Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Måling av Global mobilnettet matrise Metalloproteinase og metabolsk aktivitet i 3D Hydrogels

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/59123
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Summary

Her, en protokoll er presentert for innkapsling og dyrking celler i poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized med en fluorogenic matrise metalloproteinase (MMP)-nedbrytbare peptid. Mobilnettet MMP og metabolsk aktivitet måles direkte fra hydrogel kulturer likner en standard microplate.

Abstract

Tredimensjonale (3D) celle kultur systemer recapitulate ofte nærmere i vivo mobilnettet svar og funksjoner enn tradisjonelle todimensjonal (2D) kultur systemer. Men er måling av celle-funksjonen i 3D kultur ofte mer utfordrende. Mange biologiske metoder krever henting av mobilnettet materiale som kan være vanskelig i 3D kulturer. En måte å ta denne utfordringen er å utvikle nye materialer at måling av celle-funksjonen i materialet. Her vises en metode for måling av mobilnettet matrise metalloproteinase (MMP) aktivitet i 3D hydrogels i 96-brønnen format. I dette systemet, er en poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel functionalized med en fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP aktivitet er proporsjonal med fluorescens intensitet og kan måles med en standard microplate leseren. Miniatyrisering av denne analysen til en 96-brønns format redusert tiden det tar for eksperimentell satt opp av 50% og reagens behandling med 80% per betingelse i forhold til forrige 24-vel versjon av analysen. Denne analysen er også kompatibel med andre målinger av cellulære funksjoner. For eksempel er en metabolsk aktivitet analysen vist her, som kan utføres samtidig med MMP aktivitet mål i den samme hydrogel. Analysen er demonstrert med menneskelige melanom celler innkapslet i en rekke celle seeding tettheter for å bestemme riktig innkapsling tettheten for arbeidsområdet til analysen. Etter 24 timer for cellen innkapsling var MMP og metabolsk aktivitet readouts proporsjonal med cellen seeding tetthet. Mens analysen er vist her med en fluorogenic nedbrytbart substrat, kan analysen og metodikk være tilpasset for en lang rekke hydrogel systemer og andre fluorescerende sensorer. Slike en analysen gir en praktisk, effektiv og lett tilgjengelig 3D culturing plattform for en rekke applikasjoner.

Introduction

Tredimensjonale (3D) kultur systemer ofte nærmere recapitulate i vivo mobilnettet svar enn tradisjonelle todimensjonal (2D) kultur systemer, se flere utmerkede publikasjoner1,2,3 . Men utnytte 3D kultur systemene for å måle celle-funksjonen har vært utfordrende på grunn av vanskeligheten av mobilnettet henting og ytterligere prøve behandling. Dette problemet begrenser måling av mange cellulære funksjoner i 3D kultur systemer. Å overkomme dette problemet, nye teknikker er nødvendig som muliggjør enkel måling av celle-funksjonen i 3D-miljøer. En måte å løse dette behovet er utvikling av materialer som ikke bare støtter 3D cellekultur, men også innlemme sensorer for å måle celle-funksjonen. For eksempel har flere hydrogel systemer innarbeidet fluorogenic protease cleavable moieties for å aktivere visualisering av protease aktivitet innenfor 3D-miljøer4,5,6,7. Mens disse systemene ble opprinnelig brukt til mikroskopiske bildebehandling, kan disse systemene også være tilpasset for bruk i en global matrise metalloproteinase (MMP) aktivitet analysen bruker en standard plate reader, aktivere lettvinte måling av en celle-funksjonen i en 3D miljø8.

MMPs, en gruppe av sink proteaser, spiller viktige roller i normalt vev homeostase og mange sykdommer. MMPs fornedre og renovere ekstracellulær matrix (EFM), holde seg til celleoverflaten reseptorer og cytokiner og aktivere andre MMPs9,10. MMPs spille viktige roller i fysiologiske prosesser som sårheling og sykdommer som leddgikt, åreforkalkning, Alzheimers og kreft (se anmeldelser i 9,10,11). I Krepsen, er høye MMP uttrykk nivåer sterkt korrelert med kreft metastasering og dårlig prognose12. Videre bidra MMPs til svulst progresjon ved å fremme kreft cellen invasjonen og migrering cellulære prosesser som iboende 3D fenomener13,14. Derfor er det mye interesse muligheten til å måle MMP aktivitet i 3D kultur i mange sammenhenger, inkludert grunnleggende biologiske studier og narkotikarelaterte screening analyser.

