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Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59128
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3, 1
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

Le protocole décrit une méthode reproductible, conçue pour être utilisé avec les surnageants de culture de cellules pour détecter des épitopes de surface sur petites vésicules extracellulaires (EV). Il utilise l’immunoprécipitation de EV spécifique à l’aide de billes couplées avec des anticorps qui reconnaissent l’antigène de surface CD9, CD63 et CD81. La méthode est optimisée pour l’analyse en cytométrie en flux en aval.

Abstract

Cytométrie en flux (FC) est la méthode de choix pour la mesure semi-quantitative des marqueurs de l’antigène de surface de la cellule. Récemment, cette technique a été utilisée pour des analyses phénotypiques des vésicules extracellulaires (EV) y compris les exosomes (Exo) dans le sang périphérique et d’autres liquides organiques. La petite taille des EV exige l’utilisation d’instruments consacrés ayant un seuil de détection autour de 50-100 nm. Par ailleurs, EV peut être lié à des microbilles de latex qui peuvent être détectées par le FC. Microbilles, conjugué avec des anticorps qui reconnaissent les EV associées aux marqueurs/Cluster de différenciation CD63 et CD9 CD81 peut être utilisé pour la capture de l’EV. Exo isolée du CM peut être analysée avec ou sans pré enrichissement par ultracentrifugation. Cette approche consiste aux analyses de EV en utilisant les instruments conventionnels de FC. Nos résultats démontrent une corrélation linéaire entre les valeurs d’intensité de Fluorescence signifie (IFM) et de la concentration de l’EV. Perturbant EV par sonication considérablement diminué MFI, indiquant que la méthode ne détecte pas de débris de la membrane. Nous rapportons une méthode précise et fiable pour l’analyse des antigènes de surface EV, qui peut être facilement implémenté dans n’importe quel laboratoire.

Introduction

Les cellules sécrètent des vésicules extracellulaires (EV) de différentes tailles, y compris des microvésicules (MV) et les exosomes (Exo). Ce dernier se distingue de MV par taille et par le compartiment subcellulaire d’origine. MV (200 – 1 000 nm de taille) sont libérés de cellules mères en projetant de la membrane plasmique. À l’inverse, Exo (30 à 150 nm) proviennent de membranes endosomale et sont libérés dans l’espace extracellulaire lorsque les corps multivésiculaires (MVB) fusionnent avec la membrane cellulaire1,2.

EV sont de plus en plus utilisés comme biomarqueurs diagnostiques ainsi que, éventuellement, des outils thérapeutiques dans de nombreux domaines, y compris l’oncologie, neurologie, cardiologie et maladies musculo-squelettiques3,4,5. Une grande majorité des études en cours à l’aide de EV comme agents thérapeutiques exploitent l’isolement des vésicules de cellule conditionnée moyen (CM) des cellules cultivées in vitro. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) exercent des effets bénéfiques dans plusieurs contextes, et dérivé de MSC EV ont montré des avantages dans les modèles d’ischémie/reperfusion myocardique blessures6 et cerveau blessure7. Dérivé de MSC EV présentent également des activités modulateurs immunitaires qui peuvent être exploitées pour traiter le rejet immunitaire, comme l’a démontré dans un modèle de réfractaires à la thérapie graft - versus - host disease8. Les cellules souches fluides amniotiques (hAFS) enrichir activement CM avec MVs et Exo, hétérogène dans la taille (50 – 1 000 nm), qui véhiculent plusieurs effets biologiques, tels que la prolifération de cellules différenciées, angiogenèse, inhibition de la fibrose, et cardioprotection4. Nous avons récemment démontré que EV et particulièrement Exo, sécrétée par les cellules progénitrices de dérivés cardiaque humaine (Exo-CPC) réduisent la taille de l’infarctus du myocarde rats5,9.

