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Immunology and Infection

अलगाव और उच्च नमक के दत्तक हस्तांतरण antigen-प्रस्तुत dendritic कोशिकाओं का इलाज किया

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

Summary

यहां, हम चुंबकीय सेल छंटाई और भोली चूहों में बाद में दत्तक हस्तांतरण द्वारा murine spleens भारी से द्रुमाकृतिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । उच्च नमक सक्रिय द्रुमाकृतिक कोशिकाओं के मॉडल दत्तक हस्तांतरण और प्रवाह cytometry के कदम दर कदम प्रक्रियाओं की व्याख्या करने के लिए चुना गया था ।

Abstract

अतिरिक्त आहार नमक का सेवन सूजन के लिए योगदान देता है और उच्च रक्तचाप के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमने पहले पाया है कि antigen-प्रस्तुत द्रुमाकृतिक कोशिकाओं (डीसीएस) को ऊंचा extracellular सोडियम nadph ऑक्सीडेस और isolevuglandin के गठन (isolg) के सक्रियण के लिए अग्रणी समझ सकते है-प्रोटीन अभिअभिज्ञान । इन isolg-प्रोटीन अभिनति आत्म प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया और एक autoimmune की तरह राज्य और उच्च रक्तचाप को बढ़ावा देने के । हम विकसित और उच्च रक्तचाप में डीसी समारोह का अध्ययन करने के लिए राज्य के अत्याधुनिक तरीकों को अनुकूलित किया है । यहाँ, हम अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, ऊंचा सोडियम के साथ विट्रो उपचार में, और उच्च रक्तचाप में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में मूरीन प्लीहा CD11c+ कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण.

Introduction

अतिरिक्त आहार नमक उच्च रक्तचाप के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है । 1 , 2 अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन की सिफारिश की एक अधिकतम २,३०० मिलीग्राम (मिलीग्राम) सोडियम की (ना+) प्रति दिन सेवन, तथापि; अमेरिका की जनसंख्या का 10% से कम इस सिफारिश का पालन करता है । 3 , ना में 4 मामूली कटौती+ सेवन कम रक्तचाप और कोरोनरी हृदय रोग और स्ट्रोक के वार्षिक नए मामलों में अमेरिका में 20% से कम । 5 अधिक नमक की खपत के साथ एक बड़ी समस्या यह है कि हाइपरटेंसिव जनसंख्या का ५०% नमक संवेदनशीलता दर्शाती है, रक्तचाप में 10 mmhg वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है ना+ लोड हो रहा है या रक्तचाप में एक समान ड्रॉप के बाद ना+ प्रतिबंध और डायर्सी । 6 नमक-संवेदनशीलता भी normotensive व्यक्तियों के 25% में होता है, और मौत और हृदय की घटनाओं का एक स्वतंत्र कारक है । 7 , 8 नमक-गुर्दे से जुड़े उच्च रक्तचाप में तंत्र संवेदन अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है; हालांकि, हाल के अध्ययनों से सुझाव है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं नहीं समझ+कर सकते हैं । 9 , 10

हाल के सबूत से पता चलता है कि अतिरिक्त में परिवर्तन-गुर्दे ना+ हैंडलिंग का कारण हो सकता है na+ में interstitium में संचय और सूजन को बढ़ावा देने. 11 , 12 हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों ने दिखाया है कि सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली दोनों की कोशिकाएं उच्च रक्तचाप की तीव्रता में योगदान देती हैं । 9 , 13 , 14 , 15 विभिन्न उच्च रक्तचाप, एंजियोटेनसिन द्वितीय, norepinephrine सहित, और नमक कारण मैक्रोफेज, monocytes और टी लिम्फोसाइटों गुर्दे और vasculature घुसपैठ और ना को बढ़ावा देने के लिए+ प्रतिधारण, वाहिकासंकीर्णन, रक्तचाप ऊंचाई और अंत अंग क्षति । 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 पहले अध्ययनों में, हमने पाया है कि dcs जमा isolevuglandin (isolg)-प्रोटीन के जवाब में अभिरुधिता एंजियोटेनसिन द्वितीय और doca-नमक उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न हाइपरटेंसिव उत्तेजनों. 14 isolgs लिपिड peroxidation के उच्च प्रतिक्रियाशील उत्पादों रहे हैं कि तेजी से और covalently प्रोटीन पर lysines करने के लिए योगोत्पाद और उनके संचय डीसी सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है. 14 हमने हाल ही में यह स्थापित किया है कि ऊंचा ना+ एक शक्तिशाली उद्दीपन है जो मूर्तीने डीसीएस में प्रोटीन अधिवाहिनी गठन के लिए एक प्रबल उत्तेजना है ।9 ना+ डीसीएस में प्रवेश एमिलॉराइड संवेदनशील ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है । na + तो कैल्शियम के लिए विमर्श किया जाता है (ca2 +)na के माध्यम से +/ca2 + एक्सचेंजर । Ca2 + प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) को सक्रिय करता है जो नाडफ ऑक्सीडेस को बढ़ाकर सुपरऑक्साइड (ओ2·-) और आइसोग-प्रोटीन योगोत्पाद गठन के लिए अग्रणी सक्रिय करता है । नमक के 9 दत्तक स्थानांतरण-उजागर dcs primes उच्च रक्तचाप एंजियोटेनसिन द्वितीय के एक उप-pressor खुराक के जवाब में. 9

