Summary
Здесь мы представляем протокол изолировать дендритные клетки из мышиных селезенки магнитные ячейку Сортировка и последующих приемных передачи в наивной мышей. Чтобы объяснить шаг за шагом процедуры приемных передачи и проточной цитометрии была выбрана модель высоким соли активированные дендритных клеток.
Abstract
Избыток соли рацион способствует воспаление и играет жизненно важную роль в развитии артериальной гипертензии. Ранее мы обнаружили, что антиген представляя дендритных клеток (DCs) может смысле повышенных внеклеточного натрия приводит к активации NADPH оксидаза и формирование isolevuglandin (IsoLG)-аддуктов протеин. Эти IsoLG белка аддукты реагируют с self белки и поощрения государственных аутоиммунных как и гипертонии. Мы разработали и оптимизированы-современных методов для изучения функции DC в гипертензии. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для изоляции, в vitro лечение с повышенными натрия и приемных передачи мышиных селезеночной CD11c+ клеток в получателей мышей, чтобы изучить их роль в гипертензии.
Introduction
Избыток пищевой соли является одним из основных факторов риска гипертонии. 1 , 2 американской ассоциации сердца рекомендует более 2300 миллиграммов (мг) потребления натрия (Na+) в день, однако; менее 10% населения США отмечает эту рекомендацию. 3 , 4 скромные сокращения потребления Na+ снизить кровяное давление и уменьшить ежегодный новых случаев ишемической болезни сердца и инсульта в США на 20%. 5 основная проблема избыточного потребления поваренной соли является, что 50% из населенности гипертонической exhibits соли чувствительность, определяется как 10 мм ртутного столба, увеличение артериального давления после загрузки Na+ или же падение артериального давления после Na+ ограничения и диурез. 6 соли чувствительность также происходит в 25% нормотензивной лиц и является независимым предиктором смерти и сердечно-сосудистых событий. 7 , 8 соли зондирования механизмов с участием почечной гипертонии хорошо изучены; Однако последние исследования показывают, что иммунные клетки могут смысле Na+. 9 , 10
Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в экстра почечной Na+ обработка может вызвать накопление Na+ в интерстиции и содействовать воспаления. 11 , 12 нашей лаборатории и другие показали, что клетки врожденная и адаптивного иммунитета способствовать обострению гипертонии. 9 , 13 , 14 , 15 различных гипертонической стимулы, включая ангиотензина II, норадреналина и соли причиной макрофагов, моноцитов и лимфоцитов T для проникновения в почках и сосудистую и поощрения удержания Na+ , сужение сосудов, кровяное давление Высота над уровнем моря и конец орган ущерб. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 в предыдущих исследований, мы обнаружили, что DCs накапливать isolevuglandin (IsoLG)-белок аддукты в ответ на различные стимулы гипертонический, включая ангиотензина II и дока соль гипертонии. 14 IsoLGs Высокореактивная продуктов перекисного окисления липидов, которые быстро и ковалентно аддукт с lysines белков и их накопление связан с активацией DC. 14 недавно мы установили, что повышенные Na+ является мощным стимулом для IsoLG белка аддукт формирования в мышиных, которую DCs.9 Na+ вступления в DCs опосредуется через Амилорид чувствительных перевозчиков. Na+ затем обменять на кальция (Ca2 +) через ЦС2 + обменник Na+. CA2 + активирует протеинкиназы C (PKC) который активирует NADPH оксидаза, ведущих к увеличению супероксида (O2· -) и IsoLG белка аддукт формирования. 9 приемных передачи соли облученных DCs воспламеняет гипертензии в ответ к югу прессорных доза ангиотензина II. 9
Выявление CD11c+ РС из тканей ограничивалась ранее иммуногистохимии и RT-PCR и изоляции РС была ограничена ячейку Сортировка по проточной цитометрии. Хотя поток цитометрии сортировки клеток является мощный метод для изоляции иммунных клеток, он является дорогостоящим, требует много времени и приводит к низкой доходности жизнеспособных клеток. Таким образом, мы оптимизировали протокол шаг за шагом ткани пищеварение, в пробирке стимуляции и приемных передачи CD11c+ DCs для изучения гипертонии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Университет Вандербильта институциональный уход животных и использование Комитета утвердили описываемые процедуры. Мышей размещены и заботу в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных (национальных академий пресс. Пересмотренный 2010).