Exo partager un ensemble commun de protéines sur leur surface, y compris tetraspanins (CD63, CD81, CD9) et le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (MHC-I). En plus de cet ensemble commun de protéines, Exo contiennent également des protéines spécifiques pour le sous-ensemble de EV du type producteur. Exo marqueurs gagnent une importance primordiale car ils jouent un rôle crucial dans la communication inter cellulaire, donc réglementer de nombreux processus biologiques5,10. En raison de leur petite taille, trouver un moyen facile d’analyser les EV à l’aide de classique écoulement cytometry (FC) reste une tâche difficile.

Nous présentons ici un protocole simplifié d’analyse EV à l’aide de FC, qui peut être appliqué aux préenrichi échantillons obtenus par ultracentrifugation ou directement au CM (Figure 1). La méthode utilise des perles recouverts d’un anticorps spécifique qui lie canoniques épitopes surfaces Exo-associés (CD63, CD9, CD81) sans nouveaux lavages. FC analyses peuvent être effectuées à l’aide d’un cytomètre classique sans avoir besoin d’ajustements avant mesures. Méthodes de caractérisation des antigènes sur chaque petites particules à l’aide des cytomètres ont été décrites par d’autres groupes en ce qui concerne les diverses applications11,12,13. Ici, nous avons utilisé des billes magnétiques pour la capture de petites particules et Exo, suivie de phénotypage des particules capturées par le FC. Bien que cette méthode peut être utilisée pour caractériser la composition antigénique de petites vésicules publié par n’importe quel type de cellules in vitro, nous avons fourni ici les conditions de culture de cellules spécifiques qui s’appliquent pour la culture des progéniteurs cardiaques humaines (CPC) et le plus environnement approprié pour la production de EV par ces cellules.

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Protocol

1. collecte et traitement des milieux conditionnés

  1. Manteau 55 cm2 boîtes de pétri avec de la gélatine porcine peau 0,02 % dans du PBS.
  2. CPC (8 000/cm2) dans les plats revêtus sur plaque avec 7 mL de Dulbecco modifiée de Iscove Medium (IMDM) additionné de 20 % SVF (sérum de veau fœtal) et 1 % la pénicilline/streptomycine (P/S).
    Remarque : Le terme « CPC » fait référence aux cellules humaines explant dérivé qui ont été décrites ailleurs14. CM peut être prélevé sur différents types de cellules cultivées dans des conditions de culture spécifique. Porter des gants et travailler sous une hotte biologique.
  3. Une fois que les cellules atteignent sur confluence de 80 %, enlevez le milieu de culture, laver deux fois avec de Dulbecco PBS (PBS) Ca et Mg-exempt de cellules et remplacez-le avec 10 mL de milieu sans sérum, Exo-production (de l’aigle de la modification de Dulbecco moyen [DMEM] taux de glycémie élevé, 4,5 g/mL).
    Remarque : Procéder à une diminution progressive de la concentration sérique en milieu de culture, d’adapter progressivement les cellules à condition sans sérum (SF). Pour les cellules qui sont sensibles au milieu sans sérum préparer un milieu contenant FBS mais appauvris en EV. Préparer le milieu supplémenté avec tous les éléments nutritifs, ainsi que 10 à 20 % (v/v) de SVF. Centrifuger le milieu du jour au lendemain à 100 000 × g, 4 ° C. Sachez que cette procédure ne garantit pas 100 % élimination des dérivés de FBS EV.
  4. Après 7 jours, recueillir le CM dans un tubes à centrifuger en polypropylène.
    Remarque : Le temps pour climatisation moyenne dépend du type de cellule. Pour les cellules qui sont sensibles au milieu sans sérum, augmenter le volume initial du milieu et de réduire le temps pour la collecte de CM à 24-48 h.
  5. Effacer les CM de débris cellulaires par centrifugation à 3 000 x g pendant 20 min à 4 – 10 ° C. Récupérer le surnageant dans un tube de filtre à centrifuger 100 kDa.
  6. Concentré d’effacé CM en faisant tourner le tube à 2 000 x g pendant 20 min à 4 – 10 ° C.
    Remarque : Cette étape permettra de réduire le volume initial de CM permettant l’utilisation de petits tubes pour des mesures haute vitesse centrifuge et contribuera à éliminer les agrégats de la petite protéine.
  7. Recueillir le concentré dans un tube de microcentrifuge. Centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min à 4 – 10 ° C.
  8. Recueillir le liquide surnageant et passez à la section 2 (enrichissement EV). Si une ultracentrifugeuse n’est pas disponible, passez directement à la section 3 (quantification de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)).
    Remarque : Pré-enrichissement de fraction EV améliore la lecture finale en intensité de fluorescence (voir résultats représentatifs et Figure 4). Défrichée CM (du point 1.8) peut être stocké à 4 ° C pour ne plus puis 1-2 jours ou, subsidiairement à −80 ° C pendant plusieurs mois. 5 CM doit être préapprouvé d’enlever tous les débris cellulaires avant leur stockage à-80 ° C afin d’assurer que les débris de taille exosome est formé pas dans le processus de gel-dégel.

2. extracellulaire vésicules enrichissement par ultracentrifugation (facultative)

  1. Placez le surnageant à l’étape 1.8 dans un tube en polycarbonate ultracentrifugeuse à paroi épaisse. Remplir le tube avec 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS), jusqu'à atteindre la capacité maximale (3,2 mL).
  2. Charger les échantillons dans un rotor à angle fixe titane (8 x 3,2 mL, facteur k-13). Charger le rotor dans une ultracentrifugeuse sur table. Ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 3 h à 4 – 10 ° C.
  3. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 100 µL de solution 1 PBS x.

3. nanoparticules Tracking Analysis (NTA) Quantification

  1. Diluer 1 µL de l’échantillon (à partir de chaque étape 2.3 ou 1,8) en 999 µL de PBS 1 x. Charger l’échantillon dans une seringue de 1 mL, évitant la formation de bulles. Charger la seringue dans l’orifice d’entrée de la salle d’examen.
  2. Allumer l’appareil. Ouvrir la caméra avec la touche de Capture . Ajuster la mise au point.
  3. Enregistrer au moins 3 différentes images de 60 s chaque.
  4. Analyser les 3 acquisitions différentes à l’aide de l’option de Traitement par lots dans le logiciel.
    Remarque : Si la technologie d’annulation n’est pas disponible, effectuer un dosage de la protéine par l’analyse de Bradford (1 x 108 particules correspondent à 1 à 2 µg de protéine totale après ultracentrifugation ou à 50 – 60 µg de protéine totale si la quantification est effectuée directement pour CM comme Il comprend des contaminants de protéines différentes de EV ; voir tableau 1)5.

4. préparation de l’échantillon

  1. Préparer un pool de 3 types de perles de capture (CD9 perles, billes de CD63 et CD81 perles à un 1 : ratio 1:1 ; voir Table des matières) et vortex.
    Remarque : La piscine a été testée pour être stable pendant 1 mois. Un seul type de capturer les perles peut-être être utilisé, ce qui permet la détection des sous-populations EV pas distinguées avec piscine de perles. En utilisant un antigène unique capture perles, il sera possible de contemporain démontrent la présence de protéines de tétraspanines, comme la CD9, CD81 ou CD63, et l’antigène d’intérêt détectés par immunofluorescence. Billes de latex autre aldéhyde-sulfate sont également disponibles dans le commerce. Ces perles présentent une surface hydrophobe pour l’adsorption de MV et EV.
  2. Dans un tube à fond rond, ajouter la quantité de volume correspondant à 1 x 108 particules plus 1 µL de la piscine de perle, correspondant à 1,2 × 105 perles au total (pour chaque épreuve).
  3. Préparer un tube contenant 1 µL de perles sans EV qui servira de témoin négatif, ci-après comme les « Perles ».
  4. Réglez le volume à 100 µL avec 1 x PBS. Placer le tube dans un thermo-table de mixage et l’agiter à 400 tr/min pendant la nuit à 4 – 10 ° C.
  5. Le lendemain, passer les échantillons à une plaque à 96 puits fond rond (ou FC tubes).
  6. Ajoutez l’anticorps (10 µg/mL de CD9_FITC, 10 µg/mL de CD63_PE et de 5 µg/mL de CD81_PE).
  7. Incuber 1 h à 4 – 10 ° C.
  8. Ajouter 100 µL de solution 1 PBS x dans chaque puits.
  9. Procéder à l’acquisition.