ऊतकों से CD11c+ dc की पहचान पहले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरटी-पीसीआर तक सीमित कर दी गई है, और डीसीएस के अलगाव को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल सॉर्टिंग तक सीमित कर दिया गया है । हालांकि प्रवाह cytometry सेल छंटाई प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, यह महंगा है, समय लेने वाली, और व्यवहार्य कोशिकाओं की एक कम उपज की ओर जाता है । इसलिए, हम ऊतक पाचन के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम अनुकूलित किया है, विट्रो उत्तेजना में, और CD11c+ dcs के दत्तक हस्तांतरण उच्च रक्तचाप का अध्ययन करने के लिए.

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Protocol

वेंडरबिल्ट यूनिवर्सिटी के इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ने यहां बताई गई प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी है । चूहों घर और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार के लिए परवाह कर रहे हैं (राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस. संशोधित २०१०) ।

1. चूहों से spleens का अलगाव

  1. तैयार १६४० rpmi: 10% fbs, ०.१० मिमी hepes, 1 मिमी सोडियम pyruvate, ५० μm β-mercaptoइथेनॉल और 1% penicillin/
  2. euthanize 10 – 12 सप्ताह पुराने C57bl/6 पुरुष चूहों द्वारा सह2 साँस लेना. छाती और ७०% इथेनॉल के साथ माउस के पक्षों स्प्रे । बाईं ओर, ध्यान से त्वचा को खोलने और पेरिटोनियल गुहा तिल्ली बेनकाब करने के लिए.
  3. छोटे forceps का उपयोग करना, सावधानी से आंतों और जिगर माउस के बाईं ओर ले जाएँ, और ठीक कैंची का उपयोग धीरे तिल्ली आबकारी.
    नोट: यह कदम बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए के रूप में जठरांत्र संबंधी मार्ग को नुकसान संदूषण पैदा कर सकते हैं ।
  4. लेबल 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब rpmi १६४० मध्यम की 3 मिलीलीटर युक्त में प्रत्येक excised प्लीहा प्लेस ।

2. spleens से एकल सेल निलंबन की पीढ़ी

नोट: तिल्ली यांत्रिक वियोजन प्लस एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन के द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन में वियोजित किया जा सकता है ।

  1. कोलेज़नेस डी (1 mg/ml; ०.२९ U/mg lyophilized) और dnase I (०.१ mg/ml) से तैयार करने के द्वारा प्लीहा पाचन समाधान तैयार करें rpmi १६४० मध्यम (चरण १.१ देखें)
  2. तिल्ली को एक सी ट्यूब (डिसोसियेशन ट्यूब) में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें जिसमें 3 मिलीलीटर प्लीहा पाचन समाधान होता है ।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अर्द्ध स्वचालित homogenizer का उपयोग यांत्रिक वियोजन प्रदर्शन ।
    1. सी ट्यूब अर्द्ध स्वचालित homogenizer पर प्लेस, यह सुनिश्चित करना है कि सी ट्यूब कसकर घूर्णन हाथ पर रखा है । एक बार सी ट्यूब रखा जाता है, के लिए तिल्ली ०४.०१ प्रोटोकॉल चलाने के लिए अर्द्ध स्वचालित homogenizer पर प्रारंभ बटन दबाएँ ६० s.
      नोट: यांत्रिक वियोजन भी एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के शीर्ष पर एक ४० μm फ़िल्टर रखकर किया जा सकता है और धीरे फिल्टर के माध्यम से प्लीहा पीस । तिल्ली पीसने के बाद, rpmi मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ ४० μm फिल्टर कुल्ला के माध्यम से ।
  4. यांत्रिक वियोजन के बाद, homogenizer से ट्यूब अलग और एंजाइमी पाचन प्रदर्शन । सतत रोटेशन (20 rpm) के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूनों को सेते हैं ।
  5. एक ४० μm छलनी के माध्यम से छानने के बाद एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में pipetting द्वारा समाधान स्थानांतरण । डलबेको के पीबीएस (dpbs) के 10 मिलीलीटर के साथ ४० μm छलनी धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रिप ।
  6. अपकेंद्रीकरण के बाद, सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से महाप्राण और पेलेट को dpbs के 10 मिलीलीटर में resuspending द्वारा धोने । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका ।

