Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere dendrittiske celler fra murine spleens av magnetiske celle sortering og påfølgende adopsjon overføring til naiv mus. Modell av høy-salt aktivert dendrittiske celler ble valgt til å forklare de trinnvise fremgangsmåtene adoptivforeldre overføring og flowcytometri.
Abstract
Overflødig salt inntak bidrar til betennelse og spiller en viktig rolle i utviklingen av hypertensjon. Vi fant tidligere at antigen-presentasjon dendrittiske celler (DCs) kan forstand opphøyet ekstracellulære natrium fører til aktivering av NADPH oksidase og dannelsen av isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter. Disse IsoLG-protein addukter reagerer med selv-proteiner og fremme en autoimmun-lignende tilstand og hypertensjon. Vi har utviklet og optimalisert state-of-the-art metoder for å studere DC funksjonen hypertensjon. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering, i vitro behandling med forhøyet natrium og adopsjon overføring av murine splenic CD11c+ celler i mottakerens mus å studere deres rolle i hypertensjon.
Introduction
Overflødig fôr salt er en stor risikofaktor for hypertensjon. 1 , 2 the American Heart Association anbefaler maksimalt 2300 milligram (mg) av natrium (Na+) per dag. mindre enn 10% av den amerikanske befolkningen observerer denne anbefalingen. 3 , 4 beskjeden reduksjoner i Na+ inntak senke blodtrykket og redusere de årlige nye tilfellene av koronar hjertesykdom og hjerneslag i USA med 20%. 5 et stort problem med overflødig salt forbruk er at 50% av befolkningen Hypertensiv viser salt-følsomhet, definert som en 10 mmHg økning i blodtrykket etter Na+ lasting eller et lignende fall i blodtrykket etter Na+ begrensning og diurese. 6 salt følsomhet også skjer i 25% av normotensive individer, og er en uavhengig prediktor for død og hjerte hendelser. 7 , 8 salt-sensing mekanismer i hypertensjon med nyrene har vært godt undersøkt. men tyder nyere studier på at immunceller kan forstand Na+. 9 , 10
Nyere bevis antyder at endringer i ekstra nyre Na+ håndtering kan føre til opphopning av Na+ i interstitium og fremme betennelse. 11 , 12 vårt laboratorium og andre har vist at celler av både medfødte og adaptive immunsystemet bidra til forverring av hypertensjon. 9 , 13 , 14 , 15 ulike Hypertensiv stimuli, inkludert angiotensin II, noradrenalin og salt årsaken makrofager, monocytter og T-lymfocytter å infiltrere nyrene og blodkar og fremme Na+ oppbevaring, vasokonstriksjon, blodtrykk høyde og end-orgel skade. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 i tidligere studier, fant vi at DCs samle isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter svar på ulike Hypertensiv stimuli inkludert angiotensin II og DOCA-salt hypertensjon. 14 IsoLGs er svært reaktive produkter av lipid peroxidation som raskt og covalently adduct å lysines på proteiner og deres akkumulering er knyttet til DC aktivisering. 14 vi har nylig etablert at opphøyet Na+ er en potent stimulans for IsoLG-protein adduct formasjon i Trouble DCs.9 Na+ inn i DCs er formidlet gjennom amilorid følsom transportører. Na+ deretter utvekslet for kalsium (Ca2 +) via den Na+/ca2 + exchanger. Ca2 + aktiverer protein kinase C (PKC) som aktiverer NADPH oksidase fører til økt superoxide (O2· -) og IsoLG-protein adduct formasjon. 9 adoptivforeldre overføring av salt-eksponerte DCs primtall hypertensjon svar på en sub eksplisitte eller dose av angiotensin II. 9
Identifikasjon av CD11c+ DCs fra vev er tidligere begrenset immunohistochemistry og RT PCR og isolering av DCs er begrenset til cellen sortering av flowcytometri. Selv om flyt cytometri celle sortering er en kraftig metode for isolering av immunceller, det er kostbar, tidkrevende, og fører til en lav avkastning på levedyktige cellers. Derfor vi har optimalisert en trinnvis protokoll for vev fordøyelsen, i vitro stimulering og adopsjon overføring av CD11c+ DCs å studere hypertensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt Universitys institusjonelle Animal Care og bruk komiteen har godkjent prosedyrene som er beskrevet her. Mus er plassert og stelt i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr (National Academies trykk. Revidert 2010).
1. isolering av Spleens fra mus
- Forbered 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin.
- Euthanize 10-12 uke-gamle C57bl/6 mannlige mus ved CO2 innånding. Spray brystet og sider av musen med 70% etanol. På venstre side, åpner du nøye huden og bukhulen å avsløre milten.
- Bruke liten tang, forsiktig flytte tarmen og lever på venstre side av musen, og fine saks forsiktig avgiftsdirektoratet milten.
Merk: Dette trinnet må gjøres veldig nøye som skader på mage-tarmkanalen kan indusere forurensning. - Plass hver forbrukeravgift milt i merket 15 mL konisk rør som inneholder 3 mL RPMI 1640 medium.
2. generasjon enkeltcelle suspensjoner fra Spleens
Merk: Milten enzymene i en enkeltcelle suspensjon ved å kombinere mekanisk dissosiasjon pluss enzymatisk fordøyelsen.
- Forberede milt fordøyelsen løsningen ved å legge collagenase D (1 mg/mL, 0.29 U/mg lyofiliserte) og DNase jeg (0,1 mg/mL) til forberedt RPMI 1640 medium (se trinn 1.1)
- Bruk tang til å overføre milten inn i et C-rør (dissosiasjon rør) som inneholder 3 mL milt fordøyelsen løsning.
-
Utføre mekanisk dissosiasjon bruker en semi-automatisert homogenizer i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett C røret til den semi-automatisert homogenizer, sikre at C røret er tett plassert på roterende armen. Når C røret er plassert, trykker på startknappen på semi-automatisert homogenizer kjøre milt 04.01 protokollen for 60 s.
Merk: Mekanisk dissosiasjon kan også utføres ved å plassere et 40 μm filter på en 50 mL konisk rør og forsiktig sliping milten gjennom filteret. Etter sliping milten, gjennom skyll 40 µm filteret med 10 mL av RPMI media.
- Sett C røret til den semi-automatisert homogenizer, sikre at C røret er tett plassert på roterende armen. Når C røret er plassert, trykker på startknappen på semi-automatisert homogenizer kjøre milt 04.01 protokollen for 60 s.
- Etter mekanisk dissosiasjon, ta tunnelbanen fra homogenizer og utføre enzymatisk fordøyelsen. Inkuber prøvene i 15 min på 37 ° C kontinuerlig rotasjon (20 rpm).
- Overføre løsningen av pipettering inn i et 50 mL konisk rør etter filtrering gjennom en 40 µm sil. Vask µm 40 silen med 10 mL Dulbecco's PBS (dPBS). Sentrifuge cellene på 300 x g i 10 min på 4 ° C.
- Sug opp nedbryting helt sentrifugering, og vaskes pellet av resuspending i 10 mL av dPBS. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C.
3. isolering av CD11c+ DCs fra Splenic enkeltcelle suspensjon
- Resuspend celle pellet i 5 mL av dPBS og antall celler ved hjelp av en hemocytometer og trypan blå eksklusjon.
- Pellets cellene av sentrifugering på 300 x g, i 10 minutter på 4 ° C.
- Sug opp nedbryting helt og resuspend pellets i 400 µL magnetisk aktivert celle-sortering (Mac) bufferen.
- Legg 100 µL av CD11c microbeads (se Tabell for materiale) per 1 x 108 celler.
- Vortex celle suspensjon og Inkuber i 10 minutter i kjøleskapet i 4 ° C.