5. acquisition

  1. Ouvrez le logiciel d’acquisition et de commencer l’instrument (cytomètre > programme de démarrage de système). Ouvrez une nouvelle expérience.
  2. Créer un modèle expérimental, puis sélectionner et ensuite Ajouter plaque . Sélectionnez la position des échantillons sur la plaque et puis appuyez sur Définir comme échantillon dans la coupelle.
  3. Entrez le nom de l’échantillon (c'est-à-dire CPC #1_CD9FITC) dans les Règles de nommage. Ouvrez l’onglet canaux et allumez la FITC et canaux de PE.
  4. Charger la plaque dans l’instrument.
  5. Appuyez sur Parcelle de Dot et créer une nouvelle parcelle de dot (P1). Mettre avant zone de dispersion (FSC-A) par rapport à Side Scatter-zone (SSC-A).
  6. Sélectionnez initialiser pour commencer le laser et la fluidique. Appuyez sur acquérir pour lancer l’acquisition.
  7. Ajustez l’échelle pour montrer à la population au milieu de la P1. Dans P1, dessiner la porte de « Perles » autour de l’ensemble de la population (à l’exclusion des débris) (Figure 2 a). Appuyez sur arrêter.
  8. Appuyez sur Parcelle de Dot et créer une nouvelle parcelle de dot (P2). Mettre Forward Scatter-hauteur (FSC-H) par rapport à FSC.-a. Porte le nouveau tracé de la dot sur « Perles ». Dans P2 tracer une nouvelle porte autour de la plus grande population et nommez-le « Maillots de corps » (Figure 2 a).
    Remarque : Cette stratégie est conçue afin d’éviter autant que possible l’inclusion des agrégats de perles dans les étapes d’acquisition et d’analyse.
  9. Appuyez sur Dot Plot et créer deux parcelles différentes dot ; un FITC et SSC-A et un PE versus SSC-A. Porte le nouveau tracé de la dot sur « Maillots de corps. »
  10. Sélectionnez le nombre d' événements à enregistrer (par exemple, 20 000). Sélectionnez enregistrement et commencer l’expérience.

6. analyse de données

  1. Charger les fichiers d’acquisition dans le logiciel d’analyse.
    Remarque : Les étapes suivantes doivent être appliquées à chaque échantillon, y compris les perles seulement et chaque échantillon inconnu.
  2. Ouvrir un nouveau protocole et créer des emplacements de points suivant la même stratégie décrite à l’étape 5.
  3. Définissez tous les axes de dispersion à l’échelle linéaire et tous les axes de fluorescence se connecter échelle.
  4. Afficher la moyenne géométrique de Fluorescence (X-Gmean-IFM) à canaux FITC et PE.
  5. Calculer le rapport X-Gsignifie des échantillons / X-Gsignifie des perles colorées avec des anticorps sans exosome.
  6. Comparer le changement de pli IMF de différentes préparations de EV.

7. extracellulaire vésicule numéro titrage

Remarque : Articles 7 à 10 peuvent être effectuées pour configurer le nombre de particules, la concentration d’anticorps et spécificité, mais peut être ignoré si le type de cellule, d'où EV sont dérivés, et les anticorps restent les mêmes.

  1. Diluer les particules, obtenus à l’étape 2.3, dans du PBS 1 x pour obtenir une série de suspensions allant de 5 x 10,5 à 2,5 x 108 particules.
  2. Pour chaque suspension ajouter dans un tube à fond rond 1 µL de piscine de perle de capture.
  3. Suivre le protocole de l’étape 4.3.

8. un titrage d’anticorps

Remarque : Titrage d’anticorps neutralisants est généralement réalisée en ajoutant un seul anticorps pour chaque tube.