3. प्लीहा एकल सेल निलंबन से CD11c+ dcs के अलगाव

  1. dpbs के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और एक hemocytometer और trypan नीला बहिष्करण का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
  2. कोशिकाओं को ३०० एक्स जीपर अपकेंद्रण करके, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पेलेट करें ।
  3. महाप्राण पूरी तरह से और resuspend गोली चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई (एमएसीएस) बफर के ४०० μl में ।
  4. जोड़ें १०० μl के CD11c microbeads ( तालिका देखें सामग्री) प्रति 1 x 108 कोशिकाओं ।
  5. भंवर सेल निलंबन और 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में 10 मिनट के लिए सेते ।
  6. कोशिकाओं को धोने के लिए एमएसीएस बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका ।
  7. महाप्राण को पूरी तरह से और macs बफर के ५०० μl में resuspend के aspirate ।

4. CD11c+ dcs के चुंबकीय जुदाई

नोट: चुंबकीय जुदाई एक चुंबकीय विभाजक के साथ मैंयुअल रूप से किया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) LS कॉलम के साथ outfitted । चुंबकीय जुदाई भी स्वचालित रूप से एक स्वचालित चुंबकीय विभाजक के साथ किया जा सकता है । ( सामग्री तालिकादेखें) ।

  1. फ्लो-थ्रू इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक कॉलम के तहत एमएसीएस विभाजक और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के चुंबकीय क्षेत्र में एलएस कॉलम रखें ।
  2. 3 मिलीलीटर बफ़र के साथ LS स्तंभ कुल्ला ।
  3. प्रत्येक LS स्तंभ पर कक्ष निलंबन रखें और लेबल किए गए कक्षों वाले प्रवाह को एकत्रित करें ।
  4. macs बफ़र के 3 मिलीलीटर के साथ एलएस कॉलम को धोएं जो कि अलेबल किए गए कक्षों को एकत्रित करता है । LS स्तंभ 2 अधिक बार धो लें ।
  5. LS स्तंभ को चुंबकीय विभाजक से निकालें । प्रत्येक कॉलम में एमएसीएस बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत एक साफ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एलएस कॉलम को मजबूती से आगे बढ़ कर चुंबकपूर्वक लेबल वाले कोशिकाओं को फ्लश करें ।
    नोट: यह एक उच्च शुद्धता सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए CD11c कोशिकाओं के एक डबल अलगाव प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, ४.५ के माध्यम से ३.१ चरणों को दोहराएं । और शुद्धता मानकों के लिए संदर्भ चित्रा 4 । यह चरण 90-95% करने के लिए CD11c+ कोशिकाओं की शुद्धता में सुधार.
  6. trypan नीला बहिष्करण का उपयोग कर एक hemocytometer पर CD11c+ डीसी संख्या का निर्धारण. ०.४% trypan ब्लू समाधान में एक 1:1 कमजोर पड़ने पर सेल नमूना पतला ।
    नोट:     गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं नीले दाग हो जाएगा, जबकि व्यवहार्य कोशिकाओं unstained रहेगा ।
    1. ऐसा करने के लिए, ध्यान से सेल नमूना कमजोर पड़ने के 10 μl और 1 मिनट के लिए सेते के साथ एक hemocytometer भरें ।
    2. कक्ष में 1 x 1 मिमी2 के 4 वर्गों में कोशिकाओं की गणना करें जो व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित करने के लिए लोड किया गया है ।

5. CD11c+ dcs के विट्रो उच्च नमक उपचार में

  1. 10% fbs, ०.१ मिमी hepes, 1 मिमी सोडियम pyruvate, ५० μm β-mercaptoइथेनॉल और 1% penicillin/स्ट्रेप्टोमाइसिन को ५०० मिलीलीटर १६४० rpmi जोड़कर डीसी संस्कृति माध्यम तैयार करें ।
  2. 10x डीसी उच्च नमक सेल संस्कृति मीडिया (४०० मिमी) के बाहर वजन से तैयार १.१७ जी nacl और यह एक बाँझ ५० मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में रखकर । nacl समाधान में जब तक ५० मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और भंवर करने के लिए (चरण ५.१ में तैयार) बाँझ डीसी सेल संस्कृति मीडिया के ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. तुरंत एक सेल संस्कृति हुड में एक ०.२ μm फिल्टर के माध्यम से वैक्यूम निस्पंदन का उपयोग कर उच्च नमक डीसी संस्कृति मीडिया फ़िल्टर ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर spleens भारी से प्रत्येक सेल निलंबन centrifuge 1 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता में डीसी संस्कृति मीडिया में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend/
  5. एक 24-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे फाल्कन थाली में डीसी निलंबन के pipette ९०० μl (लगभग 1 x 106 कोशिकाओं) । १९० मिमी के एक अंतिम सोडियम एकाग्रता के लिए एक अच्छी तरह से उच्च नमक डीसी संस्कृति मीडिया के १०० μl जोड़ें । थाली और एक ३७ डिग्री सेल्सियस humified सह2 इनकूबेटर में ४८ एच के लिए जगह लेबल ।

6. उच्च नमक इलाज CD11c+ dcs के दत्तक स्थानांतरण

  1. ४८ एच के लिए विट्रो उत्तेजना में बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस ह्यूमिफाइड सह2 इनकूबेटर से थाली को हटा दें ।
  2. pipette सेल संस्कृति मीडिया ऊपर और नीचे CD11c+ dcs resuspend करने के लिए । पिपेट सभी CD11c+ डीसी निलंबन एक इसी लेबल १.६ मिलीलीटर ट्यूब में । प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से चढ़ाया के लिए इस कदम को दोहराएं ।
  3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिप प्रत्येक CD11c+ डीसी निलंबन । महाप्राण । बाँझ dpbs के १०० μl के साथ डीसी गोली resuspend ।
  4. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में एक 27 ग्राम 1/2 इंच सुई के साथ सुसज्जित डीसी निलंबन ड्रा ।
  5. एक स्थिर शल्य विमान को प्राप्त करने के लिए 2% आइसोफ्लूराने के तहत भोले पुरुष 10 सप्ताह पुराने C57bl/ पेडल पलटा की कमी के साथ संज्ञाहरण के स्तर की जाँच करें. एक बार एक स्थिर शल्य विमान हासिल की है, धीरे और ध्यान से लगभग 30 डिग्री के कोण पर रेट्रो कक्षीय अंतरिक्ष में सुई परिचय ।
    नोट: 27 ग्राम सुई का बेवल नीचे की ओर इशारा करते हुए, आंख से दूर होना चाहिए, नेत्र क्षति को रोकने के लिए ।
  6. धीरे और आसानी से CD11c+ डीसी निलंबन (लगभग 1 x 106 कोशिकाओं) सुई । इंजेक्शन पूरा होने के बाद, ध्यान से आंख को नुकसान नहीं करने के लिए सचेत किया जा रहा रेट्रो कक्षीय अंतरिक्ष के लिए सुई को हटा दें ।
    नोट: इंजेक्शन के बाद, वहाँ कम या कोई रक्तस्राव होना चाहिए । CD11c+ dcs के दत्तक स्थानांतरण भी इंजेक्शन की एक i.v. विधि (जैसे पूंछ नस) का उपयोग किया जा सकता है । नियंत्रण चूहों CD11c+ dcs है कि सामांय नमक मीडिया में सुसंस्कृत थे प्राप्त करते हैं ।
  7. नाक शंकु से चूहों निकालें और संज्ञाहरण से वसूली के दौरान लगभग 30 मिनट के लिए उन्हें निगरानी.

7.14 दिन कम खुराक एंजियोटेनसिन द्वितीय की तैयारी (१४० एनजी/

  1. 5 मीटर nacl के ५०० μl और एसिटिक एसिड के ३०० μl जोड़कर एंजियोटेनसिन II बफर तैयार करें । क्वांटम satis (QS) अप करने के लिए 30 मिलीलीटर के विआयनीकृत एच20.
  2. एंजियोटेनसिन द्वितीय बफर के साथ 5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान के लिए एंजिओटेंसिन द्वितीय को भंग करें । पतला एंजियोटेनसिन द्वितीय स्टॉक समाधान अतिरिक्त बफर के साथ एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए ऐसी है कि परासरणी minipump के एक दर में एंजियोटेनसिन द्वितीय उद्धार होगा १४० एनजी/किलोग्राम/मिनट प्रत्येक माउस के शरीर के वजन के अनुसार ।
    नोट: आवश्यक एंजियोटेनसिन द्वितीय (एमजी) = (माउस वजन (जी) एक्स ०.२ मिलीग्राम/दिन x 14 दिन)/
    तैयार एंजियोटेनसिन द्वितीय (एमजी) = (आवश्यक एंजियोटेनसिन द्वितीय एक्स २६० μl)/पम्प दर (०.२५ μl/
    एंजियोटेनसिन ii स्टॉक वॉल्यूम (μl) = तैयार एंजियोटेनसिन ii/स्टॉक एकाग्रता (5 मिलीग्राम/एमएल) एक्स १,०००
    तनु आयतन (μl) = २७०-एंजियोटेंसिन द्वितीय स्टॉक वॉल्यूम
  3. पतला करने के लिए एंजियोटेनसिन द्वितीय स्टॉक वॉल्यूम जोड़ें (एंजियोटेनसिन द्वितीय बफर) चरण ७.२ में गणना की मात्रा के आधार पर.
  4. एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के तहत, ओस्मोटिक minipump खुला.
  5. पतला एंजियोटेनसिन द्वितीय समाधान जोड़ें और सिरिंज और सुई से किसी भी हवा को निष्कासित । परासरणी minipump के तल में आपूर्ति की सुई डालें और धीरे धीरे और ध्यान से मूत्राशय से सुई मुकर रही जबकि एंजियोटेनसिन द्वितीय समाधान सुई.
  6. ऑस्मोटिक मूत्राशय में परासरणी मिनीपंप सिर को पूरी तरह से डालें, ध्यान दें कि मूत्राशय में कोई हवा नहीं मिलती है ।

8.14 दिन कम खुराक एंजियोटेनसिन द्वितीय osmotic miniपम्पों का रोपण

  1. दस दिनों के CD11c+ dcs के दत्तक स्थानांतरण के बाद, एक आइसोफ्लूरेन चैंबर में जगह चूहों संज्ञाहरण आरंभ करने के लिए और फिर लगातार 2% आइसोफ्लूरेन प्राप्त करने के लिए और एक उपयुक्त शल्य विमान बनाए रखने के लिए चूहों नाक कोन करने के लिए ले जाएँ.
  2. क्लिपर्स के साथ गर्दन के पृष्ठीय पक्ष के साथ फर निकालें सर्जिकल साइट तैयार करने के लिए. ७०% इथेनॉल के साथ शेव्ड क्षेत्र को साफ करें जिसके बाद सर्जरी की शुरुआत से पहले ७.५% betadine है ।
  3. त्वचा में एक छोटा सा चीरा (लगभग १.५ सेमी) बनाएं । ओस्मोटिक minipump की नियुक्ति के लिए एक चमड़े के नीचे जेब बनाने के लिए चीरा में hemostats डालें ।
  4. चमड़े के नीचे की जेब में minipump डालें । 2-3 सर्जिकल स्टेपल के साथ त्वचा घाव बंद करें और संक्रमण को रोकने के लिए घाव और स्टेपल के लिए ७.५% betadine का एक और आवेदन लागू करें ।
  5. 30 के लिए चूहों की निगरानी-60 मिनट संज्ञाहरण से वसूली के दौरान उन्हें अपने पिंजरों के लिए लौटने से पहले.
    नोट: चूहों को परासरणी मिनीपंप के प्रत्यारोपण के बाद 3-4 दिनों तक निगरानी करने की आवश्यकता है ।

9. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए प्राप्तकर्ता चूहों के spleens का अलगाव

  1. कम खुराक एंजियोटेनसिन द्वितीय आसव के 14 दिनों के बाद, विट्रो उच्च नमक में प्राप्त चूहों से अलग spleens भारी दत्तक स्थानांतरण द्वारा dcs इलाज किया । ऊपर सूचीबद्ध सटीक चरणों का पालन करें (चरण 1 और 2).

10. सतह धुंधला

  1. स्थानांतरण splenocytes कि एक polystyrene facs ट्यूब में 1x pbs में सस्पेंड और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए ३५० एक्स जी पर अपकेंद्रिका. अपकेंद्रीकरण के बाद महाप्राण । एमएसीएस बफर और अपकेंद्रीकरण (३५० एक्स जी, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं ।
    1. splenocytes समान रूप से अलग polystyrene facs ट्यूबों प्रवाह cytometric पैनलों वांछित की संख्या के आधार पर विभाजित ।
  2. जीवित/मृत कोशिका व्यवहार्यता धुंधला करने के लिए, 1x पीबीएस और सेंट्रेसेज (३५० एक्स जी, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ कोशिकाओं को धोएं । 1x pbs के 1 मिलीलीटर में resuspend और एक सेल-व्यवहार्यता दाग के 1 μl जोड़ें (सामग्री तालिका देखें) । 4 डिग्री सेल्सियस (फ्रिज या बर्फ पर) में 15 मिनट के लिए सेते प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में शामिल किया गया ।
  3. सेल व्यवहार्यता दाग की ऊष्मायन के दौरान, macs बफर की एक उचित मात्रा में धुंधला कोशिका सतह के लिए एंटीबॉडी की कॉकटेल तैयार करते हैं ।
  4. macs बफर की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें, अपकेंद्रिका (३५० एक्स जी, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस), और एंटीबॉडी कॉकटेल के १०० μl के साथ प्रत्येक कोशिका गोली resuspend । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित सेते ।
    नोट: प्रत्येक प्रवाह cytometry एंटीबॉडी अद्वितीय है, और यह अत्यधिक उपयोगी है और प्रत्येक विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए एक खुराक टाइट्रेट वक्र प्रदर्शन द्वारा आवश्यक एंटीबॉडी की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है ।
  5. दो बार कोशिकाओं macs बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धो और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एमएसीएस बफर की एक उचित मात्रा में splenocytes resuspend ।

