוד את תפקוד התא מאתגרת בשל הקושי של אחזור הסלולר, לטעום עוד יותר עיבוד. הקושי הזה מגביל את המדידה של תאיים רבים במערכות תרבות תלת-ממד. כדי להתגבר על הקושי הזה, טכניקות חדשות הדרושים המאפשרים מדידה קלה של התא פונקציה בתוך סביבות תלת-ממד. דרך אחת לטפל הצורך הזה היא הפיתוח של חומרים לא רק לתמוך תרבית תאים תלת-ממד, אך גם לשלב חיישנים למדידת תפקוד התא. לדוגמה, מספר מערכות הידרוג שילבו fluorogenic פרוטאז moieties cleavable כדי לאפשר ויזואליזציה של פרוטאז פעילות בתוך סביבות תלת-ממד4,5,6,7. בעוד שמערכות אלה נוצלו במקור עבור הדמיה מיקרוסקופיים, מערכות אלו ניתן להתאים גם לשימוש במטריקס גלובל מטאלופרוטאז (MMP) פעילות assay שימוש בקורא צלחת רגילה, המאפשרים מדידה נתיישב של פונקציה תא ב- 3D הסביבה8.

MMPs, superfamily של אבץ פרוטאזות, לשחק תפקידים חיוניים הרקמות הומאוסטזיס, מחלות רבות. MMPs לבזות לשפץ מטריצה חוץ-תאית (ECM), קליב קולטני פני שטח התא ציטוקינים, להפעיל אחרים MMPs9,10. MMPs לשחק תפקידים חיוניים תהליכים פיזיולוגיים כגון ריפוי הפצע, מחלות כמו דלקת פרקים, טרשת עורקים, אלצהיימר וסרטן (ראה הדעת 9,10,11). ב סרטן, רמות גבוהות של הביטוי MMP חריפה בקורלציה עם גרורות סרטן, פרוגנוזה12. יתר על כן, MMPs לתרום התקדמות הגידול באמצעות קידום סרטן התא הפלישה והעברה, תהליכים תאיים כי הם תופעות 3D מטבעו13,14. לכן, יש עניין רב היכולת למדוד פעילות MMP בתרבות 3D בהקשרים רבים, כולל מחקרים ביולוגיים בסיסיים, סמים הקרנת מבחני.

פג hydrogels נמצאים בשימוש נרחב עבור תרבית תאים 3D בשל תוכנם מים גבוהה, עמידות חלבון ספיחה, והטבע tunable. פג hydrogels יש כבר functionalized עם מספר moieties לתפקוד התא ישיר, כגון עם פפטידים מימטי ECM כמו RGD, שהכנסתי IKVAV כדי להקל על הידבקות תאים או ישיר. קשירת של גורמי גדילה כגון הפיכת גורם גידול-β (TGF-β) 15,16. לאחרונה, יש כבר functionalized פג hydrogels עם פפטידים חיישן המאפשרים מדידה של התא תפקוד טוב5,8. באופן ספציפי, השימוש של מערכת הידרוג פג functionalized עם fluorogenic MMP-מתכלים פפטיד מופעלת מדידה של פעילות תאית MMP בתרבויות 3D עם קורא צלחת רגילה, נדרש ללא עיבוד נוסף. מערכות אלה תואמים גם מדדים אחרים של תפקוד התאים, לרבות פעילות חילוף החומרים. . הנה, פרוטוקול מתואר לשקילת MMP פעילות של תאים תרבותי של הידרוג פג 3D functionalized עם פפטיד MMP-מתכלים fluorogenic ותוצאות הציג הממחיש את הניסויים אופטימיזציה הראשונית צורך להשתמש בזה וזמינותו. בתאי מלנומה אנושיים (A375) היו במארז hydrogels fluorogenic על פני טווח של זריעה צפיפויות כדי לקבוע הצפיפויות זריעה המתאים שנמצאים בטווח עבודה של וזמינותו. לאחר 24 שעות של כימוס, MMP ופעילות מטבולית נמדדו ניצול קורא microplate רגיל. בשלב הבא, פעילות MMP היה מנורמל לפעילות מטבולית כדי לקבוע את צפיפויות זריעה בתוך הטווח. ליניארית של וזמינותו. לבסוף, מקדם אינטרה-צלחת של וריאציה אחוזים (% CV) חושבו בין triplicates כדי לשקף את הפארמצבטית של התוצאות שהושג. שיטה זו מאפשרת תרבית תאים 3D פשוטה ומהירה, או מידה קלה של פרוטאז פעילות עם עיבוד מינימלי מדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הידרוג רכיבים הכנה