  1. Le nombre d’EV (particules totales ou teneur en protéines) maintenir constante dans tous les échantillons.
    Remarque : Le nombre approprié est déterminé empiriquement comme décrit ci-dessus à l’article 7.
  2. Suivre le protocole de mesures 4.1 à 4.5.
  3. Tester une gamme de concentrations d’anticorps ci-dessus et ci-dessous le montant recommandé par le fournisseur. Par exemple, pour un anticorps avec une concentration suggérée de 10 µg/mL par test, test 1, 2, 5, 10, 20 et 50 µg/mL. Inclure un échantillon avec des « perles seulement », ajoutant la plus forte concentration d’anticorps.
  4. Incuber pendant 1 heure à 4 – 10 ° C.
  5. Ajouter 100 µL de solution de 1 PBS x pour chaque échantillon.
  6. Acquérir les échantillons.

9. temps d’incubation

  1. Vérifier le temps d’incubation effectuant des acquisitions à des moments différents (par exemple, 1 h, 2 h et 5 h).
  2. Suivre le protocole à partir de la section 4.
  3. Incuber les échantillons à 4 – 10 ° C pendant 1 h.
  4. Acquérir des échantillons.
  5. Incuber les échantillons à 4 – 10 ° C pendant 3 h.
  6. Acquérir des échantillons.

10. protocole Validation

  1. Liaison de EV
    1. Dans un tube à fond rond, ajouter la quantité de volume correspondant à 1 x 108 particules ou le montant correspondant des protéines totales.
    2. Réglez le volume à 100 µL avec 1 x PBS.
    3. Perturber la membrane EV par sonication (alternativement une étape de choc thermique peut être appliquée) conformément aux instructions du fabricant. Définissez la fréquence et l’intensité. La période de sonication peut être empiriquement établie définissant une expérience temporelle (c.-à-d., 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc..).
    4. Ajouter 1 µL de la piscine de perle.
    5. Suivre le protocole à partir de l’étape 4.4.
  2. Spécificité de l’anticorps
    1. Préparer un tube pour chaque fluorochrome conjugué IgG et ajouter le complexe de perles-EV comme indiqué au point 4.6.
      Remarque : L’Isotype fluorochrome-conjuguées doit correspondre avec les IgG de l’anticorps utilisé.

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Representative Results

Nombre total de particules pour une coloration unique

Puisqu’un seul cordon pouvez lier plusieurs particules, nous avons testé différentes conditions pour définir la plus petite quantité d’EV total (seul anticorps par tube) pour atteindre la phase exponentielle au début de la courbe de l’IFM. Une concentration fixe d’anticorps a été utilisée alors que le nombre total de particules varie de 5 x 10,5 et 2,5 x 108. Comme illustré à la Figure 3 a, le nombre de particules qui nous permet d’assurer que l’anticorps effectue au sein d’une IMF acceptable, en évitant l’utilisation d’un excès d’EV, est 1 x 108 particules/coloration.

Titrage d’anticorps

Nous avons choisi la bonne concentration d’anticorps résultant du signal plus élevé empêchant la liaison de l’anticorps non spécifiques. Ce test a été optimisé pour les particules de 1 x 108 , tel que déterminé dans le paramètre précédent. Anti-CD9_FITC anti-CD63_PE et anti-CD81_PE ont été testés avec des concentrations allant de 1 à 50 µg/mL (Figure 3 b). Anticorps anti-CD9_FITC et anti-CD63_PE a donné une bonne résolution de signal (7,5 et 130-fold changement d’IFM vs perles seul, respectivement) lorsqu’il est utilisé à une concentration de 10 µg/mL alors que la concentration choisie pour les anticorps anti-CD81_PE était de 5 µg/mL (465.3 fois Changement IFM).