PEG hydrogels er mye brukt for 3D cellekultur på grunn av deres høyt vanninnhold, motstand mot protein adsorpsjon og tunable natur. PEG hydrogels har vært functionalized med en rekke moieties til direkte celle-funksjonen, som med ECM mimetic peptider som RGD, RLD og IKVAV lette celleadhesjon eller direkte deling av vekstfaktorer som omforming vekst faktor-β (TGF-β) 15,16. Flere nylig, PEG hydrogels har vært functionalized med sensor peptider som aktiverer måling av celle-funksjonen som med5,8. Spesielt bruk av en PEG hydrogel system functionalized med en fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid aktivert måling av mobilnettet MMP aktivitet i 3D kulturer med en standard plate leseren og kreves ingen ytterligere behandling. Disse systemene er også kompatibel med andre målinger av cellulære funksjoner, inkludert metabolsk aktivitet. Her, er en protokoll beskrevet for måling av MMP aktiviteten til cellene kultivert i en 3D PEG hydrogel functionalized med en fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid og resultatene presentert demonstrere den første optimalisering eksperimenter nødvendig for bruk av denne analysen. Menneskelige melanom celler (A375) var innkapslet i den fluorogenic hydrogels over en rekke seeding tettheter for å finne de riktige seeding tettheter i arbeidsgruppen sortiment av analysen. Etter 24 timer for innkapsling, ble MMP og metabolsk aktivitet målt bruk en standard microplate leser. Deretter var MMP aktivitet normalisert metabolsk aktivitet å avgjøre de seeding tettheter innen lineær analysen. Til slutt, intra-plate koeffisient av variasjon prosenter (CV %) ble beregnet mellom triplicates å reflektere reproduserbarhet fått resultatene. Denne metoden kan enkelt og raskt 3D cellekultur og enkel måling av protease aktivitet med minimal prøve behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogel komponenter forberedelse

  1. Syntetisere fluorescerende protease-nedbrytbar peptidene som beskrevet andre steder8, fluorescein som fluorescerende molekylet og dabcyl som avsluttes. Oppløse peptid i DMSO til en konsentrasjon av 10 mM og oppbevar i en-80 ° C fryseren i liten (~ 30 µL) dele å unngå gjentatte fryse-Tin sykluser.
    Merk: Disse peptider kan også kjøpes kommersielt. Denne protokollen krever en C-terminalen cystein i peptid sekvensen aktivere kovalente inkorporering hydrogel polymer nettverket.
  2. Forberede 8 arm 40 kDa poly (etylenglykol) Amin (PEG)-norbornene (NB) som beskrevet17. Kontroller slutten gruppen functionalization på mer enn 90% bruker 1H-NMR. Oppløse PEG-NB i sterilt fosfat buffer saltvann (PBS) på 25% w/v og oppbevar i fryseren-80 ° C i (~ 300 µL) dele.
    Merk: Pinne functionalized med norbornene kan også kjøpes kommersielt.
  3. Syntetisere Foto-initiatoren litium fenyl 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) som beskrevet andre steder18. Oppløse runde i sterilt vann til en konsentrasjon av 68 mM og lagre i-80 ° C fryser i (~ 300 µL) dele.
    Merk: som et alternativ, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kan brukes som bilde-initiatoren. FANGET og Irgacure kan kjøpes kommersielt.
  4. Oppløse den MMP-nedbrytbar peptid-crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) og celle vedheft peptid (CRGDS) i sterilt vann til en konsentrasjon av 200 mM og 100 mM henholdsvis, og lagre dem i en-80 ° C fryser i (~ 300 µL og ~ 30 µL) dele, henholdsvis.

2. analysen media forberedelse

  1. Forberede den inaktivert, trekull strippet fosterets bovin serum (FBS) for MMP analysen:
    Merk: Proteaser i FBS kan produsere et høye signal med MMP analysen; Derfor er det anbefalt å varme-deaktivere og trekull stripe FBS analysen Media.
    1. Deaktiver 100 mL FBS ved å varme i 30 min på 55 ° C.
      Merk: 100 mL FBS ble benyttet her for aliquoting og lagring på 20 ° C for fremtidig bruk. Mindre volumer kan brukes etter behov.
    2. Legge til 0,25% w/v aktivt kull og 0.025% w/v av dekstran i en liten mengde FBS (ca 5 mL) og rør til en slurry er dannet. Deretter tilsett resten av FBS og røre i 30 min på 55 ° C.
    3. Sentrifuge 1,962 x g for 20 min på 4 ° C. Deretter overføre nedbryting til et annet fartøy.
    4. Gjenta trinn 2.1.2 men på 37 ° C etterfulgt av trinn 2.1.3. Sterilisere nedbryting bruker en 0,45 µm og deretter en 0,2 µm filter.
  2. Forberede analysen medier ved hjelp av medier med 1% kull strippet FBS, 2 mM L-glutamin, 10 U/mL penicillin, 10 µg/mL streptomycin.
    Merk: Media uten fenol red anbefales fordi den har mindre fluorescens interferens. Andre tillegg til analysen media som insulin, vekstfaktorer, etc. kan legges så lenge absorbansen og fluorescens spektrum topper ikke overlapper med sensoren (494 nm/521 nm).
  3. Fortynne bakteriell collagenase enzym skriver jeg ved 10 og 1000 µg/mL i analysen media som en positiv.

3. Hydrogel forberedelse og celle innkapsling

  1. Forberede hydrogel forløper løsningen.
    1. Legge til reagenser til 1,5 mL tube i følgende rekkefølge, vortexing etter hver komponent: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-nedbrytbar peptid, gjennomsnitt 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM runde, og 0,25 mM fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid.
      Merk: Tabell 1 viser hydrogel forløper løsning innholdet, lager konsentrasjoner, arbeider konsentrasjoner, beregningsformler for volum og nødvendige volumer trengs for å gjøre 120 µL av hydrogel forløper løsning, som er tilstrekkelig til å gjennomføre en eksperimentere med 10 hydrogels. Kontoen for tap av hydrogel løsningen på grunn av pipettering, øke det totale volumet med 20%. Kommersielle peptidene leveres ofte i en syrlig Hydrogenklorid; Derfor legges NaOH for å oppnå en siste pH på 7. pH i den endelige løsningen skal bekreftes av brukeren.
    2. Dele hydrogel forløper løsningen i flere 1,5 mL rør, en tube per betingelse blir testet.
      Merk: Flere kontroll forhold der hydrogels er utarbeidet uten tilsetning av celler, foreslås. For en negativ kontroll til ikke-spesifikk nedbrytning av fluorogenic sensoren, kan en hydrogel tilstand være inkubert med kontrollen kjøretøy eller eksperimentelle media alene hvis det er ingen behandling forhold. En positiv kontroll og kalibrering mellom eksperimenter, kan hydrogels være inkubert med en protease kjent deler fluorogenic sensoren. For eksempel ble to konsentrasjoner av bakteriell collagenase brukt her.
  2. Innkapsle celler i hydrogels.
    1. Forberede en enkeltcelle suspensjon som passer til cellen brukes. For eksempel vaske en 10 cm rett A375 melanom celler med 10 mL PBS. Trypsinize celler med 0,05% trypsin og ruge på 37 ° C og 5% CO2 til 3 min. telle celler med en hemocytometer å finne nummeret for total-cellen.
    2. Sentrifuge celle løsningen på 314 x g for 3 min, Sug opp kultur medier, og å suspendere celler i PBS på ca tre ganger den høyeste nødvendige seeding tettheten for eksperimentet. For eksempel ble en celle hjuloppheng med en tetthet av 21 x 106 celler brukt her for å oppnå en siste innkapslede tetthet av 7 x 106 celler/mL.
    3. Telle celler igjen for å sikre en nøyaktig celle konsentrasjon.
    4. Legge til suspendert celler og PBS hver tube hydrogel forløper løsning etter nødvendige seeding tetthet (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 x 106 celler/mL i dette eksemplet). Legge til PBS forhold med noen celler i stedet for suspendert celler.
      Merk: Alle forhold bør ha samme endelige hydrogel forløper løsning volum å sikre forholdet mellom hydrogel komponentene og PBS er konstant. Gjør ikke vortex rør som har celler, Pipetter opp og ned kraftig uten bobler for å blande forløper løsningen.
    5. Dispensere 10 µL av hydrogel forløper løsningen i et sterilt svart rundt 96-brønns bunnplaten, sikre at spissen er sentrert i midten av hver brønn mens dispensing.
    6. Danner hydrogel forløper løsning ved å utsette platen til ultra violet (UV) lys på 4 mW/cm2 til 3 minutter.
      Merk: UV-lampen (UVL-56 håndholdte UV-lampe, UVP, høyereliggende, CA) gir UV-A lys på en lang UV bølgelengde (365 nm), som påvirker ikke mobilnettet levedyktighet.
    7. Legge til 150 µL av analysen media i alle brønnene bortsett fra positiv kontroll vilkårene uten innkapslede celler. Positiv kontrollene, legge 150 µL collagenase enzym løsning.
    8. Legge til 150 µL av PBS ytre brønnene av plate å redusere fordampning under inkubasjon.

4. MMP og metabolsk Aktivitetemåling

  1. Måle fluorescens umiddelbart etter innkapsling å etablere en planlagt fluorescens måling og sikre ensartethet i hydrogel polymerisasjon. Lese platen med en fluorescens microplate skanne leseren bruker en ugjennomsiktig 96-brønns plate protokoll med et areal innstillingen 494 nm/521 nm (eksitasjon/utslipp). Dette vil være 0 h Les.
  2. Inkuber platen i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2 18 h.
  3. Legge metabolsk aktivitet reagens (resazurin) på 1:10 (v/v) for hver brønn.
  4. Inkuber platen i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2 for en ytterligere 6 h.
    Merk: Denne inkubasjon kan variere avhengig av celle type.
  5. Måle fluorescens på 24 timer etter innkapsling. Lese platen med en fluorescens microplate skanne leseren bruker en ugjennomsiktig 96-brønns plate protokoll med et areal innstillingen 494 nm/521 nm (eksitasjon/utslipp) for MMP aktivitet og 560 nm/590 nm (eksitasjon/utslipp) for metabolsk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gjeldende analysen var tilpasset fra en tidligere utviklet og preget 3D hydrogel kultur-systemet functionalized med en fluorogenic MMP cleavable sensor8. Fluorogenic MMP sensoren her består av et peptid sekvens, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ angir webområdet cleavage) som tidligere var optimalisert for spalting av MMP-14 og MMP-11-19. Peptid er merket med et fluorescerende molekyl (fluorescein) og en avsluttes molekyl (dabcyl) på hver side av webområdet cleavage (figur 1). Ved eksponering av fluorogenic sensor til den aktuelle protease, fluorophore og avsluttes skilles, og fluorescens øker. Her var analysen miniatyrisert fra en 24-vel plate til en 96-brønns plate format, eliminerer flere trinn i innkapsling prosessen og redusere tiden det tar å utføre et eksperiment med 50%. Videre, det redusert volumet av reagenser fortært av 80%, som hydrogel volumer ble redusert fra 50 µL til 10 µL per brønn. Videre bruker en 96-brønns plate, kunne 20 forhold i triplicates bli testet i stedet for 12 forholdene duplikater per 24-vel plate. En skjematisk av cellen innkapsling prosessen er illustrert i figur 2. Etikett 1 og 2 tilsvarer trinn 3.1 og 3.2 i protokollen, henholdsvis. Etiketter 3 til 5 tilsvarer trinnene 3.2.5 til 3.2.7 i protokollen. Etiketter 6 til 9 tilsvarer trinnene 4.2 til 4,5 i protokollen.

Å etablere oppdagelsen grensene og signalene til analysen, ble hydrogels functionalized med fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid inkubert med en rekke konsentrasjoner (0 til 2000 µg/mL) av bakteriell collagenase enzym type jeg. Etter 24 timer med inkubering på 37 ° C, ble en plate leser brukt til å måle fluorescens (Figur 3). Fra disse målingene, dynamisk (lavest og høyest oppdaget signaler) og arbeidsområdet (3 standardavvik over laveste oppdaget signalet) og 3 standardavvik under høyeste oppdaget signal ble bestemt. Etter 24 timer med inkubering, ble det observert at laveste oppdaget signalet ble produsert av negative kontroller (bakgrunnsstøy) på 0 µg/mL collagenase, mens den høyeste oppdaget signal ble produsert av 1000 µg/mL collagenase eller ovenfor, der signalet begynner å platået (Figur 3). Fra det dynamiske området beregnet arbeidsgruppen sortiment til mellom ≈0.16 µg/mL og ≈474 µg/mL collagenase, et bredt signalrekkevidde over tre størrelsesordener.

For celle kultur analyser, må den aktuelle celle tettheten som resulterer i fluorescens målinger innen arbeider analysen bestemmes for hver celle. Her, presenteres representant data for melanom celle linjen A375, innkapslet i en rekke tettheter fra 0,25 til 7 x 106 celler/mL. Fluorescens intensitet overtatt bruker en standard microplate leser på to ulike tidspunkt: 1) rett etter innkapsling (0 h) og 2) etter 24 timer for innkapsling. På 0 h var fluorescens opplesninger lave over seeding tettheter (Figur 4A), som forventet. Etter 24 h kultur (Figur 4B) var MMP aktivitet direkte proporsjonal med seeding tetthet, der flere celler resulterte i flere spalting av fluorogenic MMP cleavable sensoren og høyere fluorescens intensitet. Som interne kontroller, hydrogels inneholder ingen celler ble inkubert med 0, type 10, og 1000 µg/mL av collagenase I-enzym å angi lavt, middels og høye nivåer av henholdsvis (som bestemmes av collagenase signal området karakterisering i Figur 3) og representert av stiplede linjer i Figur 4B. Videre ble arbeider utvalg grensene beregnet fra 0 og 1000 µg/mL signaler og vises som stiplede linjer i Figur 4B. Seeding tettheter på eller større enn 1 x 106 celler/mL innenfor grensene for arbeidsgruppen sortiment. Metabolsk aktivitet målinger av A375 celle linjen var også direkte proporsjonal med cellen seeding tetthet (Figur 4C). Tidligere har MMP aktivitet blitt normalisert metabolsk aktivitet som en intern kontroll å bestemme MMP aktivitet per celle-basis8. Normalisere MMP aktivitet til metabolsk aktivitet over seeding tettheter resulterte i ingen signifikant forskjell i MMP aktivitet på seeding tettheter større enn 2 x 106 celler/mL (Figur 4D). For å bestemme variasjon mellom triplicates i hver plate (intra-plate variasjon), koeffisient av variasjon prosentandel (CV %) ble beregnet for både MMP og metabolsk aktivitet og summeres i tabell 2. % CV under 20% angir at intra-plate variasjon innen triplicates er akseptabelt for systemet å produsere konsistente resultater20,21.

Figure 1
Figur 1 : Fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid design. Fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid består av en ryggrad peptid GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ angir webområdet cleavage) som bestemmer spesifisiteten av sensoren. Peptid er merket med en avsluttes (dabcyl) og en fluorophore (fluorescein), som er unquenched (fluoresces) når ryggraden peptid er kløyvde av MMP. En thiol gruppe er konjugert til ryggraden peptid aktivere kovalente reaksjon med norbornene funksjonelle grupper i PEG molekylet, koble sensoren til hydrogel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Analysen skjematisk. Hydrogel forløper løsningskomponentene er blandet med celler suspendert i PBS. Forløperen løsningen er deretter pipetted til svart, rundt bunnen, 96-brønns plater og polymerized av eksponering for UV-lys for 3 min. analysen mediefil legges, og plater er ruges i 18 h (37 ° C, 5% CO2). Metabolsk aktivitet reagens resazurin legges deretter, og plater er ruges for en ytterligere 6 h. MMP og metabolsk aktivitet er målt bruk en fluorescerende microplate leser med en godt skanning-protokollen på de angitte eksitasjon/utslipp bølgelengdene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Dynamisk og arbeidsområdet til analysen. Hydrogels functionalized med fluorogenic MMP-nedbrytbar peptid ble inkubert med en rekke konsentrasjoner av collagenase enzym type jeg 24 h 37 ° C og fluorescens intensitet ble målt. Prikkete representere dynamisk og arbeider. n = 3, mener ± standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Effekten av seeding tettheten av melanom celle linje A375 MMP aktivitet. (A) første måling (0 h) av MMP aktivitet for A375 celle linje innkapslet over en rekke seeding tettheter. n = 3 gjennomsnittlig ± SD. (B) måling av MMP aktivitet på 24 h. 0, 10 og 1000 µg/mL collagenase representeres av stiplede linjer. Prikkete linjene representerer arbeidsområdet (WR) beregnet fra collagenase kontroller. n = 3, mener ± SD. (C) Measurement metabolsk aktivitet for A375 celle linje innkapslet for 24 timer over en rekke seeding tettheter, og inkubert med resazurin 6 h. n = 3, mener ± SD. (D) A375 MMP aktivitet normalisert metabolsk aktivitet. n = 3, mener ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Table 1
Tabell 1: Hydrogel forløper løsning forberedelse.

Table 2
Tabell 2: Intra-plate % CV til analysen med A375 cellen linje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D i vitro cellekultur viser mange viktige aspekter av i vivo miljøet. Men 3D kultur gjør også vurdering celle funksjon og signalnettverk utfordrende, så mange biologiske metoder krever mobilnettet henting og stort antall celler. Derfor utviklingen av et enkelt 3D kultur system som gjør måling av cellulære funksjoner uten ytterligere eksempel behandling ville øke nytten av 3D kultur systemer. 3D systemet beskrevet her kan tilpasses for en rekke forskjellige programmer. En rekke fluorogenic sensoren kan endres for å oppdage andre proteaser. For eksempel fluorogenic cleavable sensor sekvensen (GPQG↓IWGQK) som kan være kløyvde av MMP-1-2 -3, -7,-8 og-9, ble tidligere benyttet for å oppdage melanom MMP aktivitet chemotherapeutics22svar. Bruk av PEG hydrogel systemet kan også nøyaktig uavhengig tuning av mobilnettet microenvironment, inkludert de mekaniske egenskapene, nedbrytbarhet og matrix vedheft moieties innen hydrogel. Heft molekylet RGD brukt i dette arbeidet er en fibronectin-avledet sekvens og gir integrin-mediert vedheft. Andre vedheft molekyler som (RLD) og (IKVAV) som er avledet fra fibrinogen og laminin henholdsvis kan utnyttes for å aktivere andre typer integrin reseptorer. For eksempel ble det vist at endre vedheft molekyler endret forlengelse av aorta Valvulær interstitielle cellene (VIC), som kan ha en effekt på Aortaklaff stenose15. Hydrogel crosslinker sekvensen kan kontrollere nedbrytbarhet hydrogel og innkapslet mobilnettet atferd innenfor hydrogel. For eksempel ble det vist at fibroblaster hadde økt spredning og celle spredning når kultivert i raskere nedverdigende hydrogels, som kan fremskynde helbredelse prosessen i vivo23. Mekaniske egenskaper av microenvironment kan også regulere celle funksjon og hydrogel stivhet kan endres ved å endre antall armene i PEG-macromer, PEG molekylvekt og forholdet mellom pinne og crosslinker.

Siden MMP aktivitet varierer fra celle type, for hver ny cellen er det viktig å gjennomføre et optimeringseksperiment innkapsling tetthet som vist her. Etter 24 timer for innkapsling var MMP og metabolsk aktivitet direkte proporsjonal med celle seeding tetthet. Men på lengre tid fluorescerende signalet kan platået, må derfor tidspunktet for analysen optimaliseres ved de bruker8. Bestemt protease sensoren kan også påvirke arbeidsområdet og tidspunktet for analysen. Arbeidsgruppen sortiment av analysen kan bestemmes ved å gjennomføre et signal området eksperiment med noen celler og et proteolytisk enzym over en bred konsentrasjon. Inkludering av flere ingen celle hydrogel forhold inkubert med enzym kontroller muliggjør etablering av lav (bakgrunnsstøy), middels og høy grad av signalet i hver analysen (0, 10 og 1000 µg/mL av collagenase her). Dette gir en indikasjon på hvor signalene produsert av celler innenfor arbeidsområdet til analysen. Denne analysen er også kompatibel med andre fluorescerende sensorer som ikke har overlappende eksitasjon og utslipp spectra, som metabolsk aktivitet analysen brukes her som en intern kontroll beregne MMP aktivitet per celle-basis, som tidligere rapportert8 . MMP aktivitet normalisert til metabolsk aktivitet vist gyldigheten av denne tilnærmingen for såing tettheter på eller over 2 x 106 celler/mL, der det var ingen betydelig endring over seeding tettheter. Denne normalisering er avgjørende for å identifisere de aktuelle seeding tettheter som arbeidsgruppen sortiment av MMP aktivitet kurven og lineær delen av normalisering kurven.

Mens analysen kan tilpasses for flere formål, er det flere begrensninger og viktige sider brukeren bør vurdere, spesielt om interferens med fluorescerende signalet og utarbeidelse av hydrogels. Først må være forsiktig med valg av kultur medier og flere behandlinger, som dette kan ha en overlappende absorbansen spekteret eller opaqueness som kan forstyrre påvisning av fluorescens eller slukke signalet. Det anbefales å bruke kultur medier som ikke inneholder fenol red. Også noen medikamentelle behandlinger er fluorescerende (f.eks doksorubicin), eller har absorbansen spektrum som overlapper med eksitasjon/utslipp spekteret av fluorophore (f.eks curcuminoids). En annen side som kan påvirke ytelsen til analysen er hydrogel utarbeidelse. På grunn av høy viskositet av hydrogel forløper løsningen må omsorg tas for å sikre grundig blanding av hydrogel løsningen og forsiktig pipettering praksis å hindre ulik fluorophore innhold eller hydrogel løsning volum i hver brønn. Pre fukting av pipette-spisser og bruke lav-oppbevaring tips kan hjelpe redusere variasjonen. En annen viktig aspekt av hydrogel forberedelse er hydrogel form og plassering i brønner. Hydrogel skal være sentrert i brønnen og en uniform figur aktivere nøyaktig fluorescens målinger med mindre variasjon15. Her, hjelpemidler bruk av runde bunnplater i sentrering pipette tipset i hver brønn og produksjon av semi sfærisk hydrogels konsekvent på tvers av alle brønnene.

Ved å tilpasse 3D protease-nedbrytbar hydrogel systemet, kan sanntid protease og metabolsk aktivitet readouts oppdages i en 3D microenvironment med minimal prøve behandling. I tillegg reduserer bruken av syntetiske PEG hydrogel parti til parti variasjon observert med naturlig ECM hydrogels. Videre utnytte PEG hydrogels kan finjustering av kjemisk og mekanisk signaler av hydrogels for en bedre kontroll over microenvironment. Videre PEG hydrogel polymerisasjon beskrevet her er en foto-initiert prosess, gjør det raskt og mer mottakelig for høy gjennomstrømning metoder enn klassisk naturlig ECM hydrogels (i.e., kollagen eller Matrigel), som er langsommere og ømfintlig. Denne rask, brukerstyrt polymerisasjon lar skalering-up av systemet for å ytterligere automatisert benytter robot flytende handlers, som demonstrert av andre15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA for finansiering dette arbeidet samt King Saud University (KSU), Riyadh, KSA for å sponse den første forfatteren. Molekylvekt av fluorescerende peptid sensoren ble målt ved hjelp av matrix assistert, laser desorpsjon-ionisering, tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri med hjelp fra Campus kjemiske Instrument Center massespektrometri og Proteomikk Anlegget ved Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
Activated charcoal  Sigma-Aldrich C3345
Black round bottom 96-well plate Brand-Tech 89093-600
Cell adhesion peptide (CRGDS) GenScript USA Inc. custom made
Collagenase enzyme type I  Life Technologies 17100-017
Dextran Sigma-Aldrich D4876
DMEM High Glucose Media Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum (FBS)  Seradigm 1500-500
Fluorescence microplate reader  BioTek Cytation 3
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
L-glutamine Life Technologies 25030-081
MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) GenScript USA Inc. custom made
NaOH Fisher Scientific S318500
Penicillin /streptomycin Life Technologies 15140-122
Resazurin (Alamar Blue) Life Technologies DAL1100
UV light  UVP 95-0006-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Tags

Bioteknologi problemet 143 Hydrogels 3D celle innkapsling Matrix Metalloproteinases metabolsk aktivitet melanom fluorescens
Måling av Global mobilnettet matrise Metalloproteinase og metabolsk aktivitet i 3D Hydrogels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fakhouri, A. S., Leight, J. L.… More

Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter