Summary
여기, 프로토콜 캡슐화 및 poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fluorogenic 매트릭스 metalloproteinase (MMP)와 기능성된에 세포 배양에 대 한 제시는-분해 펩 티 드. 세포질 MMP와 대사 활동 표준 microplate 리더를 사용 하 여 하이드로 겔 문화에서 직접 측정 됩니다.
Abstract
3 차원 (3D) 세포 배양 시스템 종종 더 자세히 정리 vivo에서 세포 반응과 기능 전통적인 2 차원 (2D) 문화 시스템 보다. 그러나, 세포 기능 3D 문화에서의 측정은 종종 더 많은 도전. 많은 생물학 분석 실험 3D 문화에 어려울 수 있는 셀룰러 자료의 검색을 해야 합니다. 이 문제를 해결 하기 위해 한 가지 방법은 셀 함수는 재료 내에서 측정을 가능 하 게 새로운 자료를 개발 하는 것입니다. 여기, 96 잘 형태로 3D hydrogels에서 셀룰러 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 활동의 측정에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 이 시스템에서는, poly(ethylene glycol) (PEG) 하이드로 겔은 기능성 fluorogenic MMP 쪼갤 센서. 세포질 MMP 활동 형광 강도에 비례 하 고 표준 microplate 리더와 측정 될 수 있다. 소형화 96 잘 형식이 분석 결과의 분석 결과의 이전 24 잘 버전에 비해 조건 당 80 %50 %와 시 약 사용에 의해 실험 설정에 필요한 시간을 감소. 이 분석 결과 또한 세포질 기능의 다른 측정에 호환 됩니다. 예를 들어 대사 활동 분석 결과 시연입니다 여기, MMP 활동 측정 같은 히드로 내 동시에 실시 될 수 있습니다. 분석 결과 시드 밀도 분석 결과의 작업 범위에 대 한 적절 한 캡슐화 밀도 결정 하는 셀의 범위에 걸쳐 캡슐화 인간 흑색 종 세포와 함께 설명 했다. 셀 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 표시기 셀 시드 밀도에 비례 했다. 분석 결과 한 fluorogenic 분해성 기판으로 여기 설명 된다, 하는 동안 분석 결과 및 방법론 수 있습니다 다양 한 하이드로 겔 시스템 및 다른 형광 센서에 대 한 적응. 이러한 분석 결과 다양 한 응용 프로그램에 대 한 실용적인, 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 3D 자란 플랫폼을 제공.
Introduction
3 차원 (3D) 문화 시스템 종종 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 (2D) 문화 시스템 보다 vivo에서 세포 응답을 정리, 여러 우수한 간행물1,2,3 참조 . 그러나, 세포 기능을 측정 하기 위해 3D 문화 시스템을 활용 하 여 셀룰러 검색의 어려움 때문에 도전 되 고 추가 처리. 이 어려움 3 차원 배양 시스템에서 많은 세포 기능 측정을 제한합니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 새로운 기술을 쉽게 측정 3D 환경에서 셀 함수를 사용할 수 있는 필요. 이 필요 해결 하기 위해 한 가지 방법은 세포 기능을 측정 하는 센서 뿐 아니라 3D 세포 배양을 지원 뿐만 아니라 재료의 개발 이다. 예를 들어 여러 하이드로 겔 시스템 fluorogenic 효소 쪼갤 moieties 3D 환경4,5,,67프로 테아 제 활동의 시각화 수 있도록 통합 했습니다. 이러한 시스템은 원래 현미경 이미징에 대 한 활용 하 고, 하는 동안 이러한 시스템도 3D에 셀 함수의 손쉬운 측정을 사용 하면 표준 플레이트 리더를 사용 하 여 글로벌 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 활동 분석에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 환경8.