1. изоляция селезенки от мышей
- Подготовить 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 мм HEPES, пируват натрия 1 мм, 50 мкм β-меркаптоэтанол и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Усыпить 10 – 12 недель-старых самцов мышей C57bl/6 вдыханием CO2 . Спрей с груди и стороны мыши с 70% этиловом спирте. На левой стороне осторожно откройте брюшной полости подвергать селезенки и кожи.
- С помощью небольших щипцы, осторожно переместить в кишечнике и печени к левой стороне мыши и тонкой ножницами аккуратно акцизных селезенки.
Примечание: Этот шаг должен выполняться очень внимательно, как повреждение желудочно-кишечного тракта могут вызвать загрязнение. - Место каждого вырезан селезенки в обозначенные 15 мл конические трубка, содержащая 3 мл RPMI 1640 среды.
2. поколение одной клеточных суспензий из селезенки
Примечание: Селезенка может отделить в одну ячейку подвеска путем сочетания механических диссоциации плюс ферментативного пищеварения.
- Приготовляют раствор переваривания селезенки, добавив коллагеназы D (1 мг/мл; 0,29 U/мг лиофилизованный препарат) и DNase I (0,1 мг/мл) подготовил RPMI 1640 среднего (см. шаг 1.1)
- Используйте щипцы для передачи селезенки в C трубку (диссоциация трубка) содержащий 3 мл раствора переваривания селезенки.
-
Выполните механические диссоциации с использованием полуавтоматического гомогенизатор согласно инструкциям производителя.
- Место C трубу на полуавтоматических гомогенизатор, обеспечивая, что C трубка плотно помещается на вращающейся рукоятки. После установки C трубку, нажмите кнопку Пуск на полуавтоматических гомогенизатор для запуска селезенки 04.01 протокол для 60 s.
Примечание: Механические диссоциации может также выполняться путем размещения 40 мкм фильтр на вершине 50 мл Конические трубки и аккуратно шлифовка селезенки через фильтр. После шлифования селезенки, через промойте фильтр 40 мкм с 10 мл RPMI средств массовой информации.
- Место C трубу на полуавтоматических гомогенизатор, обеспечивая, что C трубка плотно помещается на вращающейся рукоятки. После установки C трубку, нажмите кнопку Пуск на полуавтоматических гомогенизатор для запуска селезенки 04.01 протокол для 60 s.
- После механической диссоциации отсоедините трубку от гомогенизатор и выполнять ферментативного пищеварения. Проинкубируйте образцы для 15 минут при 37 ° C под непрерывного вращения (20 мин).
- Перенести решение, дозирование в 50 мл Конические трубки после фильтрации через стрейнер 40 мкм. Промойте фильтр 40 мкм, с 10 мл Дульбекко в PBS (dPBS). Центрифуга клетки на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
- После центрифугирования аспирационная супернатант полностью и помыть лепешка, resuspending в 10 мл dPBS. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
3. изоляция CD11c+ РС от селезеночной одноклеточного подвеска
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл dPBS и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и Трипановый синий исключения.
- Пелле клетки центрифугированием при 300 x g, 10 мин при 4 ° C.
- Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 400 мкл магнитно-активируемые сортировки клеток (ПДК) буфера.
- 100 мкл CD11c микрошарики (см. Таблицу материалы) за 1 x 10-8 клеток.
- Вихревой суспензию клеток и проинкубируйте втечение 10 мин в холодильник на 4 ° C.
- Добавьте 10 мл буфера MACs для мытья клетки. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
- Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте в 500 мкл буфера MACs.
4. Магнитное разделение CD11c+ РСУ
Примечание: Магнитная сепарация делается вручную с магнитным сепаратором (см. Таблицу материалы) оснащен LS столбцы. Магнитная сепарация также может быть сделано автоматически с автоматизированной магнитный сепаратор. (см. Таблицу материалы).
- Место столбце LS в магнитном поле Маков сепаратор и 15 мл Конические трубки под каждого столбца для сбора потока через.
- Промойте LS столбца с 3 мл буфера.
- Место суспензию клеток на каждый столбец LS и собирать потока через содержащих немеченого клетки.
- Промойте колонку LS с 3 мл буфера MACs, собирая немеченого клетки, которые проходят через. Промойте колонку LS 2 раза.
- Удалите столбец LS из магнитного сепаратора. Добавить 5 мл MACs буфера для каждого столбца и немедленно промыть магнитно помечены клетки, твердо погружаясь LS столбца в чистой 15 мл Конические трубки.
Примечание: Это важно для выполнения двойной изоляции CD11c клеток для получения суспензии клеток высокой чистоты. Таким образом повторите шаги 3.1 через 4.5. и ссылку на Рисунок 4 для стандартов чистоты. Этот шаг улучшает чистоту CD11c+ клетки к 90 – 95%. -
Определить CD11c+ DC номер на Горяева, с помощью исключения Трипановый синий. Разбавьте образец клеток в разведении 1:1 в 0,4% раствор Трипановый синий.
Примечание: Non жизнеспособных клеток будет окрашенных синий, в то время как жизнеспособных клеток будет оставаться незапятнанной.- Чтобы сделать это, тщательно заполнить Горяева с 10 мкл ячейки выборки разрежения и инкубировать в течение 1 минуты.
- Подсчитать ячейки в 4 квадратов 1 x 1 мм2 в палате, которая была загружена для определения числа жизнеспособных клеток.
5. в Vitro высокой соль лечения CD11c+ РСУ
- Подготовить DC питательной среды путем добавления 10% FBS, 0,1 мм HEPES, пируват натрия 1 мм, 50 мкм β-меркаптоэтанол и 1% пенициллина/стрептомицина 500 mL 1640 RPMI.
- Подготовка 10 x DC высокой соли клетки культуры СМИ (400 мм), весом, 1,17 г NaCl и поместив его в стерильных 50 мл трубки сокола. Добавьте 50 мл стерильной DC клеток культуральных сред (подготовленных на шаге 5.1) 50 мл трубки сокола и вихревой пока NaCl в растворе.
- Сразу же фильтр высоких соли DC культуры средств массовой информации с использованием вакуумной фильтрации через фильтр 0.2 мкм в капюшоне культуры клеток.
- Центрифуга для каждой ячейки подвеска из селезенки в 300 x g 10 мин на 4ºС. Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в DC культуры средств массовой информации в концентрации 1 х 106 клеток/мл.
- Пипетка 900 мкл (приблизительно 1 х 106 клеток) DC подвески в 24-ну плоское дно Falcon пластины. Добавьте 100 мкл высокой соли DC культуры средств массовой информации в каждой скважины для окончательного натрия концентрации 190 мм. Ярлык пластину и место в 37 ° C гумифицированный CO2 инкубатора для 48 ч.
6. приемные передачи высоких соли лечить CD11c+ РСУ
- После экстракорпорального стимуляции для 48 ч удалить пластину от 37 ° C гумифицированный CO2 инкубатора.
- Пипетка клетки культуры СМИ вверх и вниз Ресуспензируйте CD11c+ РСУ. пипетки все CD11c+ DC подвеска в соответствующей пометкой 1,6 мл трубки. Повторите этот шаг для каждого человека хорошо покрытием.
- Центрифуга для каждого CD11c+ DC подвеска на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант. Ресуспензируйте DC лепешка с 100 мкл стерильные dPBS.
- Ничья DC подвеска в 1 мл шприц с иглой 27 G ½ дюйма.
- Место наивно 10 недельных C57bl/6 мышей-самцов под 2% изофлюрановая для достижения стабильного хирургические плоскости. Проверьте уровень анестезии с отсутствием педалей рефлекс. После того, как достигается стабильное хирургические плоскости, медленно и осторожно ввести иглу в ретро орбиталь пространство на угол около 30°.
Примечание: Скос иглы 27 G должен быть направлен вниз, от глаз, чтобы предотвратить глазные повреждения. - Медленно и плавно придать CD11c+ DC подвеска (приблизительно 1 х 106 клеток). После инъекции, осторожно удалите иглу для ретро орбитального пространства, сознавая не повредить глаза.
Примечание: После инъекции должно быть мало или нет кровотечения. Приемных передачи CD11c+ DCs также могут быть выполнены с использованием метода и.в. инъекции (например, хвост вен). Мышь управления получают CD11c+ РСУ, которые были культивировали в обычной соли СМИ. - Удаление мышей из носовой конус и контролировать их приблизительно 30 мин при восстановлении от анестезии.
7. подготовка 14 день низкодозированные ангиотензин II (140 нг/кг/мин)
- Подготовьте буфере ангиотензина II, добавив 500 мкл 5 М NaCl и 300 мкл уксусной кислоты. Квантовая Satis (QS) до 30 мл дейонизированной H20.
- Растворите ангиотензина II до 5 мг/мл Стоковый раствор с буфером ангиотензина II. Разбавьте ангиотензина II Стоковый раствор с дополнительного буфера для достижения конечной концентрации, таким образом, что осмотические minipump будет доставлять ангиотензина II в размере 140 нг/кг/мин в зависимости от веса каждой мыши.
Примечание: Основные ангиотензин II (мг) = (мышь, вес (г) x 0.2 мг / день x 14 дней) / 1000
Подготовлено ангиотензин II (мг) = (основные ангиотензина II x 260 мкл) / насос скорость (0,25 мкл/hr)
Объем запасов ангиотензин II (мкл) = подготовленных ангиотензина II / фондовый концентрации (5 мг/мл) x 1,000
Разбавляют объем (мкл) = 270 - ангиотензин II объем запасов - Добавить ангиотензина II объем запасов в разбавленной (ангиотензина II буфер) на основе томов, рассчитанные на шаге 7.2.
- Под капотом культуры стерильных клеток откройте осмотические minipump.
- Добавьте разбавленные ангиотензина II решения и изгнать воздух из шприца и иглы. Вставьте предоставленный иглы в нижней части осмотические minipump и медленно вводить ангиотензина II решения во время медленно и осторожно втягивания иглу из мочевого пузыря.
- Вставьте головку осмотические minipump осмотического мочевого пузыря полностью, обращая внимание, чтобы не получить любой воздух в мочевом пузыре.
8. Имплантация 14 день низкодозированные ангиотензина II осмотического Minipumps
- Через десять дней после приемных передачи CD11c+ РСУ, место мышей в изофлюрановая камере начать анестезии и затем переместить мышь на носовой конус непрерывно получать 2% изофлюрановая для достижения и поддержания надлежащих хирургических плоскости.
- Удаление мех вдоль спинной стороне шеи с Клипперс подготовить хирургической сайта. Чистота области побрился с 70% этиловом спирте, следуют Бетадин 7,5% до начала операции.
- Создайте небольшой разрез (примерно 1,5 см) в коже. Вставьте hemostats в разрез для создания подкожной карман для размещения осмотические minipump.
- Вставьте minipump в подкожной карман. Закройте кожи раны с 2-3 хирургические скобы и применить другое приложение 7,5% Бетадин в рану и скобы для предотвращения инфекции.