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Representative Results

चित्रा 1 ऊपर वर्णित चरणों की एक योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व करता है. पृथक मुरीन spleens भारी चुंबकीय सेल छंटाई द्वारा CD11c+ dcs के लिए हल कर रहे है और या तो सामांय नमक मीडिया (एन एस; १५० mmol nacl) या उच्च नमक मीडिया (HS; १९० mmol nacl) के लिए ४८ h. CD11c+ dcs में चढ़ाया फिर adoptively रेट्रो कक्षीय द्वारा हस्तांतरित कर रहे है भोले प्राप्तकर्ता चूहों को इंजेक्शन । दस दिन बाद, चूहों कम खुराक एंजियोटेनसिन द्वितीय के लिए परासरणी miniपम्पों के साथ प्रत्यारोपित कर रहे हैं (१४० एनजी/ एंजियोटेनसिन द्वितीय के 14 दिन के जलसेक के दौरान, रक्तचाप रेडियो टेलीमेट्री या पूंछ कफ plethysmography द्वारा दर्ज की गई है ।

एक ठेठ रक्तचाप विश्लेषण चित्रा 2 में प्रतिनिधित्व किया है (बारबारो एट अल से संशोधित9) dcs और परासरणी कम खुराक एंजियोटेनसिन द्वितीय अर्क के लिए miniपम्पों के दत्तक हस्तांतरण के बाद प्रत्यारोपित कर रहे हैं । नोट के, एंजियोटेनसिन द्वितीय की यह कम खुराक (१४० एनजी/किग्रा/मिनट) एक उप रक्तदाबवर्धक खुराक है कि एक सामांय माउस में रक्तचाप में वृद्धि नहीं करता है । सामान्य नमक प्राप्त चूहों का इलाज किया CD11c+ dcs (काले घेरे) एंजियोटेनसिन द्वितीय जलसेक के दौरान एक सामान्य रक्तचाप बनाए रखने, जबकि उच्च नमक का इलाज CD11c+ dcs (लाल हलकों) प्राप्त चूहों सिस्टोलिक रक्तचाप में वृद्धि का प्रदर्शन. चित्रा 2 दिखाता है कि उच्च नमक CD11c+ dcs प्रधानमंत्री उच्च रक्तचाप एंजियोटेनसिन द्वितीय के एक उप रक्तदाबवर्धक खुराक के जवाब में इलाज किया ।

पृथक CD11c+ कोशिकाओं की शुद्धता का निर्धारण करने के लिए, हम एक gating रणनीति चित्रा 3एमें सचित्र का उपयोग कर प्रवाह cytometry विश्लेषण किया । हमने पाया है कि कुल splenocytes की तुलना में, हम CD11c+ कोशिकाओं की वृद्धि हुई संवर्धन प्राप्त (चित्रा 3बी). हम चित्रा 4में निर्माता के प्रोटोकॉल का निवारण करने के लिए अलग CD11c microbead सांद्रता का उपयोग किया । १०० μl का उपयोग कर splenocytes के चुंबकीय जुदाई के बाद (चित्रा 4ए), २०० μl (चित्रा 4बी), या ३०० μl (चित्रा 4सी) CD11c microbeads की पैदावार के बारे में ६५%, ५५%, और ५०% के CD11c+ सकारात्मक कोशिकाओं को क्रमशः । हम फिर शामिल एक fcr अवरोधक (5 μl/प्लीहा) + १०० μl of CD11c microbead, चुंबकीयत से अलग है, और पाया कि नाकाबंदी की fcr लगभग ६५% CD11c सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 4घ) । अतिरिक्त प्रयोगों में, हम १०० μl CD11c microbeads और एक एलएस कॉलम के माध्यम से अलग चुंबकीय में splenocytes incubated । हम तो CD11c microbeads के एक अतिरिक्त १०० μl के साथ अलग कोशिकाओं incubated और फिर एक रास कॉलम के माध्यम से अलग । ९२% CD11c+ कोशिकाओं (चित्रा 4ई) के झुकेंगे splenocytes के दोहरे अलगाव.