- Legge til 10 mL Mac bufferen å vaske celler. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C.
- Sug opp nedbryting helt og resuspend i 500 µL Mac bufferen.
4. magnetiske separasjon av CD11c+ DCs
Merk: Magnetisk separasjon gjøres manuelt med magnetiske skilletegn (se Tabell for materiale) utstyrt med LS kolonner. Magnetisk separasjon kan også gjøres automatisk med en automatisert magnetiske skilletegn. (se Tabell for materiale).
- Plass kolonnen LS i magnetfeltet Mac skilletegn og en 15 mL konisk rør under hver kolonne å samle gjennomflytsenhet.
- Skyll kolonnen LS med 3 mL buffer.
- Plasser celle suspensjon på kolonnene LS og samle gjennomflytsenhet inneholder umerkede celler.
- Vask kolonnen LS med 3 mL Mac buffer samle umerkede cellene som passerer gjennom. Vask kolonnen LS 2 ganger.
- Fjern kolonnen LS fra magnetiske skilletegnet. Legg til 5 mL Mac bufferen til hver kolonne og umiddelbart skylle ut magnetisk merket cellene av fast stuper kolonnen LS i en ren 15 mL konisk rør.
Merk: Det er viktig å utføre en dobbel isolasjon av CD11c celler å få en høy renhetsgrad celle suspensjon. Derfor gjenta 3.1 gjennom 4.5. og referanse Figur 4 for renhet standarder. Dette trinnet forbedrer renheten av CD11c+ celler 90-95%. -
Bestemme CD11c+ DC tall på en hemocytometer med trypan blå eksklusjon. Fortynne celle prøven på en 1:1 fortynning i 0,4% trypan blå løsning.
Merk: ikke-levedyktige cellers vil bli farget blå, mens levedyktige cellers vil være unstained kvinne.- Dette nøye fylle en hemocytometer med 10 µL av cellen eksempel fortynning og ruge i 1 minutt.
- Telle celler i 4 ruter på 1 x 1 mm2 i kammeret som er lastet for å fastslå hvor levedyktig cellen.
5. i Vitro høy Salt behandling av CD11c+ DCs
- Forberede DC kultur medium ved å legge 10% FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin 500 mL 1640 RPMI.
- Forberede 10 x DC høy salt celle kultur medier (400 mM) ved veiing ut 1,17 g NaCl og plassere det i et sterilt 50 mL falcon rør. Legg til 50 mL steril DC celle kultur medier (forberedt i trinn 5.1) 50 mL falcon rør og vortex til NaCl i løsningen.
- Umiddelbart filtrere høy salt DC kultur media bruker vakuum filtrering gjennom en 0,2 μm i celle kultur hette.
- Sentrifuge hver celle suspensjon fra spleens 300 x g i 10 min på 4ºC. Resuspend hver celle pellet i DC kultur medier i en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL.
- Pipetter 900 μL (ca 1 x 106 celler) DC suspensjon i en 24-vel flat bunn Falcon plate. Tilsett 100 µL av høy salt DC kultur medier hver brønn for en siste natrium konsentrasjon av 190 mM. Merk platen og sted i en 37 ° C humified CO2 inkubator for 48 timer.
6. adoptivforeldre overføring av høyt saltinnhold behandlet CD11c+ DCs
- Etter i vitro stimulering for 48t humified fjerne platen fra 37 ° C CO2 inkubator.
- Pipetter celle kultur media opp og ned resuspend CD11c+ DCs. Pipette alle CD11c+ DC suspensjon i en tilsvarende merket 1.6 mL tube. Gjenta dette trinnet for hver enkelt godt belagt.
- Sentrifuge hver CD11c+ DC suspensjon på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Sug opp nedbryting. Resuspend DC pellets med 100 µL av sterile dPBS.
- Tegne DC suspensjon i 1 mL sprøyte utstyrt med en 27 G ½ tommers nål.
- Plasser naiv mannlige 10 uke-gamle C57bl/6 musene under 2% isoflurane å oppnå en stabil kirurgisk flyet. Kontrollere nivået av anestesi med mangel på pedal refleks. Når et stabilt kirurgisk fly er oppnådd, sakte og forsiktig Introduser nålen inn i retro-orbital rommet i en vinkel på ca 30°.
Merk: Skråkant 27 G nålen skal peke ned, unna øyet, å unngå okulær skade. - Sakte og jevnt injisere CD11c+ DC suspensjon (ca 1 x 106 celler). Når injeksjon er fullført, forsiktig fjerne nålen for retro-orbital plass å være bevisst å skade øyet.
Merk: Etter injeksjon, bør det være liten eller ingen blødning. Adopsjon overføring av CD11c+ DCs kan også utføres bruke en IV injeksjon (f.eks hale vene). Kontroll mus motta CD11c+ DCs som ble kultivert i vanlig salt media. - Fjern mus fra nesen kjegle og overvåke dem i ca 30 min under gjenoppretting etter anestesi.
7. forberedelse av 14 dagers lavdose Angiotensin II (140 ng/kg/min)
- Forberede angiotensin II bufferen ved å legge 500 μL 5 M NaCl og 300 μL av eddiksyre. Quantum Satis (QS) opp til 30 mL av deionisert H20.
- Oppløse angiotensin II til 5 mg/mL lager løsning med angiotensin II buffer. Fortynne angiotensin II lagerløsning med ekstra buffer for å oppnå en siste konsentrasjon slik at den osmotisk minipump leverer angiotensin II i en hastighet på 140 ng/kg/min etter kroppsvekten til hver musen.
Merk: Viktig Angiotensin II (mg) = (mus vekt (g) x 0,2 mg / dag x 14 dager) / 1000
Forberedt Angiotensin II (mg) = (viktig angiotensin II x 260 µL) / pumpe rate (0,25 μL/hr)
Angiotensin II lager volum (μL) = forberedt angiotensin II / lager konsentrasjon (5 mg/mL) x 1,000
Fortynne volum (μL) = 270 - angiotensin II lager volum - Legge til angiotensin II lager volum i fortynne (angiotensin II buffer) basert på volumene beregnet i trinn 7.2.
- Under et sterilt celle kultur hood, åpne osmotisk minipump.
- Legg utvannet angiotensin II løsning og utvise noen luft fra sprøyten og nål. Medfølgende nålen inn i bunnen av den osmotisk minipump og sakte injisere angiotensin II løsning mens sakte og forsiktig trekke nålen fra blæren.
- Inn osmotisk minipump hodet osmotisk blæren fullt, betalende oppmerksomhet ikke får noen luft i blæren.
8. implantering av 14 dagers lavdose Angiotensin II osmotisk Minipumps
- Ti dager etter adoptivforeldre overføring av CD11c+ DCs, sted mus i en isoflurane kammer til å starte anestesi og deretter flytte mus til forpart kontinuerlig motta 2% isoflurane for å oppnå og opprettholde en passende kirurgisk fly.
- Fjerne pelsen langs dorsal side av halsen med avklipt å forberede kirurgiske området. Rengjør barbert området med 70% etanol etterfulgt av 7,5% betadine før starten av kirurgi.
- Lag et lite innsnitt (ca 1,5 cm) i huden. Hemostats inn snittet til å opprette en subcutaneous lomme for plassering av osmotisk minipump.
- Minipump inn i subcutaneous lommen. Nær huden sår med 2-3 kirurgisk stifter og bruke en annen anvendelse av 7,5% betadine såret og stifter å hindre infeksjon.
- Overvåke musene i 30-60 min under gjenoppretting etter anestesi før han returnerte dem til deres burene.
Merk: Mus trenger å være overvåket opp til 3-4 dager etter implantasjon av osmotisk minipump.
9. isolasjon av Spleens av mottakeren mus for flyt Cytometric analyse
- Etter 14 dager med lav dose angiotensin II infusjon, isolere behandlet spleens fra mus mottar i vitro høyt saltinnhold DCs ved adopsjon. Følg de nøyaktige fremgangsmåten ovenfor (trinn 1 og 2).
10. overflate flekker
-
Overføre splenocytes som er resuspended i 1 x PBS i en polystyren FACS rør og sentrifuger 350 x g i 8 min på 4 ° C. Sug opp nedbryting etter sentrifugering. Vask to ganger med 1 mL av Mac Buffer og sentrifugering (350 x g, 8 min, 4 ° C).
- Del av splenocytes like i forskjellige polystyren FACS rør basert på antall flyt cytometric paneler ønsket.
- For å utføre den Live/Dead celle levedyktighet flekker, vask cellene med 1 x PBS og sentrifuger (350 x g, 8 min, 4 ° C). Resuspend i 1 mL 1 x PBS og legge 1 µL av en celle-levedyktighet flekker (se materialer tabell). Inkuber i 15 min på 4 ° C (kjøleskapet eller på is) dekket i folie å beskytte mot lyset.
- Under inkubasjonen celle levedyktighet flekken, forberede cocktail av antistoffer celleoverflaten farging i en passende mengde Mac Buffer.
- Vask cellene med 1 mL av Mac Buffer, sentrifuger (350 x g, 8 min, 4 ° C), og resuspend hver celle pellets med 100 µL av antistoffer cocktail. Inkuber beskyttet fra lys for 30 min på 4 ° C.
Merk: Hver flyt cytometri antistoffer er unikt, og det er svært nyttig og anbefales å bestemme den optimale mengden av antistoff nødvendig ved å utføre en dose titrering kurve for hver spesifikt antistoff. - Vask cellene to ganger med 1 mL av Mac buffer og resuspend splenocytes i en passende mengde Mac bufferen for flyt cytometric analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerer en skjematisk av beskrevet trinnene ovenfor. Isolert murine spleens sorteres for CD11c+ DCs magnetiske celle sortering og belagt i vanlig salt media (NS, 150 mmol NaCl) eller høy salt medier (HS, 190 mmol NaCl) for 48 h. CD11c+ DCs overføres deretter adoptively av retro-orbital injeksjon til naiv mottaker mus. Ti dager senere, er mus implantert med osmotisk minipumps for lav dose angiotensin II (140 ng/kg/min) infusjon i 14 dager. Under 14 dagers infusjon av angiotensin II registreres blodtrykk radiotelemetri eller hale benavslutninger plethysmography.
En typisk blodtrykk analysen er representert i figur 2 (endret fra Barbaro et al.9) etter adoptivforeldre overføring av DCs og osmotisk minipumps for lav dose angiotensin II infusjon er implantert. Av notatet, denne lav dose av angiotensin II (140 ng/kg/min) er en sub eksplisitte eller dose som ikke øker blodtrykket i en normal mus. Mus motta vanlig salt behandlet CD11c+ DCs (svart sirkler) opprettholde en normal blodtrykk under angiotensin II infusjonen, mens mus mottar høy salt behandlet CD11c+ DCs (røde sirkler) viser en økning i systolisk blodtrykk. Figur 2 viser at høye salt behandlet CD11c+ DCs førsteklasses hypertensjon svar på en sub eksplisitte eller dose av angiotensin II.
Å bestemme renheten av den isolerte CD11c+ celler, vi utført flyt cytometri analyse ved hjelp av en gating strategi illustrert i Figur 3A. Vi fant ut at sammenlignet med den totale splenocytes, vi oppnådd økt anriking av CD11c+ celler (Figur 3B). Vi benyttet ulike CD11c microbead konsentrasjoner Feilsøk produsentens protokoll i Figur 4. Etter magnetiske separasjon av splenocytes bruker 100 μL (Figur 4A), 200 μL (Figur 4B) eller 300 μL (Figur 4C) CD11c microbeads gir ca 65%, 55% og 50% av CD11c+ positive cellene henholdsvis. Vi inkludert en FcR blocker (5 μL/milt) + 100 μL CD11c microbead, Magnetisk skilt, og funnet at blokaden av FcR gir ca 65% CD11c positive celler (Figur 4D). Flere eksperimenter, vi ruges splenocytes i 100 μL CD11c microbeads og magnetiske skilt gjennom en LS-kolonne. Vi deretter ruges atskilt cellene med en ekstra 100 μL CD11c microbeads og igjen atskilt gjennom en LS-kolonne. Dobbel isolasjon av splenocytes ga 92% CD11c+ celler (Figur 4E).
Figur 1 : Illustrasjon av adopsjon overføring av i vitro behandlet CD11c + DCs. CD11c+ DCs er isolert fra spleens av mus og belagt i enten vanlig salt eller høy salt media for 24 h. CD11c+ DCs deretter adoptively overføres retro-orbitally til naiv mottaker mus. En osmotisk minipump infusjonen lavdose angiotensin II er implantert og blodtrykk overvåkes i 14 dager. Dette tallet er tilpasset fra Barbaro et al.) 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Effekten av høyt saltinnhold behandlet CD11c + DCs på systolisk blodtrykk. Dendrittiske celler ble isolert og kultivert i vanlig salt (NS) eller høye salt (HS) for 48 h. DCs overført adoptively til vill type naiv mus. Ang II minipumps (140 ng/min) ble implantert og blodtrykk overvåket av radiotelemetri. Systolisk blodtrykk (SBP) målt ved radiotelemetri (gjennomsnittlig ± SEM). Dette tallet er tilpasset fra Barbaro et al.9Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Flow cytometric analyse av Magnetisk skilt splenocytes. (A) Gating strategi definere analyse av CD11c + DC befolkningen. Cellene blir separert fra rusk og levende celler er valgt basert på utelukkelse av Live/Dead celle flekken. Singlet celler er merket, og deretter analysert for CD45 positivitet. CD45 celler, deretter analyseres for CD11c. (B) etter magnetiske separasjon, det er betydelig anriking av CD11c + celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Flow cytometric analyse av Magnetisk skilt CD11c+ splenocytes etter ulike isolasjon protokoller. Cellene ble skilt fra rusk og levende celler. Levende celler ble analysert for-Ab og CD11c positivitet. (A) % av CD11c+ celler etter magnetiske separasjon som ble isolert med 100 μL, (B) 200 µL, (C) 300 μL CD11c microbeads. (D) % av CD11c+ celler etter magnetiske separasjon som ble isolert med blokade av FcR (anti-FcR, 5 μL) + 100 μL CD11c microbeads. (E) % av CD11c+ celler etter magnetiske separasjon som ble isolert med dobbel magnetiske celle sortering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I gjeldende protokollen, vi har optimalisert prosedyrer for å isolere CD11c+ DCs fra spleens av mus og adoptively overføre dem i naiv dyr å studere rollen til DCs salt-indusert hypertensjon. Denne protokollen kan tilpasses å isolere og adoptively overføre andre immun celle undergrupper inkludert makrofager, monocytter og adaptive immunceller inkludert T- og B-lymfocytter. Vi har optimalisert splenic fordøyelsen prosessen for å oppnå tilstrekkelig celle overlevelse og stabilitet for DC overflaten uttrykk. Dessuten, vi har optimalisert protokollen for i vitro stimulering av murine DCs med forhøyet natrium for optimal DC overlevelse.