- Контроль мышей за 30 – 60 мин во время восстановления от анестезии перед возвращением их в их клетках.
Примечание: Мышь необходимо контролировать до 3 – 4 дня после имплантации осмотические minipump.
9. изоляция селезенки мышей получателей для анализа потока гранулярных
- После того, как 14 дней низкодозированные ангиотензина II настоя, изолировать селезенки от мышей, получение в пробирке высокой соли лечить DCs приемных переводом. Следуйте точные шаги, перечисленные выше (шаги 1 и 2).
10. поверхностные окрашивания
-
Передача splenocytes, высокомобильна в ПБС в полистирол СУИМ трубки и центрифуги на 350 x g 8 мин при 4 ° C. Аспирационная надосадке после центрифугирования. Мыть дважды с 1 мл буфера MACs и центрифугирования (350 x g, 8 мин, 4 ° C).
- Разделите splenocytes одинаково на разных полистирола СУИМ труб, основанный на количество потока гранулярных панелей желаемого.
- Чтобы выполнить Live/мертвые клетки жизнеспособности окрашивание, вымойте клетки с ПБС и центрифуги (350 x g, 8 мин, 4 ° C). Ресуспензируйте в 1 мл ПБС и 1 мкл жизнеспособность клеток пятна (см. таблицу материалов). Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C (холодильник или на льду) покрыты пленкой для защиты от света.
- Во время инкубации пятно жизнеспособность клеток приготовит коктейль антител на поверхности клеток, пятнать в соответствующий объем буфера MACS.
- Вымыть клетки с 1 мл раствора MACS буфера, центрифуги (350 x g, 8 мин., 4 ° C) и Ресуспензируйте Пелле каждой ячейки с 100 мкл антител коктейль. Инкубировать защищенный от света за 30 мин при 4 ° C.
Примечание: Каждое антитело цитометрии потока является уникальным, и весьма полезным и рекомендуется определить оптимальное количество антител, необходимых, выполняя кривой титрования дозы для каждого конкретного антитела. - Вымыть клетки дважды с 1 мл буфера MACS и Ресуспензируйте splenocytes в соответствующее количество MACS буфера для потока гранулярных анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 представляет собой схематическое изображение описанные выше меры. Изолированные мышиных селезенки сортируются для CD11c+ РСУ, магнитные ячейку Сортировка и покрытием в обычной соли СМИ (NS; 150 ммоль NaCl) или высокой соли СМИ (HS; 190 ммоль NaCl) за 48 ч. CD11c+ РСУ восприимчивую затем передаются ретро орбитального инъекции для наивного получателей мышей. Десять дней спустя, мышей имплантируются с осмотическим minipumps инфузионные низкодозированные ангиотензин II (140 нг/кг/мин) на 14 дней. В течение 14 дней настой ангиотензина II артериальное давление регистрируется по радио телеметрии или хвост манжета плетизмографии.
Представлен анализ типичных кровяного давления в рисунке 2 (изменение от Барбаро et al.9) после приемных передачи DCs и осмотического minipumps инфузионные низкодозированные ангиотензина II имплантации. Следует отметить, это низкая доза ангиотензин II (140 нг/кг/мин)-суб прессорных доза, которая не повышает кровяное давление в обычной мыши. Мышей, получение обычной соли лечение CD11c+ DCs (черные круги) поддерживать нормальное кровяное давление во время инфузии ангиотензина II, в то время как мыши получать высокие соль обработанной CD11c+ выставку DCs (красные круги) увеличение систолического артериального давления. Рисунок 2 показывает, что высокая соли лечить CD11c+ РСУ премьер гипертензии в ответ на суб прессорных доза ангиотензина II.
Чтобы определить чистоту изолированных CD11c+ клетки, мы провели анализ цитометрии потока, используя стратегию стробирования, показано на рисунке 3A. Мы обнаружили, что по сравнению с общей splenocytes, мы добились повышения обогащения CD11c+ клеток (рис. 3B). Мы использовали различные концентрации microbead CD11c для устранения производителя протокол на рисунке 4. После магнитной сепарации splenocytes, с использованием 100 мкл (рис. 4A), 200 мкл (Рисунок 4B), или 300 мкл (рис. 4C) CD11c микрошарики дает около 65%, 55% и 50% CD11c+ положительный клетки соответственно. Мы затем включена блокировка FcR (5 мкл/селезенки) + 100 мкл CD11c microbead, магнитным раздельный и нашли что блокада FcR дает примерно 65% CD11c клеток (рис. 4D). В дополнительные эксперименты мы инкубировали splenocytes в 100 мкл CD11c микрошарики и магнитные разделены через столбец LS. Мы затем инкубируют разделенных ячеек с дополнительные 100 мкл CD11c микрошарики и снова разделены через столбец LS. Двойная изоляция splenocytes принесли 92% CD11c+ клеток (рис. 4E).
Рисунок 1 : Иллюстрация приемных передачи в пробирке лечение CD11c + РС. CD11c+ DCs изолированы от селезенки мышей и покрытием в либо обычной соли или высокой соли СМИ за 24 ч. CD11c+ РСУ затем восприимчивую передаются ретро орбитально наивно получателей мышей. Осмотические minipump, вливая низкодозированные ангиотензин, который вживляется II и кровяное давление контролируется на 14 дней. Эта цифра приспособлен от Барбаро и др.) 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Эффект высоких соли лечить CD11c + РСУ на систолического артериального давления. Дендритные клетки были изолированы и культивировали в обычной соли (NS) или высокой соли (HS) для 48 ч. DCs были восприимчивую переданы наивно мышей дикого типа. Ang II minipumps (140 нг/мин) были имплантированы и кровяное давление контролируется радио телеметрии. Систолическое давление (СПР) измеряется радио телеметрии (среднее ± SEM). Эта цифра приспособлен от Барбаро et al.9пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Поток гранулярных анализ магнитно разлученных splenocytes. (A) стробирование стратегии, определение анализа CD11c + DC населения. Клетки отделяются от мусора и живые клетки выбираются на основе исключения Live/мертвые клетки пятно. Синглетно клетки выбрано и затем анализируется для CD45 позитивность. CD45 клетки затем анализируются для CD11c. (B) после магнитной сепарации, находится значительное обогащение CD11c + клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Поток гранулярных анализ магнитно раздельный CD11c+ splenocytes после протоколы разных изоляции. Клетки были отделены от мусора и живых клеток. Живые клетки были проанализированы на предмет-Ab и позитивности CD11c. (A) % CD11c+ клетки, следуя магнитной сепарации, которые были изолированы с 100 мкл, (B) 200 мкл, (C) 300 мкл микрошарики CD11c. (D) % CD11c+ клетки, следуя магнитной сепарации, которые были изолированы с блокадой FcR (анти FcR; 5 мкл) + 100 мкл CD11c микрошарики. (E) % CD11c+ клетки, следуя магнитной сепарации, которые были изолированы с двойной магнитный ячейку сортировку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В текущем протоколе, мы оптимизировали процедуры изолировать CD11c+ РС из селезенки мышей и восприимчивую перенести их в наивной животных для изучения роли контроллеров домена в Солт индуцированной гипертонии. Этот протокол может быть адаптирована для изоляции и восприимчивую передачи поднаборов другие иммунные клетки, макрофаги, моноцитов и адаптивной иммунных клеток, включая лимфоцитов T и B. Мы оптимизировали процесс переваривания селезенки для достижения адекватного ячейку выживания и стабильности DC поверхности выражение маркеров. Кроме того мы оптимизировали протокол в пробирке стимуляции мышиных РС с повышенными натрия для оптимального DC выживания.
Важным шагом в этом протоколе магнитные сортировки клеток. Магнитные ячейку Сортировка — это мощный и удобный инструмент для изоляции типы конкретных мышиных клеток для изучения функции иммунных клеток при болезни. Однако он основан на основных клеток поверхности выражение маркеров включая CD11c, которые часто выражаются на более чем один тип иммунных клеток и часто дает меньше, чем желательно определенных ячеек обогащения. Таким образом для приложений, требующих высокой специфичностью популяция клеток, может быть необходимо пятно с несколькими антител и сортировать по проточной цитометрии для ликвидации загрязнения клетки. Важно также подтвердить обогащения и чистоту изолированных клеток с помощью проточной цитометрии, как показано на рис. 3 и рис. 4. В текущем протоколе мы выполнили несколько неполадок, включая использование различных концентраций CD11c бусы, блокада FcR и применяя вторую магнитные ячейку Сортировка протокол для изолированных клеток. Мы обнаружили, что двойной магнитный ячейку Сортировка достичь высшей степени CD11c+ клетки чистоты.
Еще один важный шаг в понимании функций изолированных DCs-в пробирке стимуляции с высоким солью и культуры. Хотя мы найти, что это активирует DCs заставляет их предрасположенность мышей к гипертонии,9 в пробирке стимуляции и культуры могут вызывать гибель клеток и ввести другие условия, которые потенциально могут мешать результатов исследований. Кроме того чтобы получить достаточно жизнеспособной DCs, может быть необходимо бассейн селезенки нескольких мышей для получения одной успешной передачи приемным. Для устранения потенциального воздействия артефакт ex vivo культивирования клеток, может быть необходимо восприимчивую передачи DCs, изолированные от высоких соли кормили мышей. В предыдущих исследованиях мы изолированы РСУ, которые стимулировали in vivo в мышей, infused с ангиотензина II и обнаружили, что эти премьер гипертонии получателей мышей. 14 в будущем исследования, мы можем стимулировать DCs в естественных условиях, с использованием соли индуцированной гипертонии, включая DOCA соли или L-имя/высокая соли и определить, если они активация Т-клеток и премьер гипертонии.
Еще одно ограничение этого протокола связано с технический аспект успешной передачи внутривенного приемных иммунных клеток. Инъекция в Вену ретро орбиталь РС может быть трудным и должно быть сделано высококвалифицированным хирургом. Кроме того восприимчивую передача РС может быть достигнуто путем инъекции Вену хвост, но это, как правило, проще в белом, когда по сравнению с черной мышей.
Несмотря на эти технические ограничения магнитные клеток сортировки и приемных передача РС является чрезвычайно мощный метод, который позволяет идентификации и характеризации функциональной роли контроллеров домена в кардио почечной болезни Штатах. Это важно для оценки приживления и самонаведения клеток в различных органах, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями после приемных передачи. В предыдущих исследованиях мы восприимчивую переведены DCs от мышей трансгенных для расширения Зеленый флуоресцирующий белок наивно получателей мышей. Затем мы выступали проточной цитометрии различных тканей в получателей мышей спустя десять дней и нашли, что эти клетки преимущественно накапливаются в селезенке получателей мышей и в меньшей степени в почках и аорты. Это было увеличено, если мышь доноров лечили ангиотензина II. Относительный приживления нормального против Солт лечение DCs и конкретных тканей сайты предстоит изучить.
В заключение мы имеем изложил и оптимизированы подробный и воспроизводимые протокол к магнитным отделить, восприимчивую передачи и оценки населения DC подачей cytometry. Этот протокол может применяться для других иммунных клеток населения (с некоторыми изменениями) и другие модели сердечно-сосудистых заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американская ассоциация сердца предоставляет POST290900 N.R.B., 17SDG33670829, экспериментальная и национальных институтов здравоохранения предоставить K01HL130497 а.к.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
References
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D.
- Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
- Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
- He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
- Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
- Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
- Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
- Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
- Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
- Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
- Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
- Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
- Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
- Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
- Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
- Harrison, D. G., et al.
- Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
- Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).