Validation des méthodes

Afin de confirmer que notre méthode est appropriée analyser seulement vésicules extracellulaires « en forme de coupe » et pas des débris de membrane, nous avons appliqué les étapes différentes de la sonication, à 10 % de l’amplitude, à la solution contenant des particules. 100 µL de solution de PBS contenant des particules de 1 x 108 1 x subit des étapes de sonication différents de 30 secondes à 5 minutes et la préparation en résultant contenant brisé et bien en forme EV ont été analysées comme décrit (protocole expérimental du point 3.3). par conséquent, nous avons trouvé que 30 secondes de la sonication diminuer IMF qui a été complètement jeté après 1 minute. À cette validant, aucune fluorescence n’est détectable pour aucun des marqueurs EV (Figure 3D).

Flow cytometry caractérisation des exosomes HEK293 et CPC-dérivés

Ces résultats ont été générés selon le protocole présenté ci-dessus avec la méthode d’isolement ultracentrifugeuse. Les exosomes isolés sont quantifiés par technologie LNT et chargés du jour au lendemain avec 1 µL de perles mélangées (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 x anti-CD81). Le complexes perles + Exo ont été coloré avec la quantité appropriée d’anticorps anti-CD9_FITC anti-CD63_PE et anti-CD81_PE (Figure 3EF et tableau 2).

En outre, en utilisant EV-CPC, nous avons comparé analyse FC avec ou sans pré enrichissement par ultracentrifugation. La figure 4 montre que les deux méthodes ne conviennent pas aux marqueurs de surface profil Exo. Pré-enrichissement de fraction extracellulaire vésicules améliore considérablement l’intensité de la fluorescence surtout pour CD63_PE et CD81_PE coloration (Figure 4 et tableau 3).

Figure 1
Figure 1 : protocole et NTA parcelles. (A) représentation schématique du protocole expérimental. (B) représentant NTA terrains à étape médias conditionnés, ultracentrifugeuse pré et post ultracentrifugeuse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : analyse de données et Acquisition. (A) écoulement cytometry analyse commence par créer une première barrière à l’ensemble perles population « perles » (à l’exclusion des débris) et ensuite une deuxième porte pour distinguer les événements « maillots de corps ». Maillots de corps sont bloqués sur un terrain mis en place avec FSC-H comme axe des abscisses et FSC-A comme axe des ordonnées. (B-D) Point représentatif emplacements montrant le décalage vers la droite de l’intensité de fluorescence pour les populations positives de perles-exosomes complexes (verte, CD9 + ; rouge CD63 + ; brun CD81 +). Contrôle d’isotype (violet) se chevauchent négatifs perles de couleur grises. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Courbes de titrage pour le nombre de particules (les flèches indiquent la quantité sélectionnée de particules, 1 x 10-8). (A) les concentrations d’anticorps (les flèches indiquent la concentration choisie pour chacun utilise des anticorps). Concentration (B), à la fois nombre de particules et d’anticorps sont complot contre l’intensité de la fluorescence moyenne (IFM). (C) la courbe montrant 3 acquisition différente de la préparation avec 1 à 2 h ou 5 h d’incubation des anticorps. (D) courbe indiquant la diminution de fluorescence après sonication à différents moments. (E-F) Plier le changement (moyenne ± écart type) d’IFM pour CD9, CD63 et CD81 vs témoin négatif (perles + anticorps, aucun EV) sont indiqués pour HEK293 EV (n = 3 répétitions indépendantes) et pour CPC EV (n = 3 lignes de cellules primaires de 3 différents patients) s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : IFM analyse et la comparaison entre deux procédures : EV-liaison directe avec perles (Isolation des perles de Capture) et pré-enrichissement avec ultracentrifugeuse (isolement ultracentrifugeuse). Les données apparaissent comme plier changement (moyenne ± écart type) d’IFM pour CD9 (A) et (B) CD63 CD81 (C) vs témoin négatif (perles + anticorps, aucun EV). N = 3 lignes de cellules primaires de 3 différents patients. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

CPC CONC NTA (partie/µL) CONC (µg/µL)
CPC #1 ultracentrifugeuse pre 5.02E + 06 2.01
CPC #1 ultracentrifugeuse après 6.10E + 07 1.04
CPC #2 ultracentrifugeuse pre 5.74E + 06 2.30
CPC #2 après ultracentrifugation 7.43E + 07 0,79
CPC #3 ultracentrifugeuse pre 2.02E + 06 1.90
CPC n ° 3 après ultracentrifugation 2.91E + 07 0,42

Tableau 1 : Comparaison entre la concentration de protéine pour les 3 autre patient et NTA dérivés CPC avant et après ultracentrifugation.