  1. לסנתז ניאון פפטידים פרוטאז-מתכלים כמפורט במקומות אחרים8, fluorescein כמו המולקולה פלורסנט וחומר dabcyl כמו כ'חטיף. להמיס את פפטיד ב דימתיל סולפוקסיד כדי ריכוז של 10 מ מ וחנות בתוך מקרר-80 ° C קטן aliquots (~ 30 µL) כדי להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
    הערה: פפטידים אלה ניתן לרכוש גם מבחינה מסחרית. פרוטוקול זה מחייב של ציסטאין C-מסוף ברצף פפטיד כדי לאפשר התאגדות קוולנטיות הידרוג פולימר לרשת.
  2. הכן 8 הזרוע 40 kDa פוליפוני (אתילן גליקול) אמין (PEG)-norbornene (NB) כפי שמתואר17. ודא סוף functionalization קבוצה של יותר מ-90% באמצעות 1H NMR. להמיס פג-NB פוספט סטרילי מאגר, תמיסת מלח (PBS) ב 25% w/v וחנות במקפיא-80 ° C ב- aliquots (~ 300 µL).
    הערה: פג functionalized עם norbornene ניתן לרכוש גם מבחינה מסחרית.
  3. לסנתז את trimethylbenzoylphosphinate phenyl 2,4,6 ליתיום צילום-יוזם (LAP) כמתואר18. לפזר על הברכיים בתוך מים סטריליים כדי ריכוז של 68 מ מ ולאחסן בתוך מקרר-80 ° C aliquots (~ 300 µL).
    הערה: כחלופה, Irgacure (יכול לשמש 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) כיוזם-צילום. הברכיים, Irgacure ניתן לרכוש באופן מסחרי.
  4. להמיס את crosslinker פפטיד MMP-מתכלים (KCGPQG↓IWGQCK) ופפטיד אדהזיה תא (CRGDS) במים סטריליים כדי ריכוז של 200 מ מ, 100 מ מ בהתאמה, ולאחסן אותם בתוך מקרר-80 ° C (µL ~ 300 ו ~ 30 µL) aliquots, בהתאמה.

2. assay מדיה הכנה

  1. להכין את חום-לא פעיל, פחם הוציא העובר סרום שור (FBS) עבור וזמינותו MMP:
    הערה: פרוטאזות ב FBS יכול לייצר אות רקע עם וזמינותו MMP; לכן, מומלץ להשבית חום ו פחם להפשיט את FBS לתקשורת וזמינותו.
    1. הפוך ללא פעיל 100 מ של FBS על ידי חימום למשך 30 דקות ב- 55 מעלות צלזיוס.
      הערה: 100 מ של FBS היה מנוצל כאן aliquoting ואחסון ב-20 ° C לשימוש עתידי. ניתן להשתמש באמצעי אחסון קטן יותר לפי הצורך.
    2. 0.25% w/v של פחם פעיל ו- 0.025% w/החמישי לתוספי להוסיף כמות קטנה של FBS (כ- 5 מ"ל) ומערבבים עד slurry נוצר. לאחר מכן, להוסיף את שאר FBS ומערבבים למשך 30 דקות ב- 55 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה ב 1,962 x g למשך 20 דקות ב 4 º C. ואז להעביר את תגובת שיקוע לחללית אחרת.
    4. חזור על שלב 2.1.2 אבל ב 37 ° C ואחריו שלב 2.1.3. לחטא את תגובת שיקוע באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45 ומסנן ואז 0.2 µm.
  2. להכין assay מדיה באמצעות מדיה בתוספת 1% פחם הפשיטו FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין U/mL 10, 10 µg/mL סטרפטומיצין.
    הערה: המדיה ללא פנול אדום מומלץ כי יש לו פחות הפרעות קרינה פלואורסצנטית. תוספות אחרות בכלי התקשורת assay כמו אינסולין, גורמי גדילה, ועוד. ניתן להוסיף עוד ספיגת ואת פסגות ספקטרום קרינה פלואורסצנטית אינם חופפים עם החיישן (494 nm/521 ננומטר).
  3. Collagenase חיידקי שתדללו אנזים מסוג I-µg 10 ו- 1,000/mL בתקשורת assay כפקד חיובי.