Et viktig skritt i denne protokollen er magnetisk celle sortering. Magnetisk celle sortering er et kraftig og praktisk verktøy for å finne bestemt murine celle for å studere immun celle-funksjonen i sykdommen. Men det er basert på grunnleggende celle overflaten uttrykk indikatorer inkludert CD11c som uttrykkes ofte på flere immun celle type og ofte gir en mindre enn ønskelig bestemt celle berikelse. Dermed for programmer krever en svært spesifikke populasjon av celler, kan det være nødvendig å flekker med flere antistoffer og sortere av flowcytometri å eliminere skadelige celler. Det er også viktig å bekrefte berikelse og renhet av isolerte celler ved hjelp av flowcytometri som vist i Figur 3 og Figur 4. Vi har utført flere feilsøkingstrinn inkludert bruk av ulike konsentrasjoner av CD11c perler, blokade av FcR, og bruke en andre magnetiske cellen sortering protokollen til isolerte cellene i gjeldende protokollen. Vi fant at doble magnetiske celle sortering oppnådd den høyeste graden av CD11c+ celle renhet.
Et viktig skritt i å forstå funksjonen av isolerte DCs er i vitro stimulering med høy salt og kultur. Mens vi finne at dette aktiverer DCs forårsaker dem til å disponere mus til hypertensjon,9 i vitro stimulering og kultur kan føre til celledød og introdusere andre forhold som kan forstyrre forskningsresultater. Videre for å få nok levedyktig DCs, kan det være nødvendig å bassenget spleens flere mus å få en vellykket adoptivforeldre overføring. For å eliminere potensielle gjenstand effekten av ex vivo dyrking av celler, kan det være nødvendig å overføre adoptively DCs isolert fra høy salt-matet mus. I tidligere studier, vi isolert DCs som har blitt stimulert i vivo i mus tilført angiotensin II og fant at disse førsteklasses hypertensjon i mottakerens mus. 14 i fremtiden studier, vi kan stimulere DCs i vivo bruke salt-indusert hypertensjon inkludert DOCA salt eller L-navn/høy salt og bestemme om de aktivere T celler og prime hypertensjon.
En annen begrensning av denne protokollen gjelder det tekniske aspektet av vellykket intravenøs adoptivforeldre overføring av immunceller. Retro-orbital blodåre injeksjon av DCs kan være vanskelig og bør utføres av høyt kvalifiserte kirurg. Eventuelt adoptively overføring av DCs kan oppnås gjennom halen blodåre injeksjon men dette pleier å være lettere i hvitt sammenlignet med svart mus.
Til tross for disse tekniske begrensninger er magnetiske celle sortering og adopsjon overføringen av DCs en ekstremt kraftfull teknikk som tillater identifikasjon og karakterisering av funksjonelle rolle DCs i cardio-nyre sykdom stater. Det er viktig å vurdere engraftment og homing celleområde i ulike organer knyttet til hjerte-og karsykdommer etter adoptivforeldre overføring. I tidligere studier overført vi adoptively DCs fra mus transgene for forbedret Green fluorescerende protein i naiv mottaker mus. Vi utførte flowcytometri av ulike vev i mottakerens mus ti dager senere og fant at disse cellene hovedsakelig akkumuleres i milten mottaker mus, og i mindre grad i nyre og aorta. Dette ble økt hvis giveren musen ble behandlet med angiotensin II. Den relative engraftment av normal versus salt-behandlet DCs og bestemt vev steder fortsatt må undersøkes.
I konklusjonen, har vi skissert og optimalisert en detaljert og reproduserbar protokoll for magnetisk skille adoptively overføre og vurdere DC bestander av flowcytometri. Denne protokollen kan brukes på andre immun celle populasjoner (med noen modifikasjoner) og andre modeller av hjerte-karsykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association gir POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. og National Institutes of Health gir K01HL130497 til AK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
References
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D.
- Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
- Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
- He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
- Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
- Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
- Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
- Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
- Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
- Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
- Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
- Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
- Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
- Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
- Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
- Harrison, D. G., et al.
- Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
- Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).