PLIER LE CHANGEMENT DE MFI ± SD CD9 CD63 CD81
HEK293 24.44 ± 19.17 430,7 ± 344,9 535,2 ± 410.3
CPC #1 14,15 ± 3,72 236.05 ± 43,40 353.30 ± 452.43
CPC #2 15.76 ± 1,87 983.06 ± 195.63 374.45 ± 108,05
CPC #3 8,94 ± 7.19 830.50 ± 184.73 60.05 ± 23,18

Tableau 2 : Valeur du pli changement (moyenne ± écart type) d’IFM pour HEK293 EV (n = 3 répétitions indépendantes) et CPC EV (n = 3 lignes de cellules primaires de 3 différents patients).

PLIER LE CHANGEMENT DE MFI ± SD CD9 CD63 CD81
Perles d’isolement de capture 2.96 ± 1,45 65.65 ± 18,87 21.85 ± 6.12
Ultracentrifugeuse isolement 7.47 ± 2.71 236.00 ± 25.06 65.05 ± 13,38

Tableau 3 : Valeur du pli changement de MFI (moyenne ± écart type) pour CPC EV (n = 3 lignes de cellules primaires de 3 différents patients) isolées par des perles de capture ou ultracentrifugeuse.

Tableau 4 : Cahier des charges unique.

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Discussion

Technique classique de FC reste la plus simple méthode analytique pour caractériser des marqueurs exprimés à la surface de l’EV. À cet égard, sélectionner le protocole plus approprié est essentiel pour obtenir des informations utiles sur des fractions de particules individuelles d’intérêt en évitant les limites en raison de la sensibilité de l’instrument. Nous avons décrit une méthode qui utilise des particules magnétiques, couplés avec des anticorps qui reconnaissent les Exo et les antigènes de surface EV petits qui conviennent à l’application en aval de FC. Nous avons validé la méthode à l’aide de deux types de cellules différentes : primaire CPC humaine qui sont en train de devenir une source de grandes cellules pour Exo-base des approches thérapeutiques pour les maladies cardiaques ; et les cellules HEK293, une lignée de cellules immortalisées largement utilisée dans la recherche en biologie cellulaire en raison de la plasticité et la croissance cellulaire fiables.

La méthode peut être appliquée à EV ultracentrifugeuse enrichi et, pour une analyse plus rapide, aussi directement sur in vitro culture cellulaire CM avec aucun préenrichissement par ultracentrifugation. Le produit de départ est essentiel lorsque l'on compare les échantillons. Ajout capture perles directement à la CM permettra d’accélérer la procédure, mais en même temps diminuer l’intensité de fluorescence, comme illustré à la Figure 4 a. Il est aussi essentiel d’utiliser une quantité appropriée de PBS pour mélanger les perles et EV pendant l’étape de « capture » 4.4. Lorsque vous utilisez un temps d’incubation constante, un augmentation du volume diminuera intensité de fluorescence en raison de l’inefficacité EV couplage.

Une limitation du protocole est qu’une seule capture perle pouvez lier plusieurs particules EV/Exo sur sa surface. Vous limiterez ainsi la possibilité d’identifier les sous-ensembles de EV exprimant une combinaison particulière d’antigènes en utilisant une coloration multiple. Méthode de la perle donne donc des données semi-quantitatives. À l’aide de perles transportant un seul Ab capture (CD9, CD63 ou CD81) permettra au maximum à la caractérisation des particules qui expriment deux épitopes : celui présent sur le talon et reconnu par l’anticorps de capture et celle détectée par l’anticorps qui est par la suite ajouté.