3. הידרוג הכנה ותא כימוס

  1. להכין את הפתרון קודמן הידרוג.
    1. הוסף את ריאגנטים 1.5 mL צינור לפי הסדר הבא, vortexing לאחר תוספת של כל רכיב: 20 מ מ 8 יד 40 kDa פג-NB, מ"מ 12.75 crosslinker MMP-מתכלים פפטיד, 17.8 מ מ NaOH, 1 מ CRGDS, 2 מ מ. הברכיים, ו 0.25 mM fluorogenic MMP-מתכלים פפטיד.
      הערה: טבלה 1 מציגה את הידרוג קודמן פתרון. התוכן, ריכוזים מלאי, עבודה ריכוזים, נוסחאות חישוב נפח, את אמצעי האחסון הדרושים הדרושים כדי לעשות µL 120 של הידרוג קודמן פתרון, וזה מספיק לנהל להתנסות 10 hydrogels. לקחת בחשבון הפסד של הפתרון הידרוג בשל pipetting, להגדיל את נפח הכולל על-ידי 20%. פפטידים מסחרי מסופקים לעתים קרובות ב פתרון כלוריד מימן חומצי; לכן, NaOH נוסף להשגת pH הסופי של 7. ה-pH של הפתרון הסופי צריך להיות מאושרות על-ידי המשתמש.
    2. לחלק את הפתרון קודמן הידרוג מרובים 1.5 mL צינורות, שפופרת אחת לכל תנאי הנבדקת.
      הערה: מספר תנאים שליטה בו hydrogels מוכנים ללא התוספת של תאים הם הציעו. עבור פקד שלילי, להביא בחשבון שאינם ספציפיים השפלה של החיישן fluorogenic, בתנאי הידרוג אחד יכול להיות מודגרות עם הפקד הרכב או התקשורת ניסיוני לבד אם ישנם תנאים טיפול. עבור פקד חיובית, לצורך כיול בין ניסויים, hydrogels יכול להיות מודגרות עם פרוטאז ידוע קליב החיישן fluorogenic. לדוגמה, שני ריכוזים של חיידקי collagenase שימשו כאן.
  2. לתמצת בתאים hydrogels.
    1. להכין השעיה תא בודד בהתאם לסוג התא בשימוש. לדוגמה, לשטוף צלחת 10 ס מ של תאי מלנומה A375 עם 10 מ"ל ל- PBS. Trypsinize תאים באמצעות 0.05% טריפסין, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 3 מינימלית ספירת תאים עם hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל.
    2. Centrifuge הפתרון תא ב 314 x g למשך 3 דקות, תשאף תרבות המדיה ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב- PBS כ שלוש פעמים נדרש זריעה בצפיפות הגבוהה לניסוי. לדוגמה, השעיה תא עם צפיפות של תאים6 21 x 10 שימש כאן כדי להשיג צפיפות שעברו אנקפסולציה הסופי של 7 x 106 תאים/מ ל....
    3. לספור את התאים שוב כדי להבטיח ריכוז תא מדויק.
    4. הוסף תאים מושעה, PBS כל שפופרת של הידרוג קודמן פתרון על פי צפיפות זריעה הנדרש (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ו 7 x 106 תאים למ"ל בדוגמה זו). להוסיף PBS התנאים עם לא התאים במקום תאים על תנאי.
      הערה: כל התנאים צריך האחסון פתרון קודמן הידרוג הסופי אותו על מנת להבטיח את היחס בין המרכיבים הידרוג, PBS היא קבועה. האם לא וורטקס צינורות אשר יש תאים בהם, פיפטה למעלה ולמטה נמרצות מבלי ליצור בועות כדי לערבב את הפתרון מבשר.
    5. לוותר על 10 µL של הפתרון קודמן הידרוג לתוך שחור סטרילי סביב הצלחת התחתונה 96-ובכן, המבטיח כי הטיפ ממורכזת באמצע הבאר כל בזמן dispensing.
    6. פולימריזציה הידרוג קודמן פתרון על ידי חשיפת בלוח אולטרה-סגול (UV) אור-mW/cm 42 למשך 3 דקות.
      הערה: מנורת UV (מנורת UV כף יד UVL-56, UVP, Upland, CA) מייצרת אור UV-A אורך גל ארוך UV (365 nm), אשר אינה משפיעה על יכולת הקיום הסלולר.
    7. להוסיף 150 µL assay המדיה בארות כל פרט לתנאי בקרה חיובית ללא תאים שעברו אנקפסולציה. לפקדים חיובית, להוסיף 150 µL של פתרון האנזים collagenase.
    8. להוסיף 150 µL ל- PBS הבארות החיצוני של צלחת כדי להפחית את התאיידות במהלך הדגירה.