Figure 1
चित्रा 1 : में विट्रो का दत्तक स्थानांतरण का चित्रण CD11c इलाज + dc. CD11c+ dcs चूहों के spleens भारी से अलग है और 24 एच CD11c+ dcs के लिए या तो सामांय नमक या उच्च नमक मीडिया में चढ़ाया जाता है तो adoptively भोले प्राप्तकर्ता चूहों में रेट्रो-ऑर्कोदी हस्तांतरित कर रहे हैं । एक पराश्रयी मिनीपंप जो कम खुराक एंजियोटेंसिन II को प्रत्यारोपित करते हैं और रक्तचाप 14 दिनों के लिए निगरानी की जाती है । यह आंकड़ा बारबारो एट अल से अनुकूलित है.) 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : उच्च नमक के प्रभाव का इलाज CD11c + सिस्टोलिक रक्तचाप पर डीसीएस । dendritic कोशिकाओं को अलग किया गया और सामान्य नमक में सुसंस्कृत (एन एस) या उच्च नमक (एच एस) ४८ के लिए एच. डीसीएस adoptively जंगली प्रकार भोले चूहों को हस्तांतरित किया गया. आंग द्वितीय minipumps (१४० एनजी/प्रत्यारोपित और रक्त दबाव रेडियो telemetry द्वारा निगरानी की गई । सिस्टोलिक रक्तचाप (एसबीपी) रेडियो टेलीमेट्री (माध्य ± SEM) द्वारा मापा जाता है । यह आंकड़ा barbaro एट अल से अनुकूलित है ।9कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : चुंबकीय अलग splenocytes के प्रवाह cytometric विश्लेषण. (क) CD11c + डीसी जनसंख्या का विश्लेषण परिभाषित रणनीति Gating । कोशिकाओं को मलबे से अलग किया जाता है और जीवित कोशिकाओं को जीवित/मृत कोशिका दाग के बहिष्करण के आधार पर चुना जाता है । सिंगलेट कोशिकाओं का चयन किया जाता है और फिर CD45 सकारात्मकता के लिए विश्लेषण किया जाता है । CD45 कोशिकाओं को फिर CD11c के लिए विश्लेषण कर रहे हैं । (ख) चुंबकीय जुदाई के बाद, वहाँ CD11c + कोशिकाओं के महत्वपूर्ण संवर्धन है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : विभिन्न अलगाव प्रोटोकॉल के बाद चुंबकीय अलग CD11c+ splenocytes के प्रवाह cytometric विश्लेषण. कोशिकाओं को मलबे और जीवित कोशिकाओं से अलग किया गया । लाइव कोशिकाओं मैं अटल बिहारी और CD11c सकारात्मकता के लिए विश्लेषण किया गया । (क) चुंबकीय पृथक्करण के पश्चात् CD11c़ कोशिकाओं का%, जो १०० μl के साथ पृथक थे (इ) २०० μl, (ग) ३०० μl CD11c माइक्रोमोड्स का । (घ) चुंबकीय पृथक्करण के बाद CD11c+ कोशिकाओं का% जो कि fcr (एंटी-एफसीआर; 5 μl) + १०० μl CD11c माइक्रोमोड्स की नाकाबंदी के साथ पृथक थे । (ई) चुंबकीय जुदाई है कि डबल चुंबकीय सेल छंटाई के साथ अलग थे निंनलिखित CD11c+ कोशिकाओं का% । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम CD11c+ dcs चूहों की spleens भारी से अलग करने के लिए प्रक्रियाओं को अनुकूलित किया है और adoptively नमक प्रेरित उच्च रक्तचाप में dcs की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उन्हें भोले जानवरों में स्थानांतरित. इस प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और adoptively मैक्रोफेज, monocytes सहित अन्य प्रतिरक्षा सेल सबसेट हस्तांतरण, और टी और बी लिम्फोसाइटों सहित अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं. हम पर्याप्त सेल अस्तित्व और डीसी सतह अभिव्यक्ति मार्कर की स्थिरता को प्राप्त करने के लिए प्लीहा पाचन प्रक्रिया अनुकूलित किया है । इसके अलावा, हम इष्टतम डीसी अस्तित्व के लिए ऊंचा सोडियम के साथ murine dcs के विट्रो उत्तेजना में के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है ।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम चुंबकीय सेल छंटाई है । चुंबकीय सेल छँटाई एक शक्तिशाली और सुविधाजनक उपकरण रोग में प्रतिरक्षा कोशिका समारोह का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट murine सेल प्रकार को अलग करने के लिए है. हालांकि, यह CD11c है कि अक्सर एक से अधिक प्रतिरक्षा सेल प्रकार पर व्यक्त कर रहे है और अक्सर एक से कम वांछनीय विशिष्ट सेल संवर्धन की पैदावार सहित बुनियादी सेल सतह अभिव्यक्ति मार्कर पर आधारित है । इस प्रकार, कोशिकाओं की एक अत्यधिक विशिष्ट जनसंख्या की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए, यह कई एंटीबॉडी के साथ दाग और contaminating कोशिकाओं को खत्म करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा सॉर्ट करने के लिए आवश्यक हो सकता है । चित्रा 3 और चित्रा 4में दर्शाए अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके पृथक कोशिकाओं की समृद्ध और शुद्धता की पुष्टि करना भी महत्वपूर्ण है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम कई CD11c मोती, fcr की नाकाबंदी के विभिंन सांद्रता का उपयोग करें, और अलग कोशिकाओं के लिए एक दूसरा चुंबकीय सेल छंटाई प्रोटोकॉल लागू करने सहित समस्या निवारण चरणों का प्रदर्शन किया है । हमने पाया है कि डबल चुंबकीय सेल छंटाई CD11c+ सेल शुद्धता के उच्चतम डिग्री हासिल की ।

अलग dcs के समारोह को समझने में एक और महत्वपूर्ण कदम उच्च नमक और संस्कृति के साथ विट्रो उत्तेजना में है । जब तक हम पाते है कि यह डीसीएस उंहें उच्च रक्तचाप के लिए चूहों संभावना अधिक होती का कारण बनता है,9 विट्रो उत्तेजना और संस्कृति में सेल मौत का कारण बन सकता है और अंय शर्तों कि संभावित अनुसंधान निष्कर्षों के साथ हस्तक्षेप कर सकते है परिचय । इसके अलावा, पर्याप्त व्यवहार्य dcs प्राप्त करने के लिए, यह एक सफल दत्तक हस्तांतरण प्राप्त करने के लिए कई चूहों के पूल spleens भारी करने के लिए आवश्यक हो सकता है. कोशिकाओं की पूर्व vivo संवर्धन के संभावित विरूपण साक्ष्य प्रभाव को खत्म करने के लिए, यह उच्च नमक खिलाया चूहों से अलग dcs स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. पूर्व अध्ययनों में, हम डीसीएस कि विवो में एंजियोटेनसिन द्वितीय के साथ संचार चूहों में प्रेरित किया गया है अलग और पाया कि प्राप्तकर्ता चूहों में इन प्रमुख उच्च रक्तचाप. 14 भविष्य के अध्ययनों में, हम vivo में dcs को प्रोत्साहित कर सकते हैं, जिसमें doca नमक या L-NAME/उच्च नमक सहित नमक-प्रेरित हाइपरटेंशन का उपयोग करना और यह निर्धारित करना कि क्या वे टी कोशिकाओं और प्राइम हाइपरटेंशन को सक्रिय करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सफल अंतःशिरा दत्तक हस्तांतरण के तकनीकी पहलू से संबंधित है । रेट्रो-कक्षीय की नस इंजेक्शन मुश्किल हो सकता है और एक उच्च प्रशिक्षित सर्जन द्वारा किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, dcs के adoptively स्थानांतरण पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह सफेद में आसान हो जाता है जब काले चूहों की तुलना में.

इन तकनीकी सीमाओं के बावजूद, चुंबकीय सेल छंटाई और dcs के दत्तक स्थानांतरण एक अत्यंत शक्तिशाली तकनीक है कि पहचान और हृदय रोग में dcs के कार्यात्मक भूमिका के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है-गुर्दे की बीमारी राज्यों । दत्तक हस्तांतरण के बाद हृदय रोग से संबंधित विभिन्न अंगों में कोशिकाओं की engraftment और अभिलक्ष्यन का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है । पिछले अध्ययनों में, हम adoptively अनुभवहीन प्राप्तकर्ता चूहों में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए चूहों ट्रांसजेनिक से dcs हस्तांतरित. हम तो दस दिन बाद प्राप्तकर्ता चूहों में विभिन्न ऊतकों के प्रवाह cytometry प्रदर्शन किया और पाया कि इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से प्राप्तकर्ता चूहों की तिल्ली में जमा है, और गुर्दे और aorta में एक हद तक कम करने के लिए. यह बढ़ गया था अगर दाता माउस एंजियोटेनसिन द्वितीय के साथ इलाज किया गया था । सामान्य बनाम नमक-उपचारित डीसीएस और विशिष्ट ऊतक साइटों की सापेक्ष engraftment अभी भी जांच करने की जरूरत है ।

अंत में, हम रेखांकित और चुंबकीय अलग, adoptively हस्तांतरण, और प्रवाह cytometry द्वारा डीसी आबादी का आकलन करने के लिए एक विस्तृत और reproducible प्रोटोकॉल अनुकूलित है । इस प्रोटोकॉल अंय प्रतिरक्षा सेल आबादी के लिए लागू किया जा सकता है (कुछ संशोधनों के साथ) और हृदय रोग के अंय मॉडलों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन POST290900 अनुदान द्वारा समर्थित था n.r.b., 17sdg33670829 l.x. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों के लिए K01HL130497 मुख़र्जी

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४५ सूजन दत्तक स्थानांतरण dendritic सेल अलगाव dendritic कोशिकाओं उच्च रक्तचाप प्रतिरक्षा सेल छंटाई cytometry प्रवाह
अलगाव और उच्च नमक के दत्तक हस्तांतरण antigen-प्रस्तुत dendritic कोशिकाओं का इलाज किया
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Van Beusecum, J. P., Xiao, L.,… More

Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

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