L’étalon-or actuel pour l’Exo des analyses à l’aide de FC est un protocole développé par van der Vlist et coll. en 201215. Il permet une analyse à haute résolution de EV en utilisant une configuration optimisée du FC haut de gamme disponible dans le commerce (p. ex., apport de BD). Ce protocole est extrêmement détaillée et utile mais reste un cadre matériel complexe avec étalonnage spécifique de FC avant utilisation. Trois ans plus tard, Pospichalova et coll.16 proposé un protocole simplifié pour FC analyse des Exo en utilisant un cytomètre dédié spécifiquement développé pour l’analyse des petites particules (par exemple, Apogee A50 Micro)17. En ce qui concerne le présent protocole et d’autres qui ont utilisé le paramètre de seuil spécial11, ici nous vous proposons un protocole de base pour effectuer des petite phénotypage EV à l’aide de perles de fixation magnétique qui est adapté aux instruments conventionnels de FC et ne nécessite aucun réglage particulier. Différents protocoles ont décrit des méthodes axées sur la perle afin de caractériser les petit EV trouvé dans les fluides corporels par FC12. Ici, nous montrons l’immunocapture de sous-populations discrètes de vésicules positif pour CD9 CD63 et CD81 qui sont couramment utilisés comme marqueurs de Exo18. Aldéhyde-sulfate latex19,20 et polystyrène12perles restent une alternative valable pour la liaison de EV présent en CM et fluide du plasma sanguin ; Toutefois, groupes aldéhyde exposés à la surface de la particule de polymère permettent le couplage des protéines non spécifiques et autres matériaux pour les particules de latex, augmentant ainsi le risque de contamination par des organismes lipoprotéines ou apoptotique au cours de la détection et isolement processus de21,22.

Perles utilisées dans le protocole lient EV seulement entière, bien en forme. Nous avons proposé de perturber la structure EV par sonication pour étancher le signal (section 4, « validation de protocole »). En effet, une minute de résultats de sonication dans l’intensité de la fluorescence diminuée, montrant ainsi qu’un signal positif ne peut être affecté par débris de membrane adsorbé sur des billes de.

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Disclosures

Rien à déclarer.

Acknowledgments

L.B. a bénéficié de subventions de recherche de Helmut Horten Stiftung et Velux Stiftung, Zurich (Suisse). G.V. a été soutenue par des subventions de recherche de Swiss National Science Foundation, la Fondation Cecilia-Augusta, Lugano et la SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suisse)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Gibco 12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa  Millipore UFC910024
CytoFlex, Flow Cytometer Platform Beckman Coulter CytoFlex
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red Gibco 21063045
Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free Lonza BE17-512F
ExoCap CD63 Capture Kit JSR Life Sciences Ex-C63-SP
ExoCap CD81 Capture Kit JSR Life Sciences Ex-C81-SP
ExoCap CD9 Capture Kit JSR Life Sciences Ex-C9-SP
Exosome-Depleted FBS Thermofisher A2720801
Exosome-depleted FBS Media Supplement SBI EXO-FBS-250A-1
FBS-Fetal Bovine Serum Gibco 10270106
FITC anti-human CD9 Antibody Biolegend 312104           RRID: AB_2075894
Flow Cytometer analysis software Beckman Coulter Kaluza
NanoSight LM10 Malvern NanoSight LM10
NanoSight Software Malvern NTA 2.3
Optima Max-XP Beckman Coulter 393315
PE anti-human CD63 Antibody Biolegend 353004           RRID:AB_10897809
PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody Biolegend 349505           RRID:AB_10642024
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Thermomixer C Eppendorf 5382 000 015
TLA-110 Beckman Coulter TLA-110 rotors

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References

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
  3. Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
  4. Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
  5. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  6. Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
  8. Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
  9. Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
  10. Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
  11. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  13. Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  14. Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
  16. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
  17. van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
  18. Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
  19. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  20. Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
  21. Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
  22. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).

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Numéro 144 exosomes microvésicules cytométrie en flux biologie exosomes perles de phénotypage conditionnés vésicules milieu extracellulaires
Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement
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Balbi, C., Bolis, S., Vassalli, G., Barile, L. Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media. J. Vis. Exp. (144), e59128, doi:10.3791/59128 (2019).

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