4. MMP ומדידה פעילות חילוף החומרים

  1. למדוד קרינה פלואורסצנטית מיד לאחר כימוס כדי להבטיח אחידות הידרוג הפילמור ולקביעת בסיסית פלורסצנטיות מדידה. לקרוא את הצלחת באמצעות microplate על-ידי קרינה פלואורסצנטית קורא ניצול פרוטוקול אטום 96-ובכן צלחת עם שטח סריקה קולימביה nm/521 494 nm (עירור/פליטה). זה יהיה ה 0 לקרוא.
  2. דגירה צלחת חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2 עבור 18 h.
  3. הוספת ריאגנט פעילות חילוף החומרים (resazurin)-1:10 (v/v) במשך כל.
  4. דגירה צלחת חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2 עבור h 6 נוספים.
    הערה: הפעם הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא.
  5. למדוד קרינה פלואורסצנטית-כימוס לאחר 24 שעות. לקרוא את הצלחת באמצעות microplate על-ידי קרינה פלואורסצנטית קורא ניצול פרוטוקול אטום 96-ובכן צלחת עם שטח סריקה קולימביה nm nm/521 494 (עירור/פליטה) לפעילות MMP ו ננומטר nm/590 560 (עירור/פליטה) עבור פעילות מטבולית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

וזמינותו הנוכחי הותאם ממערכת התרבות הידרוג 3D בעבר מפותח, מאופיין functionalized עם fluorogenic MMP חיישן cleavable8. החיישן MMP fluorogenic המשמש כאן מורכב רצף של פפטיד, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) ג (↓ מציין האתר המחשוף) זה היה בעבר אופטימיזציה עבור ביקוע חלבונים על ידי MMP-14 ו- MMP-1119. פפטיד מסומן עם מולקולה פלורסנט (fluorescein), מולקולה כ'חטיף (dabcyl) משני צדי האתר המחשוף (איור 1). על חשיפה של החיישן fluorogenic פרוטאז המתאים, fluorophore ואת כ'חטיף מופרדים ומגביר את קרינה פלואורסצנטית. כאן, וזמינותו היה מיניאטורי של צלחת 24-ובכן לתבנית צלחת 96-ובכן, מספר שלבים בתהליך כימוס הפחתתי והורדתי את הזמן הדרוש לביצוע ניסוי ב-50%. עוד יותר, זה מצטמצם הנפח של ריאגנטים הנצרכים על-ידי 80%, כפי הידרוג כרכים היו הופחת מ- 50 µL µL 10 לכל טוב. יתר על כן, באמצעות צלחת 96-ובכן, התנאים 20 triplicates נבדק במקום התנאים 12 פריטים כפולים לכל צלחת 24-. טוב. תיאור סכמטי של תהליך כימוס תא מודגם באיור2. תווית 1 ו- 2 תואם שלבים 3.1 ו- 3.2 בפרוטוקול, בהתאמה. תוויות 3 עד 5 תואמות צעדים 3.2.5 כדי 3.2.7 בפרוטוקול. תוויות 6-9 תואמות צעדים 4.2-4.5 בפרוטוקול.

כדי לבסס את גבולות זיהוי אותות טווח וזמינותו, hydrogels functionalized עם פפטיד MMP-מתכלים fluorogenic היו מודגרות עם מגוון של ריכוזי (0 עד 2,000 µg/mL) מסוג אנזים חיידקי collagenase אני. לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, קורא צלחת שימש כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית (איור 3). מ מדידות אלה, הדינמיקה (הנמוך ביותר, הגבוה ביותר זוהה אותות), טווח עבודה (3 סטיות תקן מעל האות שזוהו הנמוך ביותר) ו- 3 סטיות תקן מתחת האות הגבוה ביותר שזוהו היו נחושים. לאחר 24 שעות של דגירה, זה היה ציין כי האות שזוהו הנמוך ביותר הופק על ידי פקדים שלילי (קולות רקע)-0 collagenase µg/mL, בעוד זוהה הגבוה ביותר אות הופק על ידי 1,000 collagenase µg/mL או לעיל, שבו מתחיל האות מישור (איור 3). מן הטווח הדינמי, טווח עבודה מחושב כדי להיות בין ≈0.16 µg/mL ≈474 µg/mL של collagenase, מגוון רחב של איתות על פני שלושה סדרי גודל.

עבור מבחני התרבות תאים, צפיפות תאים מתאים כי התוצאות קריאות קרינה פלואורסצנטית בטווח עבודה של וזמינותו להיקבע עבור כל סוג התא. כאן, נציג נתונים מוצגת עבור שורת תאי מלנומה A375, כמוס במגוון צפיפויות של 0.25 7 x 106 תאים/מ ל.... עוצמת קרינה פלואורסצנטית נרכשה ניצול קורא microplate סטנדרטי-שתי נקודות זמן שונות: 1) ישירות לאחר כימוס (0 h) ו- 2) לאחר 24 שעות של כימוס. ! הו, קריאות קרינה פלואורסצנטית היו נמוכה על פני צפיפויות זריעה (איור 4א), כצפוי. לאחר 24 שעות של תרבות (איור 4B), פעילות MMP היתה ביחס ישר צפיפות זריעה, שבו יותר תאים, גרמו יותר חזה של fluorogenic MMP חיישן cleavable, קרינה פלואורסצנטית בעוצמה גבוהה יותר. כמו בקרה פנימית, hydrogels המכיל תאים לא היו מודגרות עם 0, 10, ו- 1,000 µg/מ של collagenase מסוג I אנזים כדי לציין את רמות נמוך, בינוני וגבוה של האות בהתאמה (כפי שנקבע על ידי אפיון טווח האות collagenase ב איור 3) מיוצג באמצעות קווים מקווקווים באיור 4B. עוד יותר, גבולות טווח העבודה היו שמחושבים את אותות µg/mL 0 ו- 1,000, המיוצג על-ידי קווים מנוקדים איור 4B. צפיפויות זריעה או גדול מ- 1 x 106 תאים למ"ל ליפול בגבולות טווח העבודה. מדידות פעילות חילוף החומרים של הקו תא A375 היו גם ביחס ישר לתא זריעה צפיפות (איור 4C). בעבר, פעילות MMP מנורמל לפעילות מטבולית כמו בקרה פנימית כדי לקבוע MMP הפעילות על בסיס לכל תא8. נרמול MMP פעילות לפעילות המטבולית על פני צפיפויות זריעה הביא הבדל משמעותי בפעילות MMP-זריעה צפיפויות גדול מ- 2 x 106 תאים/mL (איור 4D). כדי לקבוע השתנות בין triplicates כל צלחת (השתנות אינטרה-plate), המקדם של וריאציה באחוזים (אחוז CV) מחושב עבור MMP והן פעילות חילוף החומרים, מסוכם בטבלה מס ' 2. % קורות חיים מתחת 20% מציין ההשתנות אינטרה-צלחת בתוך triplicates מקובל עבור מערכת להפקת תוצאות עקביות20,21.