MMPs, 아연 프로 테아 제, superfamily 정상 조직의 항상성 그리고 많은 질병에 중요 한 역할을 재생합니다. MMPs 저하와 세포 외 기질 (ECM) 개장, 세포 표면 수용 체, cytokines를 쪼개 고 다른 MMPs9,10활성화. MMPs 상처 치유 등 생리 적 과정에 고 등 관절염, 동맥 경화, Alzheimer, 암 ( 9,,1011리뷰 참조) 질병에 중요 한 역할을 재생 합니다. 암, MMP 식 상부는 암 전이 및 빈약한 예 지12와 강하게 상관 된다. 또한, MMPs 암 세포 내 습 및 마이그레이션, 본질적으로 3D 현상13,14는 세포질 과정을 홍보 하 여 종양 진행에 기여 한다. 따라서, 근본적인 생물학 연구 및 약물 분석 검사를 포함 하 여 많은 문맥에서 3 차원 문화에 MMP 활동을 측정 하는 능력에 많은 관심이 있다.
그들의 높은 함량으로 인해 3D 세포 배양, 단백질 흡착, 및 가변 자연 저항을 못 hydrogels 널리 사용 됩니다. 못 hydrogels 있다 되어 기능성 moieties 직접 세포 기능에의 번호와 같이 RGD, 같은 RLD, IKVAV 세포 접착을 촉진 또는 변형 성장 인자-β (TGF-β) 등 성장 요인의 tethering 직접 ECM 모방 펩 티 드와 15,16. 더 최근에, 말뚝 hydrogels 있다 되어 기능성 잘5,8로 세포 기능 측정을 사용할 수 있는 센서 펩 티 드와 함께. 특히, PEG 하이드로 겔 시스템의 사용 fluorogenic 표준 플레이트 리더와 3D 문화에서 셀룰러 MMP 활동의 MMP 분해 펩 티 드 활성화 측정으로 기능성 고 아니 추가 처리 하는 데 필요한. 이러한 시스템은 또한 신진 대사 활동을 포함 하 여 세포질 기능의 다른 측정에 호환 됩니다. 여기, 프로토콜은 3D 못 하이드로 겔 fluorogenic MMP 분해 펩타이드와 기능성된 및이의 사용에 필요한 초기 최적화 실험을 보여주는 제시 결과에서 경작 하는 세포의 MMP 활동의 측정에 대 한 설명 분석 결과입니다. 인간 흑색 종 세포 (A375) 시드 범위 내에 있는 작업 분석 결과의 적절 한 시드 밀도 결정 하는 밀도의 범위 fluorogenic hydrogels에 캡슐화 되었습니다. 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 측정 했다 표준 microplate 리더를 활용 하 여. 다음, MMP 활동 분석 결과의 선형 범위 내에서 시드 밀도 결정 하는 신진 대사 활동을 정상화 했다. 마지막으로, 내부 플레이트 계수의 편차 백분율 (%CV) 얻은 결과의 재현성을 반영 하기 위해 triplicates 사이 계산 했다. 이 메서드는 간단 하 고 빠른 3D 세포 배양, 그리고 최소한의 샘플 처리와 프로 테아 제 활동의 쉽게 측정을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 하이드로 겔 구성 요소 준비
- 음성 합성 설명으로 형광 효소 분해 펩 티 드 다른8, 형광 분자 처럼 fluorescein와 dabcyl는 끄는으로 활용. 10 m m의 농도에 DMSO에 펩 티 드와 반복된 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 작은 (~ 30 µ L) aliquots에서-80 ° C 냉동 고에서 저장소를 분해.
참고: 이러한 펩 티이 드가 상업적으로 구입할 수도 있습니다. 이 프로토콜에는 C 터미널 시스테인을 하이드로 겔 폴리머 네트워크에 공유 결합 수 있도록 펩 티 드 순서에 필요 합니다. - 8 팔 40 kDa 폴 리 (에틸렌 글리콜) 아민 (PEG) 준비-norbornene (NB)로17설명. 보다 큰 1H NMR을 사용 하 여 90%의 끝 그룹 기능화를 확인 합니다. 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 25 %w / v 및-80 ° C 냉장고 (~ 300 µ L) aliquots에 있는 저장소에에서 말뚝-NB를 분해.
참고: 못 공업화와 norbornene을 또한 상업적으로 구입할 수 있습니다. - 18설명 되어 있는 대로 사진 초기자 리튬 페 닐 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (무릎) 음성 합성. 메 마른 물 68 m m의 농도에 무릎을 녹이 고 (~ 300 µ L) aliquots에서-80 ° C 냉동 고에 저장.
참고: 대 안으로 서, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)는 사진-개시자로 사용할 수 있습니다. 무릎 및 Irgacure는 상업적으로 구입할 수 있습니다. - MMP 분해 펩 티 드 crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK)와 살 균 물 200 m m와 100 m m의 농도에 세포 접착 펩타이드 (CRGDS)를 각각, 해산 하 고 (~ 300 µ L와 ~ 30 µ L)-80 ° C 냉동 고에 저장 aliquots, 각각.
2. 분석 결과 미디어 준비
- 열 비활성화 준비, 숯불 박탈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) MMP 분석 결과 대 한:
참고: FBS 프로 테아 MMP 분석 결과;와 높은 배경 신호를 생성할 수 있습니다. 따라서, 그것은 열 비활성화 하 고 숯을 권장 분석 결과 미디어 FBS 스트립.- 55 ° c.에 30 분 동안가 열 하 여 100 mL FBS의 비활성화
참고: FBS의 100 mL aliquoting 및 나중에 사용-20 ° C에서 저장 여기 이용 되었다. 필요에 따라 작은 볼륨을 사용할 수 있습니다. - 활성 탄 및 0.025 %w / v dextran의 0.25 %w / v FBS (약 5 mL)의 작은 금액을 추가 하 고 슬러리를 형성 될 때까지 저 어. 그런 다음는 FBS의 나머지를 추가 하 고 55 ° c.에 30 분 동안 저 어
- 4 ° c.에 20 분 동안 1,962 x g 에서 원심 분리기 그런 다음 다른 용기에는 상쾌한 전송.
- 2.1.2 단계를 반복 하지만 2.1.3 단계 뒤 37 ° C에. 0.45 μ m 필터 다음 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 상쾌한 소독.
- 55 ° c.에 30 분 동안가 열 하 여 100 mL FBS의 비활성화
- 분석 결과 미디어 준비 FBS, 2 mM L-글루타민, 10 U/mL 페니실린, 10 µ g/mL 스 박탈 1% 숯으로 보충 하는 미디어를 사용 하 여.
참고: 미디어 페 놀 레드 없이 더 적은 형광 방해가지고 있기 때문에 좋습니다. 다른 추가 인슐린, 성장 인자 등의 분석 결과 미디어 등. 만큼 흡수도 추가 될 수 있습니다 및 형광 스펙트럼 봉우리 센서 (494 nm/521 nm)와 중첩 되지 않습니다. - 희석 세균성 콜라 효소 긍정적인 컨트롤로 10과 1000 µ g/mL 분석 결과 미디어에서에서 나를 입력 합니다.
3. 하이드로 겔 준비와 세포 캡슐화
- 하이드로 겔 전조 솔루션을 준비 합니다.
- 다음 순서로 1.5 mL 튜브, vortexing 각 부품의 추가 후에 시 약을 추가: 20 mM 8 팔 40 kDa 못 NB, 12.75 m m crosslinker MMP 분해 펩 티 드, 17.8 m m NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM 무릎, 및 0.25 m m fluorogenic MMP 분해 펩 티 드.
주: 표 1 보여줍니다 히드로 전조 솔루션 내용, 재고 농도, 작업 농도, 볼륨 계산 수식 및 필요한 볼륨 히드로 전조 솔루션을 실시 하기에 충분 한 120 µ L를 만드는 데 필요한는 10 hydrogels 실험. Pipetting으로 히드로 솔루션의 손실에 대 한 계정, 총 볼륨 20% 증가. 상업적인 펩 티 드 종종; 산 성 염화 수소 솔루션 제공 따라서, NaOH는 7의 최종 pH를 달성 하기 위해 추가 됩니다. 마지막 해결책의 pH는 사용자에 의해 확인 되어야 한다. - 여러 1.5 mL 튜브에 나눌 히드로 전조 솔루션 테스트 조건 당 1 개의 관.
참고: 셀의 추가 없이 hydrogels 준비가 여러 제어 조건 건의 된다. 부정적인 제어를 위한 fluorogenic 센서의 일반적인 저하에 대 한 계정에 한 하이드로 겔 상태 수 알을 품 차량 제어 또는 혼자 실험 미디어 처리 조건이 없는 경우. 긍정적인 통제와 실험 사이 교정 hydrogels fluorogenic 센서를 쪼개 다 알려진 효소와 incubated 수 있습니다. 예를 들어 세균 콜라의 2 농도 여기 사용 되었다.
- 다음 순서로 1.5 mL 튜브, vortexing 각 부품의 추가 후에 시 약을 추가: 20 mM 8 팔 40 kDa 못 NB, 12.75 m m crosslinker MMP 분해 펩 티 드, 17.8 m m NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM 무릎, 및 0.25 m m fluorogenic MMP 분해 펩 티 드.
- Hydrogels 셀을 캡슐화 합니다.
- 사용 중인 셀 형식에 대 한 적절 한 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 예를 들어 10 mL의 PBS로 A375 흑색 종 세포의 10 cm 접시 세척. 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize 하 고 37 ° C, 5% CO2 3 분 수 셀 전체 휴대폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에서 품 어.
- 314 x g 3 분에 셀 솔루션 원심, 문화 미디어, 발음 다음 다시 약 3 배 높은 필요한 시드 밀도 실험에 대 한에 PBS에 셀을 일시 중단 합니다. 예를 들어 21 x 106 세포의 밀도와 세포 현 탁 액 여기 7 x 106 셀/mL의 최종 캡슐화 된 밀도 달성 하기 위해 사용 되었다.
- 다시는 정확한 셀 농도 되도록 셀을 계산 합니다.
- 필요한 시드 밀도 (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7 x 106 셀/mL이이 예제에서)에 따라 하이드로 겔 전조 솔루션의 각 튜브를 일시 중단 된 세포와 PBS를 추가 합니다. 일시 중단 된 셀 대신 셀 조건에 PBS를 추가 합니다.
참고: 모든 조건을 히드로 구성 요소 사이의 비율을 보장 하기 위해 동일한 최종 히드로 전조 솔루션 볼륨 있고 PBS는 일정. 그들의 세포, 플라스틱 전조 솔루션을 혼합 하기 위하여 거품을 만들지 않고 적극적으로 아래로 소용돌이 관 하지 마십시오. - 팁은 분배 하는 동안 각 잘 가운데 중심으로 보장 아래 96 잘 접시 라운드 무 균 블랙에 히드로 전조 솔루션의 10 µ L을 분배.
- 3 분 4 mW/cm2 울트라 바이올렛 (UV) 빛 접시를 노출 하 여 하이드로 겔 전조 솔루션 유해.
참고: UV 램프 (UVL 56 휴대용 UV 램프, UVP, 고지대, 캘리포니아) 긴 UV 파장에서 자외선 빛을 생산 (365 nm),이 세포 생존에 영향을 주지 않습니다. - 캡슐화 된 셀 없이 긍정적인 제어 조건 제외한 모든 우물에 분석 결과 미디어의 150 µ L를 추가 합니다. 긍정적인 컨트롤에 콜라 효소 솔루션의 150 µ L를 추가 합니다.
- 인큐베이션 기간 동안 증발을 줄이기 위해 플레이트의 외부 우물에 PBS의 150 µ L를 추가 합니다.
4. MMP와 대사 활동 측정
- 형광 측정 기준 형광 측정 설정 히드로 합에 균일 하 바로 후 캡슐화. 형광 microplate를 사용 하 여 접시를 읽고 리더 면적 불투명 96 잘 접시 프로토콜을 활용 하 여 스캔 494 nm/521 nm (여기/방출)에. 이 읽기 0 h를 될 것입니다.
- 18 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에 접시를 품 어.
- 1:10 (v/v) 각 잘 대사 활동 시 약 (resazurin)를 추가 합니다.
- 추가 6 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에 접시를 품 어.
참고:이 보육 시간 셀 유형에 따라 달라질 수 있습니다. - 24 시간 후 캡슐화에 형광을 측정 합니다. 형광 microplate를 사용 하 여 접시를 읽고 면적 불투명 96 잘 접시 프로토콜을 활용 하는 리더 MMP 활동 494 nm/521 nm (여기/방출) 및 560 nm/590 nm (여기/방출) 신진 대사 활동에 대 한 설정을 검색 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
현재 분석 결과 fluorogenic MMP 쪼갤 센서8공업화 이전 개발 및 특징이 3D 히드로 문화 시스템에서 적응 시켰다. 여기에 사용 되는 fluorogenic MMP 센서 GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C, 펩 티 드 순서의 구성 (↓ 나타냅니다 분열 사이트)는 이전 MMP-14 및 MMP 1119분열에 대 한 최적화 되었습니다. 펩 티 드 (fluorescein) 형광 분자와 분열 사이트 (그림 1)의 양쪽에 끄는 분자 (dabcyl)으로 표시 됩니다. 노출 되 면 fluorogenic 센서의 적절 한 효소에, fluorophore 및 끄는 구분 하 고 형광 증가 한다. 여기, 분석 결과 96 잘 접시 형식으로 캡슐화 프로세스의 여러 단계를 제거 하 고 50% 하 여 실험을 수행 하는 데 필요한 시간을 줄이고 24-잘 접시에서 소형화 했다. 하이드로 겔 볼륨 잘 당 10 µ L를 50 µ L에서 감소 했다 또한, 그것은 시 약 80%, 사용의 볼륨을 감소. 또한, 96 잘 접시를 사용 하 여 triplicates에서 20 조건 24-잘 접시 당 중복에 12 조건 대신 테스트 될 수 있습니다. 셀 캡슐화 과정의 개략은 그림 2에 나와 있습니다. 라벨 1 및 2 단계 3.1 및 3.2 프로토콜에서에 각각 해당 합니다. 레이블 3 ~ 5 단계 3.2.5 3.2.7 프로토콜에 해당합니다. 레이블 6 ~ 9 단계 4.5 4.2 프로토콜에 해당합니다.
검출 한계를 설정 하 고 분석 결과의 범위를 신호, fluorogenic MMP 분해 펩타이드와 기능성된 hydrogels 했다 incubated 세균성 콜라 효소 종류의 농도 (0 2000 µ g/mL)의 범위와 나. 후 37 ° C에 외피의 24 h, 플레이트 리더 형광 (그림 3)을 측정 하기 위해 사용 되었다. 이러한 측정, 동적에서에서 (최저 및 최고 검출 신호) (3 표준 편차 최저 감지 신호 위)와 높은 감지 신호 아래 3 표준 편차 범위 결정 했다. 후 보육의 24 h, 최저 감지 신호 0 µ g/mL 콜라에 부정적인 컨트롤 (배경 잡음)에 의해 제작 되었다, 신호 1000 µ g/mL 콜라 또는 신호를 시작 하는 위치 위에 만들어진 최고의 검색 하는 동안 관찰 되었다 고원 (그림 3)입니다. 동적 범위에서 작업 범위 ≈0.16 µ g/mL와 콜라, 3 개의 크기 순서에 걸쳐 넓은 신호 범위의 ≈474 µ g/mL 사이 계산 했다.
셀 문화 분석에 대 한 각 셀 형식에 대 한 작업의 범위 내에서 분석 결과 형광 판독 결과 적절 한 세포 밀도 결정 합니다. 여기, 대표적인 데이터 흑색 종 세포 선 A375, 7 x 106 셀/mL을 0.25에서 밀도의 범위에 대 한 제공 됩니다. 형광 강도 두 다른 시간 지점에서 표준 microplate 리더를 활용 하 여 획득: 1) 직접 캡슐화 (0 h) 그리고 후 2) 캡슐화의 24 시간. 0 h에서 형광 판독 했다 낮은 시드 밀도그림 4(A)를 통해 예상 대로. 문화 (그림 4B)의 24 시간, MMP 활동 직접 fluorogenic MMP 쪼갤 센서 및 높은 형광 강도 더 분열 셀 결과 시드 밀도에 비례 했다. 로 내부 통제, hydrogels 셀을 포함 하는 0 incubated 했다, 10, 및 1000 µ g/mL 콜라의 유형 I 신호 각각 (로 에 콜라 신호 범위 특성에 의해 결정의 낮은, 중간 및 높은 레벨을 나타내는 효소 그림 3) 그림 4B에 파선으로 표시. 또한, 작업 범위 제한 0과 1000 µ g/mL 신호에서 계산 하 고 그림 4B에서 점선으로 표시 되었다. 시드 밀도 또는 1 x 106 셀/mL 보다 큰 작동 범위 내에서을. 신진 대사 활동 측정 A375 셀 라인의 밀도 (그림 4C) 시드 셀에 직접 비례 했다. 이전, MMP 활동 당 셀 기준8에 MMP 활동을 결정 하는 내부 제어로 신진 대사 활동을 정규화 되어 있다. 2 x 106 셀/mL (그림 4D) 보다 큰 시드 밀도에서 MMP 활동에 상당한 차이가 결과 시드 밀도 걸쳐 신진 대사 활동에 MMP 활동을 정상화. 각 접시 (내부 플레이트 가변성)에 triplicates 사이 가변성을 결정 하려면 편차 백분율 (%CV)의 계수 MMP와 신진 대사 활동에 대 한 계산 하 고 표 2에 요약. 20% % 이력서 triplicates 내의 내부 플레이트 가변성 일관 된 결과20,21을 생산 하는 시스템에 대 한 허용 임을 나타냅니다.
그림 1 : MMP 분해 펩 티 드 디자인 fluorogenic. Fluorogenic MMP 분해 펩 티 드 등뼈 펩 티 드 GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C의 구성 (↓ 나타냅니다 분열 사이트) 센서의 특이성을 결정 하는. 펩 티 드를 끄는 (dabcyl)와 담금질 이다 fluorophore (fluorescein), 표시 (fluoresces) 때 백본 펩타이드는 MMP에 의해 죽 습. Thiol 그룹은 못 분자에 norbornene 기능 그룹과 공유 반응 수 있도록 백본 펩 티 드에 활용 된 센서는 히드로에 커플링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 회로도 분석. 하이드로 겔 전조 솔루션 구성 요소는 PBS에 세포와 혼합 됩니다. 선구자 솔루션은 다음 검은색으로 pipetted, 하단, 96-잘 접시 라운드 3 분 분석 결과 대 한 자외선에 노출에 의해 미디어 추가 되 고 플레이트는 18 h (37 ° C, 5% CO2)에 대 한 알을 품을 생산. 신진 대사 활동 시 약 resazurin, 추가 하 고 접시 추가 6 h. MMP에 대 한 알을 품는 신진 대사 활동 잘 검색 프로토콜 표시 여기/방출 파장에서 형광 microplate 리더를 사용 하 여 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 동적 및 분석 결과의 범위. Fluorogenic MMP 분해 펩타이드와 기능성된 Hydrogels 37 ° C와 형광 강도에서 24 h에 대 한 측정은 콜라 효소 종류의 농도의 범위와 incubated 했다. 점선은 역동적이 고 작업 범위를 나타냅니다. n = 3, ± 표준 편차 (SD)를 의미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 흑색 종 세포 라인 A375 MMP 활동의 밀도 뿌리기의 효과. (A) A375 셀 라인 시드 밀도의 범위 캡슐화에 대 한 MMP 활동의 측정 (0 h) 초기. n = 3 평균 ± sd. (B) 측정 콜라의 24 h. 0, 10와 1000 µ g/mL에서 MMP 활동의 파선으로 표시 됩니다. 점선 라인 콜라 컨트롤에서 계산 작업 범위를 (WR)을 나타냅니다. n = 3, 시드 밀도의 범위 24 h에 대 한 캡슐화와 6 h. n resazurin incubated A375 셀 라인에 대 한 ± sd. (C) 측정 신진 대사 활동의 의미 = 3, ± sd. (D) 의미 A375 MMP 활동 대사 활동으로 정규화. n = 3, ± sd. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 히드로 전조 솔루션 준비.
표 2: A375 셀 라인 분석 결과의 내부 판 %CV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3 차원 생체 외에서 세포 배양이 vivo에서 환경의 많은 중요 한 측면. 그러나, 3D 문화 또한 사정 세포 기능을 만들고 도전 신호, 많은 생물학 분석 실험 필요 셀룰러 검색 및 셀의 큰 숫자. 따라서, 개발 추가 샘플 없이 세포질 기능의 측정을 가능 하 게 간단한 3D 문화 시스템의 처리 크게 증가 시킬 것입니다 3D 문화 시스템의 유틸리티. 여기서 설명 하는 3D 시스템은 다양 한 다른 응용 프로그램에 대 한 적용할 수 있습니다. 다른 프로 테아 제를 감지 하는 fluorogenic 센서의 순서를 변경할 수 있습니다. 예를 들어, fluorogenic 쪼갤 센서 시퀀스 (GPQG↓IWGQK)는 MMP-1 죽 습 수 있습니다-2,-3,-7,-8, 및 9-, 이전 chemotherapeutics22에 대 한 응답 흑색 MMP 활동을 검출 하기 위하여 이용 되었다. PEG 하이드로 겔 시스템의 사용은 또한 기계적 성질, 분해성, 그리고 매트릭스 접착 moieties는 히드로 내를 포함 하 여 세포질 microenvironment의 정확한 독립 튜닝 수 있습니다. RGD이이 작품에 사용 하는 접착 분자 fibronectin 파생 시퀀스 이며 integrin 중재 접착을 가능 하 게 합니다. (RLD) 같은 다른 접착 분자 및 (IKVAV)는 fibrinogen에서 파생 되 고 각각 laminin integrin 수용 체의 활성화에 활용 될 수. 예를 들어 그것을 대동맥 판 막 병 중간 셀 (VIC), 대동맥 밸브 협 착 증15에 영향을 미칠 수 있습니다 신장 변경 변경 접착 분자 시연 했다. 하이드로 겔 crosslinker 시퀀스 하이드로 겔과는 하이드로 겔 내에서 캡슐화 된 세포 행동의 분해성을 제어할 수 있습니다. 예, 그것은 섬유 아 세포 확산 및 셀 확산 빠르게23 vivo에서치유 과정을 신속 하 게 수 있습니다 hydrogels 저하에 경작 하는 때 증가 했다 시연 했다. microenvironment의 기계적 특성 또한 세포 기능을 통제할 수 있다 그리고 하이드로 겔 강성 못 macromer, PEG 분자량 및 말뚝과 crosslinker 사이의 비율에 무기의 수를 변경 하 여 수정할 수 있습니다.
MMP 활동 셀 형식에 따라 다릅니다, 각 새로운 셀 형식에 대 한 되므로 여기에 설명 된 대로 캡슐화 밀도 최적화 실험을 수행 하는 것이 중요. 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 시드 밀도 셀에 직접 비례 했다. 그러나, 더 이상 시간에 형광 신호 고원 수, 따라서 분석 결과의 타이밍 할 수 사용자8최적화가. 특정 효소 센서 작업 범위 및 타이밍 분석 결과의 또한 영향을 미칠 수 있습니다. 다양 한 농도 이상 셀과 분해 효소 신호 범위 실험을 실시 하 여 분석 결과의 작업 범위를 확인할 수 있습니다. 낮은 (배경 잡음)의 효소 컨트롤 가능 설립 incubated 여러 셀 하이드로 겔 조건이 포함, 각 분석 결과 (0, 10와 1000 µ g/mL 여기 콜라의) 내에서 신호에 대 한 중간 및 높은 수준의. 이 세포에 의해 생성 하는 신호 분석 결과의 범위에 속하는의 표시를 제공 합니다. 이 분석 결과 또한 겹치는 여기와 여기에 사용 되는 신진 대사 활동 분석 결과 같은 방출 스펙트럼에 하지 않은 다른 형광 센서와 호환 MMP 활동 당 셀 단위로 계산 하는 내부 제어 보고 이전8 . MMP 활동 대사를 정규화 된 활동 시연 밀도 2 x 106 셀/mL, 거기 있는 그 이상 시드를 위한이 방법의 유효성 시드 밀도에서 큰 변화가 했다. 이 정규화 작업의 범위 내에서 MMP 활동 곡선 및 정규화 곡선의 선형 부분 내에서 적절 한 시드 밀도 식별 하기 위해 결정적 이다.
분석 결과 여러 목적에 적용할 수 있습니다, 하는 동안 몇 가지 제한 및 사용자는 hydrogels의 준비와 형광 신호 간섭에 관한 구체적으로 고려해 야 하는 중요 한 측면 있다. 첫째, 해야 합니다 주의 문화 미디어와 추가 치료의 선택이 겹치는 흡 광도 스펙트럼 또는 형광의 탐지를 방해할 수도 신호를 끄다 있는 불투명 함을 가질 수 있습니다. 페 놀 레드를 포함 하지 않는 문화 미디어를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 일부 약물 치료는 형광 (예를 들어, 독 소 루비), 또는 (예: 이드라) fluorophore의 여기/방출 스펙트럼과 겹치는 흡 광도 스펙트럼. 분석 결과의 성능에 영향을 미칠 수 있는 두 번째 측면은 히드로 준비. 히드로 전조 솔루션의 높은 점성 때문에 케어 하이드로 겔 솔루션 및 각 잘에서 불평등 fluorophore 콘텐츠 또는 히드로 솔루션 볼륨을 방지 하기 위해 주의 깊은 pipetting 방법을 철저 하 게 혼합 수 있도록 촬영을 해야 합니다. 미리 피 펫 팁의 일로 및 낮은 고정 팁을 사용 하 여 가변성을 줄일 수 있습니다. 하이드로 겔 준비의 또 다른 중요 한 측면은 히드로 모양 및 우물에 위치. 히드로 잘 시간과 더 적은 다양성15정확한 형광 측정을 균일 한 모양을의 중심으로 한다. 여기, 둥근 바닥 접시를 사용 하 여 모든 우물에 걸쳐 일관 되 게 각 잘와 준 구형 hydrogels의 생산에 피 펫 팁을 중심으로 에이즈.
3D 효소 분해성 하이드로 겔 시스템, 적응 하 여 최소한의 샘플 처리와 3D microenvironment에서 실시간 효소 및 대사 활동 정보를 검색할 수 있습니다. 또한, 합성 말뚝 하이드로 겔의 사용 자연스럽 게 파생 된 ECM hydrogels 관찰 일괄 배치 가변성을 감소 시킨다. 또한, 말뚝 hydrogels를 활용 하 여 화학 및 기계적 신호는 microenvironment의 향상 된 제어를 위한 hydrogels의의 조정 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 PEG 하이드로 겔 합 사진 시작 프로세스를 신속 하 고 고전적인 자연 ECM hydrogels 보다 높은 처리량 방법론에 순종 하는 (즉,., 콜라겐 또는 Matrigel)는 더 느리게 및 온도 민감한입니다. 이 빠르고, 사용자 제어 중 합 수 더 로봇을 이용한 액체 처리기를 사용 하 여 자동화 시스템의 확장-최대15다른 사람에 의해 증명으로.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 오하이오 암 연구 (OCR), 오,이 작품을 자금에 대 한 미국 킹 사우드 대학 (KSU), 리야드, 첫 번째 작가 후원을 위한 KSA 인정 하 고 싶습니다. 매트릭스 지원, 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI) 캠퍼스 화학 악기 센터 질량 분석 및 단백질의 도움으로 질량 분석을 사용 하 여 형광 펩 티 드 센서의 분자량 측정 오하이오 주립 대학에서 시설입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M.
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