Figure 1
איור 1 : Fluorogenic עיצוב פפטיד MMP-מתכלים. Fluorogenic MMP-מתכלים פפטיד מורכב פפטיד המרכזי (backbone) GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) ג (↓ מציין האתר המחשוף) הקובע יחודיות של החיישן. פפטיד תווית של כ'חטיף (dabcyl), fluorophore (fluorescein), שהינו הפצועות (שזוהר) כאשר פפטיד עמוד השדרה הוא ביקע מאת MMP. קבוצת תיול היא מצומדת כדי פפטיד עמוד השדרה כדי לאפשר תגובה קוולנטיות עם norbornene קבוצות פונקציונליות במולקולת פג, צימוד החיישן הידרוג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Assay מפרטים טכניים- רכיבי פתרון קודמן הידרוג מעורבבים עם תאים הושעו ב- PBS. הפתרון קודמן הוא אז pipetted השחור, לעגל למטה, צלחות 96-ובכן, polymerized בחשיפה לאור אולטרא סגול במשך 3 דקות Assay הוספת מדיה, צלחות מודגרת למשך 18 h (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). Resazurin מגיב פעילות חילוף החומרים ואז הוא הוסיף צלחות מודגרת למשך ה 6 נוספים MMP, פעילות חילוף החומרים נמדדים באמצעות קורא microplate פלורסנט עם פרוטוקול סריקה טוב באורכי גל עירור המצוין/פליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : דינאמי ומגוון עבודה של וזמינותו. Hydrogels functionalized עם fluorogenic MMP-מתכלים פפטיד היו מודגרות עם מגוון של ריכוזים של סוג של אנזים collagenase שאני במשך 24 שעות ביממה בעוצמה 37 ° C ו קרינה פלואורסצנטית נמדדה. קווים מנוקדים מייצגים את טווח דינמי ועובד. n = 3, כלומר ± סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 4
איור 4 : השפעת זריעה צפיפות של מלנומה תאים בטור A375 על פעילות MMP- (א) בראשי תיבות-מדידה (0 h) של פעילות MMP לקו תא A375 כמוס על מגוון רחב של צפיפויות זריעה. n = 3 זאת אומרת ± SD. (B) מדידה של פעילות MMP-24 ח' 0, 10 ו- 1000 µg/mL של collagenase מיוצגים על ידי קווים מקווקווים. קווים מנוקדים מייצגים את טווח עבודה (WR) שמחושבים פקדים collagenase. n = 3, מתכוון ± SD. (ג) מדידה של פעילות חילוף החומרים עבור קו תא A375 כמוס במשך 24 שעות ביממה על טווח של זריעה צפיפויות, מודגרות עם resazurin עבור 6-אייץ n = 3, כלומר ± SD. (ד) A375 MMP פעילות מנורמל לפעילות מטבולית. n = 3, כלומר ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Table 1
טבלה 1: הידרוג קודמן פתרון הכנה-

Table 2
בטבלה 2: פלייט-"אינטרה" % CV וזמינותו בקו תא A375.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תרבית תאים במבחנה 3D recapitulates רבות היבטים חשובים של הסביבה ויוו. אולם, תרבות 3D עושה גם להערכת תפקוד התא, איתות מאתגר, מבחני ביולוגיות רבות דורשות אחזור הסלולר ואת מספר גדול של תאים. לפיכך, הפיתוח של מערכת פשוטה תרבות 3D המאפשר מדידה של תפקוד התאים ללא דוגמה נוספת עיבוד להגדיל באופן משמעותי את התועלת של מערכות התרבות תלת-ממד. מערכת תלת-ממד המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של יישומים שונים. ניתן לשנות את הרצף של החיישן fluorogenic כדי לזהות פרוטאזות אחרים. למשל, fluorogenic חיישן cleavable הרצף (GPQG↓IWGQK) אשר יכול להיות ביקע מאת MMP-1,-2,-3,-7, -8 ו-9, היה מנוצל קודם לכן כדי לזהות פעילות MMP מלנומה בתגובה chemotherapeutics22. השימוש במערכת הידרוג פג גם מאפשרת כיוונון עצמאית מדויק של microenvironment הסלולר, כולל התכונות המכאניות, את degradability את moieties אדהזיה מטריקס בתוך הידרוג. מולקולת אדהזיה RGD נעשה שימוש בעבודה זו הוא רצף נגזר fibronectin ומאפשר אדהזיה בתיווך אינטגרין. מולקולות אדהזיה אחרות כגון (שהכנסתי) ו- (IKVAV) אשר נגזרים מתוך פיברינוגן ו laminin בהתאמה יכול להיות מנוצל כדי להפעיל סוגים אחרים של קולטנים אינטגרין. לדוגמה, הוכח כי שינוי מולקולות אדהזיה שינתה את התארכות של אבי העורקים valvular תאים ביניים (ויק), אשר עלולה להיות השפעה על היצרות מסתם אבי העורקים15. הרצף crosslinker הידרוג ניתן לשלוט על degradability של הידרוג והתנהגות הסלולר שעברו אנקפסולציה בתוך הידרוג. לדוגמה, הוכח כי fibroblasts גברה ההתפשטות ותא מתפשט כאשר תרבותי מהר יותר משפילים hydrogels, אשר עשוי לזרז את תהליך הריפוי ויוו23. תכונות מכניות של microenvironment יכול גם לווסת את תפקוד התא, נוקשות הידרוג ניתן לשנות על ידי שינוי מספר הזרועות macromer של פג, משקל מולקולרי פג, היחס בין פג crosslinker.

מכיוון MMP פעילות משתנה לפי סוג התא, עבור כל סוג תא חדש חשוב לערוך ניסוי אופטימיזציה של צפיפות כימוס כפי שמתואר כאן. לאחר 24 שעות של כימוס, MMP ופעילות מטבולית היו ביחס ישר לתא צפיפות זריעה. עם זאת, בתקופות זמן שהאות פלורסנט יכולה מישור, לכן העיתוי של וזמינותו ייתכן שיהיה עליך להיות אופטימיזציה על ידי המשתמש8. החיישן פרוטאז ספציפי יכול להשפיע גם על טווח עבודה והתזמון של וזמינותו. טווח עבודה וזמינותו יכול להיקבע על-ידי עריכת ניסוי טווח האות עם אין תאים, אנזים הפרוטאוליטי על ריכוז רחב. הכללת מספר התא הידרוג תנאים מודגרות עם פקדים אנזים מאפשר הקמת הנמוכה (קולות רקע), רמות בינוניים וגבוהים של האות בתוך כל assay (0, 10 ו- 1,000 µg/mL של collagenase כאן). זה נותן אינדיקציה איפה אותות המיוצר על ידי תאי ליפול בטווח עבודה של וזמינותו. Assay הזה הוא גם תואם עם החיישנים פלורסנט האחרים שאין להם חופפים עירור, ספקטרום הפליטה, כגון וזמינותו פעילות חילוף החומרים המשמש כאן בתור פקד פנימי כדי לחשב MMP פעילות על בסיס לכל תא, כפי שצוין בעבר דיווחו8 . פעילות MMP פעילות מנורמל ל מטבולית הפגינו תוקפו של גישה זו עבור זריעה צפיפות או מעל 2 x 106 תאים למ"ל, שבו אין היה שינוי משמעותי מעבר זריעה צפיפות. נורמליזציה זה חיוני לזהות את צפיפויות זריעה המתאים שנמצאים בתוך טווח עבודה של העקומה פעילות MMP ובתוך החלק הליניארי של העקומה נורמליזציה.

בעוד וזמינותו ניתן להתאים למספר מטרות, יש מספר מגבלות, היבטים קריטיים שהמשתמש צריך לשקול, במיוחד לגבי התערבות עם אות ניאון, הכנת hydrogels. ראשית, חייבים להקפיד עם הבחירה של תרבות התקשורת וטיפולים נוספים, כמו אלה יכולים לקבל ספקטרום ספיגת חופפים או opaqueness העלול להפריע הגילוי של זריחה או להרוות את האות. מומלץ להשתמש מדיה תרבות שאינה מכילה פנול אדום. כמו כן, ישנם טיפולים בסמים הן פלורסנט (למשל, דוקסורוביצין), או יש ספיגת ספקטרום החופפים עם ספקטרום הפליטה/עירור של fluorophore (למשל, curcuminoids). היבט נוסף אשר יכולים להשפיע על הביצועים של וזמינותו היא הכנת הידרוג. בגלל צמיגות גבוהה של הפתרון קודמן הידרוג, טיפול צריך לנקוט כדי להבטיח ערבוב יסודי של הידרוג הפתרון ושיטות pipetting זהירות כדי למנוע fluorophore שווים תוכן הידרוג פתרון אחסון או כל היטב. מראש להרטיב הטיפים פיפטה ושימוש טיפים לשמירה על נמוך יכול לעזור להפחית את השתנות. היבט חשוב נוסף של הידרוג הכנה הוא הידרוג הצורה והמיקום בבארות. צריך להיות מרוכז של הידרוג בתוך הבאר והן של צורה אחידה כדי לאפשר מדידות קרינה פלואורסצנטית מדויק עם השתנות פחות15. . הנה, השימוש של לוחות עגולים מסייעת מרכוז הטיפ פיפטה מכל קידוח, הייצור של hydrogels חצי כדורית באופן עקבי על פני כל בארות.

על ידי התאמת מערכת הידרוג פרוטאז-מתכלים תלת-ממד, ניתן להבחין פרוטאז בזמן אמת, נתוני פעילות חילוף החומרים ב- microenvironment תלת-ממד עם עיבוד מדגם מינימלי. בנוסף, השימוש הידרוג פג סינתטי מפחיתה את ההשתנות אצווה-כדי-אצווה נצפתה עם hydrogels ECM נגזר באופן טבעי. יתר על כן, ניצול פג hydrogels מאפשרת כוונון של סימנים כימיים ועל מכניים של hydrogels עבור פקד משופרת של microenvironment. יתר על כן, הפילמור הידרוג פג המתוארים כאן הוא תהליך המופעלים באמצעות צילום, שהופך אותו יותר נוטה מתודולוגיות תפוקה גבוהה יותר קלאסי hydrogels ECM טבעית ומהירה (כלומר., קולגן או Matrigel), אשר הם איטיים יותר, טמפרטורה רגיש. זה מהיר, בפיקוח המשתמש פלמור מאפשר את דרוג-up של המערכת כדי להיות עוד יותר אוטומטי באמצעות המטפלים נוזלי רובוטית, כפי שמתואר על ידי אחרים15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר אוהיו סרטן מחקר (OCR), הו, בארה"ב למימון עבודה זו, כמו גם המלך סעוד האוניברסיטה (KSU), ריאד, KSA עבור המממנת המחבר הראשון. משקל מולקולרי של החיישן ניאון פפטידים נמדדה באמצעות מטריצת בסיוע, לייזר desorption-יינון, ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF) זמן-של-טיסה עם סיוע מן הקמפוס כימי כלי מרכז ספקטרומטריית פרוטאומיקס מתקן ב אוניברסיטת מדינת אוהיו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
Activated charcoal  Sigma-Aldrich C3345
Black round bottom 96-well plate Brand-Tech 89093-600
Cell adhesion peptide (CRGDS) GenScript USA Inc. custom made
Collagenase enzyme type I  Life Technologies 17100-017
Dextran Sigma-Aldrich D4876
DMEM High Glucose Media Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum (FBS)  Seradigm 1500-500
Fluorescence microplate reader  BioTek Cytation 3
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
L-glutamine Life Technologies 25030-081
MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) GenScript USA Inc. custom made
NaOH Fisher Scientific S318500
Penicillin /streptomycin Life Technologies 15140-122
Resazurin (Alamar Blue) Life Technologies DAL1100
UV light  UVP 95-0006-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Tags

Bioengineering גיליון 143 Hydrogels תלת-ממד תא כימוס מטריקס Metalloproteinases פעילות חילוף החומרים מלנומה קרינה פלואורסצנטית
מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fakhouri, A. S., Leight, J. L.… More

Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter